原位PCR检测培养细胞中的单拷贝SRY基因

采用原位ＰＣＲ方法在培养的人小肠癌转移腹水细胞系（ＨＩＣＭＡ）中进行了人Ｙ染色体上单拷贝ＳＲＹ基因的原位扩增，并以ＰＣＲ方法制备的地高辛标记物探针原位检测了所扩增的片段，比较研究表明，原位ＰＣＲ法较之直接的原位杂交法，其灵敏度提高５倍以上。     

一步法实时荧光定量PCR检测白血病WT1基因mRNA

目的 构建RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因mRNA表达的方法,准确定量检测白血病患者微小残留病,指导临床判断预后和早期预测复发.方法 从K562细胞提取的RNA用特异性引物扩增WT1基因,pMD18-T载体克隆法构建荧光定量PCR标准模板,建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测wTl基因方法,并对该方法的灵敏度、重复性和稳定性进行检测.结果 构建的RT-PCR一步法实时荧光定量PCR方法的灵敏度达10-4水平:以拷贝数为1.0x106～1.0×102 cps/ml的标准品,分别进行RT-PCR一步法实时荧光定量PCR扩增后,标准品的Ct值与该标准品模板起始浓度的对数存在线性关系,r值达0.998:管间和批间的变异系数均小于8%.结论 所建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因方法的灵敏度、重复性和特异性好;RT和PCR反应过程一步完成,更简便快捷,减少加样和污染机会,更适合临床检测.     

PCR扩增nuc基因快速检测金黄色葡萄球菌

为快速检测标本中金黄色葡萄球菌，应用聚合酶链反应（ＰＣＲ），扩增金葡萄ｎｕｃ基因，并与培养法进行比较分析。结果只有金葡菌扩增出一条特异的ＤＮＡ条带，平行对照的其它菌株均为阴性，说明用ＰＣＲ检测金葡菌的方法简便、快速、特异、敏感。     

PCR扩增法检测DMD患者的基因缺失

目的 探讨Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型肌营养不良症（ＤＭＤ）患者基因缺失的突变特点并进行基因诊断。方法 用一对特异引物进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ基因ｅｘｏｎ４８附近的ＤＮＡ片段。结果 在２１例ＤＭＤ患者中，检出１６例患者的ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ基因在该处存在缺失突变。ｅｘｏｎ４８是ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ基因发生缺失突变“热点”区的观点。结论 该方法可用于ＤＭＤ的遗传咨询、基因诊断及产前基     

TaqDNA聚合酶一步法获得TGF—β1基因片段的RT—PCR扩增产物

以组织细胞中提取的总ＲＮＡ为模板，加入ＴａｑＤＮＡ聚合酶和一对以ＴＧＦ－β１ｃＤＮＡ为模板设计的引物，经变性，退火，延伸共３０次循环后，可以得到ｃＤＮＡ为模板的扩增产物，实验证实ＴａｑＤＮＡ聚合酶具有逆转录酶活性，用一步常规聚合酶锭反应即可获取逆转录聚合酶链反应的ＴＧＦ－β１４６８ｂｐ扩增产物。     

急性白血病钙素基因甲基化的PCR检测

应用多聚酶链反应（ＰＣＲ）技术检测了１０例急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）和２２例急性随细胞白血病（ＡＭＬ）降钙素（ＣＴ）基因的甲基化程度。结果表明，７例ＡＩＬ与１６例ＡＭＬ的ＣＴ基因都发生了高度甲基化。临床完全缓解的３例ＡＭＬ和２例ＡＩＬ中有１例ＡＬＬ为阳性，另有１例阴性的ＡＭＬ于１个月后转为阳性，随后出现临床复发。     

用cox1基因片段的PCR鉴别亚洲带绦虫和牛带绦虫

目的：用cox1基因片段的PCR技术对亚洲带绦虫和牛带绦虫的快速鉴别。方法：用亚洲带绦虫和牛带绦虫线粒体cox1基因片段的特异性引物以及带绦虫cox1基因片段的通用引物,对贵州省都匀地区和从江地区的带绦虫虫卵和节片DNA进行常规PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测和核酸序列测定,并用NC-BI Blast对扩增产物的核酸序列与NCBI数据库中带绦虫的cox1基因进行比对。结果：5株都匀带绦虫DNA样品经亚洲带绦虫cox1基因片段的特异性引物PCR,均扩增出约260 bp的产物,PCR产物的核酸序列与NCBI数据库中亚洲带绦虫线粒体cox1基因片段的同源性为100%;2株从江带绦虫的DNA样品用亚洲带绦虫特异性引物和牛带绦虫特异性引物的PCR均未见扩增产物,而通用引物PCR则扩增出约1 000 bp的产物,核酸序列与NCBI数据库中牛带绦虫线粒体cox1基因片段的同源性为99%,在牛带绦虫特异性引物的结合位点存在一个碱基差异。结论：常规PCR扩增特异性的cox1基因片段可快速鉴定亚洲带绦虫;从江牛带绦虫株的cox1基因特异性片段部分存在变异,导致与特异性引物结合能力的差异,可采用cox1基因通用引物PCR结合测序进行鉴定。     

两步多重PCR技术快速检测杜氏肌营养不良基因缺失

杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是男性最常见的X连锁致死性遗传病之一,临床上较轻型的BMD(Becker muscular dystrophy)是其等位基因型。DMD和BMD的发病率分别为30/10万和3/10万。三分之一的新生男婴患者由新生突变所引起。DMD基因定位于Xp~(23),是已知的最大基因,约有2300kb。由于该基因太大,用传统的限制性内切酶片段长度多态性(RFLPs)进行家系连锁分析,或应用cDNA探针进行Southern印迹杂交检测基因缺失均较繁琐费时,在临床上不易推广。PCR技术自1985年问世以来,已广泛应用于遗传病的基因诊断。Chamberlain等在DMD基因的两个缺失热点内,以9个易缺失外显子的旁侧顺序为引物进行多重PCR扩增,快速检测出DMD基因的绝大部分缺失型。本实验参照其多重PCR合成9对引物,并选用缺失率较高的5对引物和另外4对引物进行两步多重PCR,对中国人群中的DMD患者进行筛查,获得满意结果。     

基因诊断的PCR技术与基因扩增仪

基因是决定生物体性状的遗传物质。现已查明，除了外伤，几乎所有的疾病在不同程度上都与人的基因有关，从而可以利用基因的特点对疾病进行诊断和治疗。特别是１９８５年ＰＣＲ技术问世以来，更有了迅速的发展。     

实时荧光多重聚合酶链反应-高分辨率溶解曲线分析鉴别6种致腹泻性大肠埃希菌的研究

目的建立一种鉴别6种致腹泻性大肠埃希菌的实时荧光多重聚合酶链反应-高分辨率溶解曲线分析方法。方法根据6种致腹泻大肠埃希菌的8种特异性毒力基因设计8对引物,采用实时荧光多重聚合酶链反应后溶解曲线分析,根据曲线的峰值、高度、宽度、面积不同鉴别不同的致病菌。结果成功设计出8对引物,扩增出针对6种致腹泻大肠埃希菌的8种不同毒力基因,获得了特异性的溶解曲线。优化反应体系后在同一反应管中成功获得针对8种特异基因的溶解曲线,除肠侵袭性大肠杆菌、细胞致死膨胀性大肠杆菌具有相同的两种基因不能鉴别外,其中5种致腹泻性大肠埃希菌均可以明确鉴别。结论多重聚合酶链反应-高分辨率溶解曲线分析鉴别致腹泻性大肠埃希菌是一种简单、特异、高效的方法,在腹泻病与食源性疾病的暴发调查和日常监测中具有广泛的应用价值。     

PCR法快速筛选重组克隆方法的改进

①目的　以PCR法在菌液中快速筛选重组克隆。②方法　提取小鼠巨噬细胞总RNA ,反转录PCR(RT PCR)获得肿瘤坏死因子 α(TNF α)基因片段 ,TA克隆连接质粒载体、转化大肠杆菌JM10 9。在大肠杆菌培养中的不同时间取样测定大肠杆菌A60 0 值及计数。以不同数量的大肠杆菌为模板进行系列PCR扩增 ,获得适宜PCR扩增条件的大肠杆菌数。③结果　以菌液为模板进行PCR能够快速筛选重组体 ,大肠杆菌模板数在 12 5～ 2 5 0个范围内 ,PCR对阳性克隆的扩增可获得良好结果 ;获得常规培养条件下转化大肠杆菌的生长曲线 ,A60 0 值与大肠杆菌计数间存在显著正相关 (r=0 .93,P <0 .0 0 1)。④结论　通过测定大肠杆菌培养液A60 0 值推算大肠杆菌数量 ,以适宜的大肠杆菌模板行PCR法筛选重组克隆 ,快速准确并方便下游操作     

几种常见肠道致病菌多重PCR检测的效果评价

目的：建立一种应用多重PCR技术,能够同时快速准确检测大肠杆菌O157、副溶血性弧菌、普通变形杆菌和单核细胞增生李斯特菌4种常见肠道致病菌的方法。方法：根据大肠杆菌O157、副溶血性弧菌、普通变形杆菌、单核细胞增生李斯特菌的特异基因作为目的基因,设计相应的引物,并进行实验优化以确立对4种肠道致病菌的检测体系。并对市售经果汁样品人工随机染菌后进行模拟样品验证。结果：该多重PCR方法能够有效地扩增出相应致病菌的目的基因片段,其中单核细胞增生李斯特菌扩增片段为155 bp,大肠杆菌O157扩增片段为366 bp,变形杆菌扩增片段为522 bp,副溶血弧菌扩增片段为199 bp,且特异性较强。对4种目标菌的检测灵敏度可达到103CFU/mＬ。能够检测出模拟样品中随机接种的任意3种细菌。结论：利用建立的多重PCR可以快速、准确地筛查大肠杆菌O157、副溶血弧菌、普通变形杆菌和单核细胞增生李斯特菌。     

动物粪便中肠道出血性大肠杆菌PCR检测方法的建立

【目的】建立一种能够快速检测动物源性肠道出血性大肠杆菌的PCR方法。【方法】按照华大基因公布的检测肠道出血性大肠杆菌的方法,应用PCR的方法检测腹泻动物粪便中分离到的大肠杆菌Stx2-2基因和AFF-I-2基因。【结果】在分离到的45株大肠杆菌中,Stx2-2基因阳性菌株有7株,AFF-I-2基因阳性菌株有22株,其中2种基因阳性菌株有2株,其血清型分别为O142和O127:K63。【结论】成功建立了快速检测动物源性肠道出血性大肠杆菌的PCR方法。     

用大引物PCR法获得轮状病毒VP4基因的突变体

目的；对A组轮状病毒主要结构抗原VP4基因中PacⅠ的识别序列进行无义突变以便于用腺病毒Ad-Easy载体系统进行表达。方法：采用大引物PCR方法，通过3条引物，两轮PCR反应，获得VP4基因的突变体，并经核酸序列分析证实。结果：PacⅠ识别的8个碱基序列TTAAT－TAA，突变为CTGATCAA。结论；大引物PCR是对核酸进行突变的一种简便，快速的方法。     

用两种PCR方法对HIV-1测定的敏感度对比分析

目的:探讨用Roche公司生产的Combas Amplicor HIV-1病毒载量检测试剂与巢式RT-PCR法检测HIV-1这两种检测方法之间的相关性。方法:将81份HIV-1阳性患者血浆样本首先用Combas Amplicor病毒载量检测试剂盒检测出病毒拷贝数/ml,根据病毒拷贝数对数/ml的多少分为5组。再用巢式RT-PCR法对以上样本进行重复测定,观察以上2种检测方法的相关性。结果:用巢式RT-PCR法对用Combas Ampli-cor病毒载量检测的病毒拷贝数/ml分为2.000~2.999组;3.000~3.999组;4.000~4.999组;5.000~5.999组和>6.000组病毒拷贝数/ml的检测阳性率分别为87.5%(7/8),93.75%(30/32),95.83%(23/24),100%(14/14)和100%(3/3)。结果表明,随着病毒拷贝数/ml的增高巢式法检测的阳性率也相应增高。结论:巢式RT-PCR由于具有操作简单,价格便宜等优点可作为AIDS的初步筛查,指导抗AIDS药物治疗等使用,对于基层而言是一种简便易行的方法。     

应用多重PCR技术同时分析GSTM 1,GSTT 1,GSTP 1基因型

[目的]探讨同时分析GSTM1，GSTT1，GSTP1基因分型的简捷、快速且准确的方法，[方法]利用GSTM1，GSTT1基因扩增产物无BsmA Ⅰ酶切位点，GSTP1基因具有BsmA Ⅰ酶切位点的特点，采用多重PCR方法和限制性片段长度多态性技术，同时对GSTM1，GSTT1，GSTP1基因进行分型，并分别与普通PCR技术的分型结果进行比较。[结果]多重PCR技术基因分型结果与普通PCR方法完全一致，300名韩国大学生的血样分型结果示GSTM1基因缺失型占53．3％，GSTT1基因缺失型占54．7％，GSTP1基因型为lie／Ile型占62．0％，Iie／Val型占34．3％，Val／Val型占3．7％，I1e基因出现频率为79．2％，Val为20．8％。[结论]多重PCR技术可用于N时分析GSTM1，GSTT1，GSTP1基因分型。     

PCR扩增IgH基因诊断眼眶良性淋巴增生病的研究

目的；探索某些眼眶良性淋巴星病向恶性淋巴瘤转变的实质。方法；应用聚合酶链反尖（ＰＣＲ）对１８例病理组织学诊断为 眶良性洒巴增生病的石蜡切片进行免疫球蛋白重链（ｇＨ）基因扩增。结果；３例良性淋巴增生病见Ｉ基因一致性重排，电泳产的见一明显的扩增带（１００－１２０ｂｐ），其余１５例未见扩增产物或呈多克隆带。结论；某些良性淋巴增生病的病例存在病理组织学和免疫组织化学不衣检测到的微小单克隆病变。它提示临床为     

聚合酶链反应微孔酶免疫法检测新型隐球菌

目的 建立一种检测脑膜炎新型隐球菌聚合酶链反应（PCR）产物的微孔酶免疫方法,方法 对PCR所用2条引物进行双标记,使扩增产物一端标记上生物素,另一端标记上地高辛,通过包被在微孔板上的亲和素捕获固定,然后用碱性磷酸酶标记的地高辛抗体反应后显色测定。结果 三种PCR产物检测方法的对照分析表明微孔板酶免疫法敏感性最强,加样量38nL时即可显色,模板DNA经过10^11倍稀释后仍为阳性结果,聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖电泳则分别可检测到0.3125uL,1.25uL及10^7,10^4稀释度,对临床脑脊液标本的检测结果微孔板酶免疫法和聚丙烯酰胺凝胶电泳的符合率为100%,二敏感性均高于琼脂微电泳,结论 建立的方法与常规电泳法相比灵敏准确,结果判断客观,重复性也较好;所测结果可相对反应PCR产物量的多少,此方法可取代电泳法成为常规检测PCR产物的方法。