依达拉奉对淀粉样β蛋白25～35致PC12细胞氧化损伤的神经保护作用

目的:观察特异性清除羟自由基的神经保护剂依达拉奉对淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞氧化损伤的保护作用。方法:实验于2005-03/07在吉林大学中日联谊医院神经内科进行。将培养的PC12细胞分为3组:①正常对照组:加入含体积分数0.25的胎牛血清的DMEM维持液培养。②依达拉奉预处理组:加入依达拉奉20μmol/L预处理12h,然后加入淀粉样β蛋白25～3530μmol/L继续孵育24h。③淀粉样β蛋白25～35干预组:淀粉样β蛋白25～3530μmol/L孵育24h。采用MTT法测定细胞生存率;采用ELISA法测定羰基蛋白和晚期糖基化终产物的含量;硫代巴比妥酸法测定丙二醛的浓度。结果:①3组细胞生存率比较:正常对照组为(100.0±5.7)%,依达拉奉预处理组显著高于淀粉样β蛋白25～35干预组[(86.4±17.7)%,(42.5±9.4)%,P<0.001]。②3组细胞内羰基蛋白含量比较:正常对照组为(0.35±0.09)μmol/g,依达拉奉预处理组显著低于淀粉样β蛋白25～35干预组[(0.41±0.12),(0.81±0.17)μmol/g,P<0.01]。③3组晚期糖基化终产物水平比较:正常对照组为(12.21±3.26)mg/L,依达拉奉预处理组显著低于淀粉样β蛋白25～35干预组[(14.65±4.25),(26.57±5.18)mg/L,P<0.01]。④丙二醛浓度:正常对照组为(4.11±0.98)μmol/L,依达拉奉预处理组显著低于淀粉样β蛋白25～35干预组[(4.92±1.30),(7.58±1.01)μmol/L,P<0.01]。结论:依达拉奉能够减少淀粉样β蛋白25～35对PC12细胞内蛋白质氧化产物、晚期糖基化终产物及脂氧化终末产物的生成,具有神经保护作用。     

Aβ25-35致PC12细胞核酸、蛋白质氧化损伤及依达拉奉的保护作用

目的 研究依达拉奉对淀粉样β蛋白25-35（Aβ25-35）诱导的PC12细胞核酸、蛋白质氧化损伤的保护作用。方法 实验对象分为三组：依达拉奉保护组（依达拉奉20μmol／L,Aβ25-35 30 μmol／L）、Aβ25-35干预组（Aβ25-35 30 μmol／L）和正常对照组。采用MTT法测定细胞生存率；慧星法测定DNA单链损伤；ELISA法测定羰基蛋白含量；比色法测定羟自由基（．OH）并计算，OH清除率。结果 与正常对照组相比，Aβ25-35干预组细胞生存率降低。DNA单链损伤明显加重，细胞内羰基蛋白含量升高（P均〈0．001）。依达拉奉保护组与Aβ25-35干预组相比，细胞生存率明显升高，DNA单链损伤明显减轻，细胞内羰基蛋白含量减低（P〈0．001或P〈0．01），但都未达到正常水平。依达拉奉对．OH的有效清除率可高达79．98％。结论 依达拉奉能够通过清除．OH来减轻DNA损伤。并能减少细胞内蛋白质氧化产物的生成，具有神经保护作用。     

淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡与奥氮平的保护作用

背景：在阿尔茨海默病中起着重要作用的淀粉样β蛋白能够诱导细胞凋亡。目的：探讨奥氮平对淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡的机制及其保护作用。单位：解放军总医院南楼神经科。设计：随机设计。材料：实验于2002-05／2003-03在加拿大萨斯卡彻温大学医学院神经精神研究所完成。方法：P12细胞在RPMI1640培养液中培养。在96孔板每孔中接种100μL细胞悬液，在胶原被覆的25cm^2培养瓶中接种5mL细胞悬液，培养24h后，分别加50μmol／L、100μmol／L奥氮平培养24h，再加不同浓度的淀粉样β蛋白25～35（0．01μmol／L．2μmol／L、20μmol／L）培养24h。将收获好的96孔板以淀粉样β蛋白25～35诱导PC12细胞凋亡，采用MTT比色分析测定细胞存活率。收获25cm^2培养瓶中的PC12细胞，应用Western blot检测奥氮平对PC12细胞Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响。主要观察指标：细胞存活率的测定，PC12细胞中Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达水平。结果：①细胞存活率比较：淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞的细胞活性从75％降低到35％；50μmol／L、100μmol／L奥氮平预处理组PC12细胞的活性明显提高。②奥氮平对淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡中Bax表达的影响：0．01μmol／L，2μmol／L,20μmol／L淀粉样β蛋白25～35处理的PC12细胞Bax的表达增加，50μmol／L奥氮平预处理使淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞Bax的表达减低。③奥氮平对Aβ25～35诱导的PC12细胞凋亡中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响：0．001μmol／L、0．01μmol／L淀粉样β蛋白处理的PC12无变化，50μmol／L奥氮平预处理对PC12细胞表达亦无影响；2μmol／L、20μmol／L淀粉样β蛋白25～35处理的PC12细胞表达增高，50μmol／L奥氮平预处理能抑制其表达升高。结论：①淀粉样β蛋白25～35能够诱发与细胞凋亡密切相关的Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在培养的PC12细胞中高表达。②奥氮平具有降低其表达，提高PC12细胞存活的保护作用。     

淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡与奥氮平的保护作用

背景:在阿尔茨海默病中起着重要作用的淀粉样β蛋白能够诱导细胞凋亡。目的:探讨奥氮平对淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡的机制及其保护作用。单位:解放军总医院南楼神经科。设计:随机设计。材料:实验于2002-05/2003-03在加拿大萨斯卡彻温大学医学院神经精神研究所完成。方法:P12细胞在RPMI1640培养液中培养。在96孔板每孔中接种100μL细胞悬液,在胶原被覆的25cm2培养瓶中接种5mL细胞悬液,培养24h后,分别加50μmol/L、100μmol/L奥氮平培养24h,再加不同浓度的淀粉样β蛋白25～35(0.01μmol/L、2μmol/L、20μmol/L)培养24h。将收获好的96孔板以淀粉样β蛋白25～35诱导PC12细胞凋亡,采用MTT比色分析测定细胞存活率。收获25cm2培养瓶中的PC12细胞,应用Westernblot检测奥氮平对PC12细胞Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响。主要观察指标:细胞存活率的测定,PC12细胞中Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达水平。结果:①细胞存活率比较:淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞的细胞活性从75%降低到35%;50μmol/L、100μmol/L奥氮平预处理组PC12细胞的活性明显提高。②奥氮平对淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡中Bax表达的影响:0.01μmol/L,2μmol/L,20μmol/L淀粉样β蛋白25～35处理的PC12细胞Bax的表达增加,50μmol/L奥氮平预处理使淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞Bax的表达减低。③奥氮平对Aβ25～35诱导的PC12细胞凋亡中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响:0.001μmol/L、0.01μmol/L淀粉样β蛋白处理的PC12无变化,50μmol/L奥氮平预处理对PC12细胞表达亦无影响;2μmol/L、20μmol/L淀粉样β蛋白25～35处理的PC12细胞表达增高,50μmol/L奥氮平预处理能抑制其表达升高。结论:①淀粉样β蛋白25～35能够诱发与细胞凋亡密切相关的Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在培养的PC12细胞中高表达。②奥氮平具有降低其表达,提高PC12细胞存活的保护作用。     

银杏提取物对淀粉样β蛋白致PC12细胞凋亡的保护作用

目的：探讨银杏提取物对淀粉样β蛋白(Aβ)致PC12细胞凋亡的保护作用。方法：应用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)分析法研究细胞活性的改变，应用激光共聚焦显微镜进行线粒体膜电位测定。TUNEL法测定细胞凋亡率。结果：随着Aβ浓度的加大，PC12细胞的存活率逐渐降低。同时给予Aβ及不同剂量的银杏提取物，可明显提高PC12细胞的存活率。银杏提取物可减少Aβ所致的细胞凋亡，Aβ组细胞凋亡率为63％，高于银杏组21％(x^2=36．2069，P=0．0000)。结论：银杏提取物可抑制Aβ诱导的PC12细胞凋亡。     

银杏提取物对淀粉样β蛋白致PC12细胞凋亡的保护作用

目的:探讨银杏提取物对淀粉样β蛋白(Aβ)致PC12细胞凋亡的保护作用。方法:应用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)分析法研究细胞活性的改变,应用激光共聚焦显微镜进行线粒体膜电位测定。TUNEL法测定细胞凋亡率。结果:随着Aβ浓度的加大,PC12细胞的存活率逐渐降低。同时给予Aβ及不同剂量的银杏提取物,可明显提高PC12细胞的存活率。银杏提取物可减少Aβ所致的细胞凋亡,Aβ组细胞凋亡率为63%,高于银杏组21%(χ2=36.2069,P=0.0000)。结论:银杏提取物可抑制Aβ诱导的PC12细胞凋亡。     

多奈哌齐对β淀粉样蛋白诱导PC12细胞损伤的保护作用

目的:研究多奈哌齐对Aβ25-35蛋白诱导的PC12细胞损伤的保护作用。方法:采用细胞培养、MTT法和流式细胞仪技术,以β淀粉样蛋白(amyloidbetaprotein,Aβ)诱导PC12细胞损伤作为细胞模型,观察不同剂量Aβ25-35蛋白对PC12细胞的影响以及多奈哌齐对PC12损伤的保护作用。结果:PC12细胞对于Aβ25-35造成的损伤和凋亡呈剂量依赖型,凋亡百分率增加(71.3%,90.1%),细胞增殖活性降低(t=13.89,P<0.001);提前给予多奈哌齐保护的PC12细胞凋亡百分率明显降低(52.0%),细胞增殖活性较前提高(t=12.77,P<0.001)。结论:多奈哌齐明显减少Aβ诱导的PC12细胞的损伤,提高细胞的存活率,减少细胞凋亡。     

多奈哌齐对β淀粉样蛋白诱导PC12细胞损伤的保护作用

目的：研究多奈哌齐对Aβ25-35蛋白诱导的PC12细胞损伤的保护作用。方法：采用细胞培养、MTT法和流式细胞仪技术，以β淀粉样蛋白(amyloid beta protein，Aβ)诱导PC12细胞损伤作为细胞模型，观察不同剂量Aβ25～35蛋白对PC12细胞的影响以及多奈哌齐对PC12损伤的保护作用。结果：PC12细胞对于Aβ25—35造成的损伤和凋亡呈剂量依赖型，凋亡百分率增加(71．3％，90．1％)，细胞增殖活性降低(t=13．89，P&;lt;0．001)；提前给予多奈哌齐保护的PC12细胞凋亡百分率明显降低(52．0％)，细胞增殖活性较前提高(t=12．77，P&;lt;0．001)。结论：多奈哌齐明显减少Aβ诱导的PC12细胞的损伤，提高细胞的存活率，减少细胞凋亡。     

欧洲越桔和笃斯越桔对神经细胞氧化损伤的保护作用

目的：比较欧洲越桔和笃斯越桔对氧化应激损伤PC12细胞的保护作用，并观察其作用是否具有剂量依赖性。方法：实验于2004-10,2005-01在华东理工大学生物工程学院生物反应器国家重点实验室进行。PC12细胞以含12．5，25，50mg／L的欧洲越桔标准提取物和笃斯越桔标准提取物的DMEM培养液预孵8h后，以500μmol／L的H2O2干预12h作为氧化应激损伤的模型，采用MTT比色法计算细胞死亡抑制率评估细胞存活情况（抑制率越高，存活细胞越多），DCFH—DA荧光染色法测定细胞内活性氧化物清除抑制率评估细胞内活性氧化物水平（抑制率越低，细胞内活性氧化物水平越低），Hoechst染色法观察细胞核形态学，流式细胞仪检测细胞凋亡。结果：①细胞死亡抑制率：笃斯越桔标准提取物25，50mg／L组高于欧洲越桔标准提取物25，50mg／L组（27．78％，23．66％；46．05％，41．67％），两种药物均为剂量越大，其抑制率越高。②PC12细胞内活性氧化物清除抑制率：笃斯越桔标准提取物25，50mg／L组低于欧洲越桔标准提取物25，50mg／L组（67．58％，80．61％；41．86％，56．69％），且剂量越大，其抑制率越低。③细胞凋亡率：正常对照组为0．69％，500μmol／L H2O2作用12h后。为30．19％。预先给予欧洲越桔标准提取物和笃斯越桔标准提取物处理后，分别为9．45％，8．82％。结论：欧洲越桔和笃斯越桔对氧化应激损伤PC12细胞均具有保护作用，笃斯越桔作用优于欧洲越桔，且具有剂量依赖性效应。其机制可能与其能降低细胞内活性氧化物水平，进而抑制神经细胞凋亡有关。     

骨髓间充质干细胞分泌物对淀粉样β蛋白1～40损伤PC12细胞的神经保护作用

背景:由于骨髓间充质干细胞能分泌多种对退变胆碱能神经元有保护作用的神经营养因子,因此为阿尔茨海默病的治疗提供了新希望.目的:观察骨髓间充质干细胞分泌物对Aβ1～40损伤PC12细胞凋亡的保护作用.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2008-01/10在中国医科大学神经内科实验室完成.材料:体质量150 g左右的SD大鼠,雌雄不拘.方法:在体外培养、纯化骨髓间充质干细胞并收集其培养上清,实验分为4组:①空白对照组:在细胞培养体系中不加入任何药物和上清液.②骨髓间充质干细胞上清液组:细胞接种后24 h在细胞培养体系中加入骨髓间充质干细胞上清液30,60,120 已μL,并用体积分数为5%胎牛血清/RPMI 1640将终体积补足至300 μL,使其上清液体积分数分别为10%,20%,40%.③Aβ1～40损伤组:以10 mg/LAβ1～40刺激PC12细胞,终浓度为5,10,20 mg/L:换用1640培养24 h后,收集受损PC12上清培养液.④联合培养组:以10 mg/L Aβ1～40刺激PC12细胞过夜(阿尔茨海默病细胞模型),除去培养上清,换用1640培养24 h后,收集受损PC12上清作为条件培养液,分别给予骨髓间充质干细胞上清液30,60,120 μL,各组细胞给药后24 h和48 h进行指标检测.主要观察指标:①骨髓间充质干细胞表面抗原鉴定.②骨髓间充质干细胞分泌物对PC12细胞活力的影响.结果:骨髓单个核细胞培养2～5 d为生长潜伏期,细胞增殖较慢,细胞数变化不明显.6～12 d为细胞快速增殖期,排列有一定方向性,呈旋涡样生长.培养15～18 d,细胞出现80%～90%的融合,克隆间出现重叠.胰酶消化传代的细胞于12 h内完全贴壁、伸展并重新变为长梭形,生长迅速,7～10 d达到完全融合.骨髓间充质干细胞表面抗原的鉴定通过免疫荧光检测显示,CD45表达为阴性,证明其为非造血类细胞;CD44表达阳性.②Aβ1～40的终浓度为5,10,20 mg/L孵育24,48 h后,细胞活力与空白对照组相比均降低(P<0.01),且随着Aβ1-40质量浓度的增大,活力降低越明显.与Aβ1-40 mg/L孵育24,48 h组相比,联合培养组细胞活力上升,且相邻剂量间两两比较差异均有显著性意义(P<0.05);作用24,48 h骨髓间充质干细胞上清液组各浓度组与空白对照组相比,细胞活力没有变化.结论:骨髓间充质干细胞对Aβ1-40损伤的PC12细胞凋亡有保护作用,其保护作用的强弱与骨髓间充质干细胞上清液浓度有关.     

晚期糖基化终产物在β样淀粉蛋白25-35诱导PC12细胞氧化损伤中的作用

目的探讨晚期糖基化终产物(AGEs)在β样淀粉蛋白25-35(Aβ25-35)诱导PC12细胞氧化损伤中的作用。方法将实验对象分为五组:10、20、304、0μmol/L四种浓度的Aβ25-35干预组和正常对照组。采用MTT法测定细胞生存率,采用ELISA法测定AGEs的含量。结果Aβ25-35诱导PC12细胞,细胞生存率为50%时,Aβ25-35浓度约为30μmol/L;与正常对照组相比,30μmol/L Aβ25-35干预组细胞生存率明显降低(P<0.001)、细胞内AGEs含量明显升高(P<0.05)。结论AGEs参与了β样淀粉蛋白25-35诱导PC12细胞氧化损伤的过程。     

Transferrin neutralization of amyloid beta 25-35 cytotoxicity

BACKGROUND: Fibrillar aggregates of amyloid beta 25-35 (Abeta(25-35)) form rapidly in vitro able to lyse human red blood cells (RBCs). Human sera, albumin, and apolipoprotein E (ApoE) each limit fibrillation and cytotoxicity. Potentially, these substances protect neurons from Abeta(1-40/42) aggregates. Transferrin (TF) is investigated in this study. METHODS: The Mattson red blood cells model was employed to determine whether co-incubation of transferrin and Abeta(25-35) prevented lysis. The formation of fibrillar Abeta(25-35) in the presence of transferrin was investigated using Congo red staining and spectrophotometric studies. RESULTS: We found that incubation of 20 muM Abeta(25-35) with physiologic levels of transferrin prevented red blood cells lysis and the formation of macro-aggregates. CONCLUSIONS: These in vitro results suggest that transferrin may limit fibrillar beta amyloid formation in vivo and cytotoxicity.     

复智散对淀粉样β蛋白25-35神经细胞毒性效应的影响及其机制

.背景淀粉样β蛋白是老年斑的核心成分,其毒性片段淀粉样β蛋白25-35近年广泛用于实验研究中.已往研究表明自制中药复智散可促进培养神经细胞存活,可能具备治疗阿尔茨海默病的效用.目的研究复智散对抗淀粉样β蛋白25-35对培养神经细胞的毒性作用及其发挥这一作用的可能途径.设计以细胞为研究对象,重复测量设计.单位一所大学医院的神经内科和一所大学医院的脑老化重点实验室.材料实验于2002-06/2003-04在宣武医院北京脑老化重点实验室完成.人多巴胺能神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞.淀粉样β蛋白25-35片段.中药复智散文火煎制,留取上清冷冻抽干配成浓度为0.5 g/mL的贮存液备用.抗体cAMP应答元件结合蛋白、B淋巴细胞白血病-2基因产物中的Bcl-2、细胞色素C由宣武医院北京脑老化研究实验室制备.方法用不同剂量的淀粉样β蛋白25-35单独或与复智散共同孵育SH-SY5Y细胞,与空白对照组相比,测定在不同孵育条件下培养神经细胞的噻唑蓝代谢率.利用Western-blot法测定复智散单独孵育、淀粉样β蛋白25-35单独孵育及两者共同孵育条件下与空白对照相比蛋白质表达的变化.主要观察指标各实验组与空白对照组相比的噻唑蓝代谢率.与神经细胞存活及死亡相关蛋白cAMP应答元件结合蛋白,Bcl-2及细胞色素C的表达水平.结果复智散单独孵育可使SH-SY5Y细胞存活率增加11.4%,与淀粉样β蛋白25-35共同孵育时培养神经细胞存活率较淀粉样β蛋白25-35单独孵育明显提高.淀粉样β蛋白25-35损伤组cAMP应答元件结合蛋白和Bcl-2表达减少,复智散组这两种蛋白质表达增加.淀粉样β蛋白25-35损伤组胞浆内细胞色素C表达增加,复智散孵育下该蛋白质表达水平下降.结论复智散有促进培养神经细胞存活作用,在淀粉样β蛋白25-35损伤条件下该种保护作用依旧存在.复智散可能通过影响细胞存活/死亡相关蛋白质的表达发挥这一效应.     

Investigation of plasma metabolomics and neurotransmitter dysfunction in the process of Alzheimer's disease rat induced by amyloid beta 25-35

Alzheimer''s disease (AD) has become one of the major diseases endangering the health of the elderly. Clarifying the features of each AD animal model is valuable for understanding the onset and progression of diseases and developing potential treatments in the pharmaceutical industry. In this study, we aimed to clarify plasma metabolomics and neurotransmitter dysfunction in the process of AD model rat induced by amyloid beta 25-35 (Aβ 25-35). Firstly, Morris Water Maze (MWM) test was used to investigate cognitive impairment in AD rat after 2, 4 and 8 weeks of modelling. Based on this, the effects on levels of AD-related enzymes and eight neurotransmitters were analyzed. And plasma metabolomics analysis based on ultra high-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UHPLC-Q-TOF-MS) was used to research the metabolic disturbances in the process of AD rat. The results shown the injury on the spatial learning ability of AD rats was gradually aggravated within 4 weeks, reached the maximum at 4 weeks and then was stable until 8 weeks. During 8 weeks of modeling, the levels of enzymes including β-secretase, γ-secretase, glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β), acetyl cholinesterase (AchE) and nitric oxide synthase (NOS) were significant increased in the plasma of AD rats. The neurotransmitter dysfunction was mainly involved in γ-aminobutyric acid (GABA), acetyl choline (Ach), glutamic acid (Glu), 5-hydroxytryptamine (5-HT), dopamine (DA) and norepinephrine (NE). 17 endogenous metabolites correlated with AD were successfully detected in the metabolomics analysis. These metabolites were mainly involved in fatty acids, sphingolipids, and sterols metabolisms, vitamin metabolism, and amino acid metabolism. These metabolites might be the potential biomarkers that correctly mark different stages of AD. The study on peripheral plasma indices reflecting the process of AD laid the foundation for understand the pathophysiology of AD and find an effective and radical cure. And the rules of endogenous metabolic disorder in AD rats also have a certain guiding significance for the future study of food–drug interactions at different stages of AD.

The cognitive impairment, Alzheimer''s disease (AD) related enzymes, neurotransmitters and endogenous metabolites shown a dynamic change in AD model rat induced by amyloid beta 25-35.