腺病毒介导gax基因转染在培养的血管平滑肌细胞中的表达

目的　以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞 (VSMC) ,增强VSMC中gax基因的表达。方法　采用位置特异性重组方法构建携带大鼠 gax基因表达序列的复制缺陷型 5型腺病毒载体(AdCMV gax) ,经 2 93细胞扩增 ,纯化制备高滴度病毒转染液 ;以病毒转染液常规转染VSMC后 ,应用RT PCR、流式细胞仪和免疫细胞化学等方法分别检测VSMC中 gaxmRNA和蛋白质的表达。 结果　流式细胞仪检测和免疫细胞化学染色均显示AdCMV gax转染VSMC后 ,VSMC的Gax蛋白表达率明显增高 ,转染后 2 4小时即可达 80 %左右 ,高水平的表达可维持 5天以上 ;AdCMV gax转染前 ,PDGF BB对gax基因转录和翻译水平的表达均有下调作用 ,AdCMV gax转染后 ,无论有无PDGF BB刺激 ,VSMC中 gax基因的表达均比转染前显著增高。 结论　腺病毒载体可有效地介导 gax基因转染VSMC ,并且表达为蛋白质。这有利于进一步研究 gax基因对VSMC生物学行为的影响     

AT2R基因可调控表达在血管紧张素Ⅱ介导的体外培养VSMC增殖中作用

目的　研究血管紧张素Ⅱ 2型受体 (AT2R)基因可调控表达对体外培养血管平滑肌细胞(VSMC)表达细胞周期蛋白依赖性激酶 2 (CDK2 )、增殖细胞核抗原 (PCNA)以及 p2 1的影响 ,旨在探讨AT2R基因在VSMC上条件表达在再狭窄防治中的潜在意义。方法　本研究通过常规分子生物学方法 ,建立四环素类似物Doxycycline可调控表达AT2 R基因的双重稳定VSMC细胞系。应用RT PCR和免疫细胞化学染色技术 ,观察该双重稳定表达AT2R的VSMC细胞系中CDK2、PCNA及 p2 1的mRNA及蛋白表达情况 ;采用血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )及其Ⅰ型、Ⅱ型其受体拮抗剂干预上述细胞 ,观测上述指标的变化。 结果　①加入Doxycycline前转染组低水平表达CDK2、PCNA ;AngⅡ 10 - 7mol/L干预VSMC后CDK2、PCNA表达显著增加 (P <0 .0 1) ;在AngⅡ 10 - 7mol/L干预的同时加入Doxycycline后 ,CDK2、PCNA的表达受到显著抑制 (P <0 .0 1) ,但仍高于基础水平 (P <0 .0 1) ;ATIR拮抗剂CV 11974可进一步下调CDK2、PCNA的表达 ;AT2R拮抗剂PD12 3319干预组CDK2、PCNA强表达 (与AngⅡ组比较 ,P >0 .0 5 )。②加入Doxycy cline前转染组 p2 1表达处于高水平 ;AngⅡ 10 - 7mol/L干预VSMC后 p2 1表达显著降低 (P <0 .0 1) ;在AngⅡ 10 - 7mol/L干预的同时加入Doxycycline后 ,p     

BTEB2反义基因转染对血管平滑肌细胞迁移的影响

目的：研究BTEB2反义基因转染对血管平滑肌细胞（VSMC）增殖的影响。方法：将BTEB2 cDNA反向克隆至腺病毒载体,构建携带反义BTEB2基因的重组腺病毒Ad-ASBTEB2;用Ad-ASBTEB2转染VSMC,经免疫印迹法检测BTEB2蛋白质表达;通过改良Boyden趋化小室检测VSMC迁移数;用免疫细胞化学技术检测促VSMC迁移血小板源性生长因子B链（PDGF）的表达。结果：（1）Ad-ASBTEB2转染明显抑制VSMC的BTEB2蛋白表达;（2）Ad-ASBTEB2组VSMC迁移数较未转染组（P〈0．01）和Ad．LacZ组（P〈0．01）显著减少;（3）Ad-ASBTEB2组PDGF-BB表达较Ad．LacZ组和未转染组显著降低。结论：BTEB2反义基因转染显著抑制AngⅡ诱导的VSMC的迁移,这种抑制作用可能是通过减少促迁移因子的表达而实现的。     

转染金属蛋白酶抑制剂2基因对损伤血管平滑肌细胞核因子—κB和蛋白激酶C的影响

目的探讨血管平滑肌细胞(VSMC)损伤后金属蛋白酶(MMPs)和蛋白激酶C(PKC)、核因子-κB(NF-κB)表达的变化.方法采用脂质体对VSMC转染金属蛋白酶抑制剂2(TIMP-2)基因进行基因转染,并用Western blot加以鉴定,分别用酶谱分析法、凝胶电泳迁移率分析技术(EMSA)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学检测该细胞克隆MMPs、NF-κB的活性变化和PKCα mRNA、蛋白的表达水平.结果体外损伤的VSMC金属蛋白酶显著增加.PKCα、NF-κB在正常VSMC中很少表达,但在损伤的VSMC中这种表达非常显著,对兔VSMC进行lIMP-2转染后,损伤的VSMC MMP-2,9活性受抑制,并且PKCα、NF-κB的表达下调(P＜0.05).结论PKCα和NF-κB在MMPs合成及损伤VSMC迁移中有重要价值,TIMP-2能通过抑制平滑肌细胞PKCα、NF-κB信号途径来防止血管再狭窄.     

转染金属蛋白酶抑制剂2基因对损伤血管平滑肌细胞核因子-κB和蛋白激酶C的影响

目的　探讨血管平滑肌细胞 (VSMC)损伤后金属蛋白酶 (MMPs)和蛋白激酶C(PKC)、核因子 -κB(NF -κB)表达的变化。　方法　采用脂质体对VSMC转染金属蛋白酶抑制剂 2 (TIMP- 2 )基因进行基因转染 ,并用Westernblot加以鉴定 ,分别用酶谱分析法、凝胶电泳迁移率分析技术(EMSA)、逆转录 -聚合酶链反应 (RT -PCR)和免疫细胞化学检测该细胞克隆MMPs、NF -κB的活性变化和PKCαmRNA、蛋白的表达水平。　结果　体外损伤的VSMC金属蛋白酶显著增加。PKCα、NF -κB在正常VSMC中很少表达 ,但在损伤的VSMC中这种表达非常显著 ,对兔VSMC进行TIMP - 2转染后 ,损伤的VSMCMMP - 2 ,9活性受抑制 ,并且PKCα、NF -κB的表达下调 (P <0 .0 5 )。结论　PKCα和NF -κB在MMPs合成及损伤VSMC迁移中有重要价值 ,TIMP - 2能通过抑制平滑肌细胞PKCα、NF -κB信号途径来防止血管再狭窄。     

血管外膜介导的炎症反应对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 观察血管外膜介导的炎症反应对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响,并探讨其机制.方法 采用兔颈动脉外膜组织与平滑肌细胞共培养方法,分以下6组,①单独培养组:培养的VSMC中不加外膜组织及药物;②单独培养 脂多糖(LPS,1μg/ml)组;③单独培养 LPS N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME,100mmol/L)组;④复合培养组:培养的VSMC中加入外膜组织块;⑤复合培养 LPS组;⑥复合培养 LPS L-NAME组.用氚-胸腺嘧啶(3H-TdR)检测各组VSMC增殖状态,试剂盒测定培养液中抗超氧阴离子自由基及亚硝酸盐(NO2-)含量,蛋白免疫印迹法检测血红素加氧酶-1(HO-1)蛋白表达.结果 与单独培养组比较,LPS刺激前,复合培养组VSMC 3H-TdR掺入率、NO2-含量无明显差异,抗超氧阴离子活力单位增高(P＜0.05),HO-1蛋白表达显著增加(P＜0.01);LPS刺激后,复合培养 LPS组VSMC 3H-TdR掺入率显著降低(P＜0.01),抗超氧阴离子活力单位显著增高(P＜0.01),NO2-含量增高(P＜0.05),HO-1蛋白表达显著增加(P＜0.01);复合培养 LPS L-NAME组VSMC 3H-TdR掺入率、NO2-含量、HO-1蛋白表达无明显差异,抗超氧阴离子活力单位显著增高(P＜0.01).结论 血管外膜可通过一氧化氮(NO)及HO-1等途径抑制LPS刺激所致的VSMC增殖.     

VS MC转染表达AT2R对AT1R表达的影响

目的　探讨血管平滑肌细胞 (VSMC)转染表达血管紧张素Ⅱ (AngⅡ ) 2型受体 (AT2R)后其 1型受体 (AT1R)表达所受的影响。方法　用同源重建方法构建带AT2R基因的重组复制缺陷型腺病毒载体(AdCMV AT2R) ,体外转染VSMC ,分别用流式细胞仪检测AT1R、AT2R细胞转染表达率、免疫组织化学法和免疫荧光法检测其膜表达、RT PCR法和蛋白印迹法检测其mRNA和蛋白表达。结果　AdCMV AT2R转染后 ,在不同浓度AngⅡ刺激下AT1R、AT2R在VSMC的细胞转染表达率如下表。如果表明随着转染表达时间延长 ,AT2R细胞表达率呈显著增加趋势 ,4 8小时最高表达率达 89.5 1% ,AngⅡ作用与否及不同浓度AngⅡ作用对AT2R表达无显著影响。而转染前后AT1R表达相对较稳定 ,受不同浓度AngⅡ作用 ,其表达明显呈增加趋势。AT2R峰值表达时 ,免疫组织化学法和免疫荧光法检测其膜表达结果也提示AT2R表达随转染表达时间延长显著增加 ,转染前后AT1R表达无明显变化 ,在一定浓度范围内 ,AngⅡ刺激对AT2R表达无显著影响 ,却显著增加AT1R的膜表达。RT PCR法和蛋白...     

转录调节因子Ets-1在血管平滑肌细胞增殖与凋亡中的作用

目的　研究转录调节因子Ets 1对血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖与凋亡的影响及其可能的机制。方法　采用定量细胞DNA片段的方法观察转染质粒Ets 1后VSMC增殖与凋亡情况 ,观察共转染Ets 1和反义P2 1WAF1 CIP1对细胞增殖与凋亡的干预作用。应用Western印迹法研究转染质粒Ets 1后磷酸化视网膜母细胞瘤 (RB P)蛋白表达情况。结果　定量细胞质DNA片段方法发现Ets 1抑制VSMC凋亡。反义P2 1WAF1 CIP1能够阻断Ets 1的抗凋亡作用 ,并抑制Ets 1诱导的VSMC增殖。Western印迹法发现Ets 1能够上调RB P蛋白表达 ,反义P2 1WAF1 CIP1可以阻断视网膜母细胞瘤 (RB)蛋白磷酸化。结论　在VSMC中 ,Ets 1通过P2 1WAF1 CIP1旁路发挥抑制凋亡和促进增殖作用     

腺病毒介导血管紧张素Ⅱ2型受体基因转染对血管平滑肌细胞生物学行为的影响

为探讨血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）2型受体（AT2R）基因表达对血管平滑肌（VSMC）增殖,迁移和凋亡等生物学行为的影响,用同源重组方法构建带AT2R基因的重组复制缺陷型腺病毒载体（AdCMV-AT2R),体外转染VSMC,用流式细胞仪检测AT2R转染表达率,RT－PCR方法检测AT2RmRNA表达,VSMC增殖用MTT比色法和5－溴脲苷（BrdU)掺入法检测,迁移用改良Boyden趋化小室法检测,细胞凋亡用流式细胞仪、原位末端标记法检测,结果表明,AdCMV-AT2R转染后,VSMC表达率为89．51％,AT2R峰值表达时,MTT吸光度和BrdU掺入量分别降低61．4％和51．6％（P＜0．01）VSMC的跨膜迁移数减少62．2％（P＜0．05）。细胞凋亡增加约3．2倍,bax表达增加76．3％（P＜0．05）。提示AT2R表达可介导报制VSMC的增殖和迁移,并诱导其发生凋亡。     

siRNA抑制STAT3基因对HepG2细胞辐射敏感性的影响

目的 研究瞬时转染的siRNA抑制STAT3基因表达对人肝癌HepG2细胞辐射敏感性的影响。方法 以人肝癌HepG2细胞作为研究对象，脂质体包裹化学合成的siRNA进行转染。采用实时RT-PCR和Westernblotting法分别从mRNA水平和蛋白水平检测STAT3基因的表达及编码蛋白磷酸化活化的改变，用CCK-8法和Hoechst33258DNA染色法检测辐射敏感性的变化。结果STAT3特异性的siRNA转染后HepG2细胞中STAT3基因mRNA拷贝数、STAT3蛋白表达和磷酸化水平均明显降低。mRNA水平的抑制效率可达70％。siRNA转染联合60Coγ射线照射后HepG2细胞增殖活力显著低于对照组（P〈0．05）。结论 针对人STAT3基因的siRNA能够抑制HepG2细胞STAT3基因的表达，降低STAT3蛋白活化水平，进而产生辐射增敏作用。     

EMMPRIN基因表达对胶质瘤U251细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨特异性小分子干扰（small interference,siRNA）抑制人脑胶质瘤U251细胞株内细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN）基因的表达后,对U251细胞株增殖、凋亡的影响。方法构建EMMPRIN基因小干扰RNA,转染人胶质瘤U251细胞株,运用半定量RT-PCR及Western blot的方法验证转染组及对照组的胶质瘤细胞EMMPRIN基因mRNA及蛋白的表达水平,通过MTT法观察转染48 h后对U251细胞增殖的变化,流式细胞术观察转染48 h后U251细胞周期及凋亡的改变。结果 EMMPRIN基因的特异性siRNA转染U251细胞后,EMM-PRIN基因的mRNA和蛋白表达水平明显降低,细胞增殖明显受到抑制,细胞凋亡增加。结论 EMMPRIN基因的特异性siR-NA能抑制胶质瘤U251细胞株的增殖,促进细胞凋亡。     

7-乙酰基-鲁山冬凌草甲素诱导HL-60细胞周期阻滞及其机制研究

目的研究7-乙酰基-鲁山冬凌草甲素（7-acetyl-lushanrubescensin A,ARA）对人急性髓系白血病细胞株HL-60的细胞增殖和细胞周期的影响,并对其作用机制进行探讨。方法MTT法检测ARA对HL-60细胞增殖的影响;在ARA作用HL-60细胞不同时间后,流式细胞仪检测细胞周期变化;Western印迹检测周期相关蛋白Rb、p（phospho）-Rb（ser795）、p-Rb（ser807/811）,细胞周期蛋白（cyclin）D1、cyclin D3、cyclin E2、CDK4及CDK6的蛋白表达;流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）水平。结果ARA剂量依赖性地抑制HL-60细胞增殖,48h的IC50为（1.96±0.08）μmol/L。ARA诱导HL-60细胞发生明显的细胞周期G0/G1阻滞,具有时间和浓度依赖性。机制研究显示ARA引起Rb总蛋白出现移行条带,并抑制p-Rb（ser795）位点磷酸化,显著抑制CDK4的蛋白表达,并部分降低cyclin D3和cyclin E2的表达水平,但对cyclin D1和CDK6的作用则不明显。此外,ARA显著增加HL-60细胞内ROS水平,而抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）能够阻断ARA诱导的ROS升高及细胞周期阻滞。结论ARA能够明显抑制白血病细胞增殖,诱导细胞周期阻滞,其机制可能与抑制Rb活化和降低cyclin D3、cyclin E2和CDK4的表达水平相关,并且ROS在ARA介导的生物学效应中可能有重要作用。     

hTERT基因修饰对人外周血树突状细胞生物学行为的影响

目的观察人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因修饰对树突状细胞生物学行为的影响。方法用负载hTERT目的基因的复制缺陷型腺病毒（rAd—hTERT）感染原代培养的人树突状细胞（DC）以获取hTERT基因修饰的DC（DC—hTERT）,采用免疫组化及Westem blot法检测DC-hTERT内hTERT及增殖细胞核抗原（PCNA）的表达;采用流式细胞术检测DC-hTERT表面成熟标志的变化;采用MTT法检测DC-hTERT的增殖能力。结果rAd-hTERT感染DC后hTERT蛋白表达明显增加;流式细胞术检测显示,感染Ad-hTERT后DC表面成熟指标CD83及CD86无明显变化;成熟1312经hTERT修饰后的生长曲线显示,DC-hTERT在前2周数量稍有增加,但DC/PBS及DC/rAd-LacZ数量明显下降,在第3周三者数量均有下降趋势,但DC-hTERT组细胞数量仍明显多于其他两组;Western blot检测显示DC-hTERT内PCNA的表达明显增强。结论hTERT基因表达上调后,DC增殖能力明显增强,衰老速度延缓。     

环氧合酶2基因沉默诱导人肝癌细胞凋亡的作用观察

目的 观察作用于环氧合酶2(COX-2)mRNA的发卡状COX-2(COX-2 shRNA)真核表达质粒对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响.方法 设计靶向COX-2基因的RNA干扰序列,构建COX-2 shRNA表达载体,用阳离子脂质体Lipofectamine 2000转染体外培养的HepG2细胞.半定量RT-PCR检测COX-2 mRNA表达水平的变化,筛选有效抑制COX-2基因表达的序列.采用CCK-8细胞计数法检测COX-2 shRNA对细胞增殖的影响,流式细胞仪测定细胞凋亡率和细胞周期,Western blotting检测细胞内COX-2和Bcl-2蛋白表达水平.结果 测序结果显示成功构建了2个表达COX-2shRNA的质粒载体,转染HepG2细胞后COX-2 mRNA表达下降至阴性对照组的41.66％和77.79％.选择沉默效率较佳者转染细胞并经G418筛选,获得稳定表达COX-2 shRNA的细胞,胞内COX-2 mRNA表达水平下降了75.30％,细胞增殖活性下降了 29.33％.在稳定表达COX-2 shRNA、错义序列以及未转染的细胞中,细胞凋亡率分别为17.83％、4.63％和4.47％,G0/G1期细胞比例分别为73.93％、61.2％和57.630％,而S期细胞比例分别为13.43％、26.03％和26.90％.Westernblotting检测显示,表达COX-2 shRNA的HepG2细胞内COX-2蛋白水平下降至表达错义序列组的31.25％(P＜0.01),Bcl-2蛋白水平下降至表达错义序列组的54.93％(P＜0.01),而转染错义质粒组与未转染组之间比较差异无统计学意义.结论 构建的真核表达载体pSilencer 2.1-U6-COX-2 shRNA能有效沉默人肝癌HepG2细胞内COX-2基因的表达,并具有抑制细胞增殖、促进细胞凋亡和细胞周期阻滞、降低胞内抗凋亡蛋白(H)Bcl-2水平的作用.     

Enhanced antiproliferative effects of combination hexokinase II shRNA and NIS gene therapy on vascular smooth muscle cells

IntroductionThis study was designed to determine the antiproliferative effects of combination gene therapy using sodium iodide symporter (NIS)-based radioiodine and lentivirus-mediated short hairpin RNA (shRNA) against hexokinase II (HKII) on vascular smooth muscle cells (VSMCs).MethodsA7r5 rat VSMCs were stably transfected with a dual-expression vector of NIS and Fluc (A7r5-NL cells). Functional assessment was performed by radioiodine uptake assay, luciferase assay and confocal microscopy. After exposure to lentivirus-HKII-shRNA, the ¹⁸F-FDG uptake test and HK activity assay were performed. The effects of combination therapy with ¹³¹I and lentivirus-HKII-shRNA on VSMCs were assessed with an in vitro clonogenic assay. In vivo bioluminescence and nuclear imaging were undertaken using a xenografted mouse model.ResultsIn vitro functional assessment confirmed expression of NIS and Fluc genes in A7r5-NL, but not in parent A7r5 cells. Transfection of lentivirus-HKII-shRNA resulted in a significant decrease in messenger RNA expression of the HKII gene, ¹⁸F-FDG uptake and HK activity. The cell survival rate of A7r5-NL decreased to 61.9% and 90.5% by single therapy with 7.4 MBq of ¹³¹I or lentivirus-HKII-shRNA, respectively, and further decreased to 42.9% by combined therapy (P<.05). In vivo bioluminescent and gamma camera images clearly demonstrated optical signals and ^99mTc pertechnetate uptake at the site of A7r5-NL cell inoculation in nude mice.ConclusionThe enhanced antiproliferative effect on VSMCs was achieved by a combination of NIS-based radioiodine and lentivirus-mediated HKII shRNA gene therapy. Successful demonstration of in vivo dual reporter gene imaging assures the potential for further application in an animal model.     

siRNA沉默EPAS1基因对低氧条件下大鼠PASMCs增殖的影响

目的 探讨应用siRNA技术沉默EPAS1 (HIF-2α)基因表达对低氧条件下培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的影响.方法 原代培养大鼠PASMCs共采用免疫荧光法进行鉴定.构建特异性EPAS1 siRNA脂质体,转染PASMCs,从3个干扰靶点中选取效果最好的靶点进行干扰;在常氧(37℃、5％CO2、20％O2)和低氧(37℃、5％CO2、2％O2)条件下分别培养24、48、72h,采用Western blotting检测PASMCs中EPAS1、VEGF蛋白的表达水平,CCK-8法检测细胞增殖情况.结果 成功分离培养原代大鼠PASMCs并经免疫荧光鉴定证实.将特异性的EPAS1 siRNA脂质体转染到PASMCs,选择干扰效果最好的靶点2进行干扰.与常氧条件比较,低氧条件下PASMCs中VEGF蛋白的表达及细胞增殖水平均明显升高;沉默EPAS1后,无论低氧还是常氧条件下,PASMCs中VEGF蛋白的表达及细胞增殖水平均明显降低.结论 EPAS1基因参与了低氧条件下大鼠PASMCs增殖的调控,其调节可能是通过VEGF介导完成的.     

LON基因下调对人乳腺癌细胞系MCF-7的增殖以及药物敏感性的影响

目的：应用RNAi的方法抑制丝氨酸蛋白酶LON表达，研究该丝氨酸蛋白酶的表达与肿瘤增殖以及药物敏感性之间的关系。方法：以人乳腺癌细胞MCF-7为研究对象，通过RNAi下调LON基因表达，采用RT—PCR法、MTT增殖实验、流式细胞术等技术进行检测。结果：在瞬时转染与稳定转染细胞株中，RT—PCR结果证实LON基因的表达明显下调；MTT增殖实验结果显示，LON基因的下调可导致细胞的增殖能力降低，并且能够增加对化疗药顺铂的药物敏感性。流式细胞仪检测显示LON基因的下调对细胞周期没有显著影响。结论：通过RNAi下调LON基因能够抑制肿瘤细胞的增殖并且与顺铂有协同作用，其抑制作用未造成细胞周期的改变。     

p16基因对涎腺腺样囊性癌细胞增殖的影响

目的：探讨p16抑癌基因对涎腺腺样囊性癌（SACC）细胞系增殖的影响。方法：通过脂质体介导的基因转染方法，将p16基因导入涎腺腺样囊性癌细胞系，观察转染组、空载体组和未转染组细胞的生长情况。结果：转染p16基因的细胞系，其细胞生长速度，DNA合成，细胞增殖能力均下降，而未转染组则有相反结果。结论：p16基因能抑制涎腺腺样囊性癌细胞系的增殖。