凋亡抑制基因aven在急性髓系白血病的表达及其临床意义

本研究旨在探讨AML患者凋亡抑制基因avertmRNA的表达情况,分析其临床意义,为预后评估提供实验依据。应用实时荧光定量PCR方法检测69例初诊AML患者外周血白细胞avenmRNA的表达水平,分析avenmRNA的表达水平与患者的年龄、性别、白细胞数,血小板计数、血红蛋白和LDH水平、外周血和骨髓的原始细胞比例、FAB分型、患者的疗效和复发的关系,21名正常人的外周血作为对照。结果表明：69例初诊AML患者avenmRNA表达水平的中位值为37．2（11．72—178．93）％,正常人外周血白细胞aven mRNA表达水平中位值为28．81（10．81-50．98）％,AML患者avenmRNA表达水平明显高于正常人（p=0．006）。avenmRNA的表达水平与患者的年龄具有明显的相关性（r=0．25,P=0．039）,以AML患者中位年龄（44岁）为界分为2组,年龄大于／等于44岁组aven mRNA表达水平[中位值50．08％,（18．88—152．02）％]明显高于年龄小于44岁组[中位值32．41％,（11．72—178．93）％],（P=0．018）。aven mRNA的表达水平与患者Hb水平和FAB分型具有明显的相关性（r=0．29,P=0．019;r=0．253,P=0．036）。2个化疗疗程后avenmRNA表达水平低于中位值组的完全缓解率（25／30,83．33％）高于avenmRNA表达水平高于中位值组（21／30,70％）,但差别无统计学意义（P=0．22）。复发患者avenmRNA的表达水平与无复发者相比无明显升高（P=0．076）。结论：初诊AML患者凋亡抑制基因avenmRNA的表达水平明显升高,可能与AML的发病有关,但尚未发现基因avcilmRNA的表达情况与疾病的疗效和复发之间的关系。     

骨髓增生异常综合征患者骨髓及外周血中WT1及PRAME基因的表达研究

本研究探讨WT1及PRAME基因在骨髓增生异常综合征患者骨髓和外周血中的表达情况以及与核型异常、病态造血、血红蛋白值之间的关系。收集2009年7月至2012年6月在我院初诊的240例贫血患者,其中MDS203例（RCUD15例,RCMD25例,RAEB161例,RAEB255例,MDS—U23例,MDS-AML24例）,AA18例,其他良性贫血15例,PNH4例和14例健康供者的骨髓标本,并收集其中78例患者及14例健康供者的外周血,分别检测骨髓和外周血中WT1及PRAME基因的表达水平。结果表明,WT1及PRAME在MDS骨髓及外周血中的表达均高于正常组、AA组及良性贫血组（BM：WT1：P=0．000,0．000,0．000,PRAME：P=0．048,0．000,0．064;PB：WT1：P=0．012,0．000,0．011,PRAME：P=0．020,0．004,0．003）,其中高危MDS患者WT1及PRAME的表达均高于低危组,AA及其他良性贫血组,且WT1及PRAME在骨髓和外周血中的表达水平呈现良好的相关性（WT1：r=0．6028,P=0．001;PRAME：r=0．7628,P=0．000）,WT1或PRAME在骨髓与外周血中阳性率一致（P=0．167）;另外,骨髓中WTl的表达水平与核型异常相关（P=0．049）。结论：MDS患者骨髓及外周血WT1和PRAME的表达较正常人、AA及其他良性贫血患者升高,且随着病情进展,其表达增加;WT1和PRAME基因的表达上调是MDS很好的分子标记,联合运用WT1和PRAME基因表达水平检测能为MDS的临床诊断及预后判断和微小残留监测提供有用信息,且在骨髓取材不便的时候可用外周血代替监测。     

实时荧光定量PCR检测急性髓系白血病患者MLL-AF9融合基因表达的预后意义

本研究旨在探讨急性髓系白血病（AML）患者治疗过程中,应用实时荧光定量PCR（RQ-PCR）检测混合谱系白血病（MLL）的相关融合基因MLL-AF9的基因表达水平及其对监测微小残留病（MRD）的价值。应用RQ-PCR精确地定量检测433例初治AML患者中11例舭L-AF9融合基因阳性患者的表达水平,分析该基因表达水平的变化与临床表现的关系。结果显示：患者MLL-AF9融合基因表达水平初诊时为（1．3-55．28）％;5例单纯化疗患者之中有2例在第1个疗程结束后至第2疗程开始前,该融合基因表达水平〈0．1％,2例全部获得血液学完全缓解且存活;3例MLL-AF9融合基因≥0．1％,均未获得血液学完全缓解且仅1例存活。6例造血干细胞移植患者中,有4例在移植前1个月内该融合基因表达水平〈0．1％,全部患者存活且无复发;2例≥0．1％,均在移植后复发、死亡,且在骨髓细胞形态学复发前1个月内该基因表达水平均≥0．1％。结论：RQ-PCR检测MLL-AF9融合基因可以反映患者MRD的动态变化,与患者的临床预后存在内在相关性,是检测预后的良好指标。此外,RQ-PCR可能有早期检测分子生物学复发的潜力。     

实时定量荧光PCR检测白血病融合基因

本研究旨在建立实时定量荧光PCR的方法并检测CML、ALL、APL患者中融合基因的拷贝数,观察患者体内融合基因转录水平的变化。构建质粒标准品,制作标准曲线。检测49例患者的骨髓及外周血标本130份,对个别患者连续监测融合基因转录表达水平,结果表明：在82．4％（28／34）的CML患者中检测到BCR—ABL^p210阳性（BCR—ABLP210／ABL比值为0．01～3．19）,其中在1例CML急淋变患者检测到BCR—ABL^p210。和BCR—ABL^p190双阳性;在66．7％（4／6）的ALL患者中检测到BCR—ABL阳性,其中2例BCR—ABL^p210阳性,2例BCR—ABL^p190阳性;在77．8％（7／9）的APL患者中检测到PML—RARa融合基因阳性（PML—RARa／ABL比值为0．0014～3．199）,其中3例为长型,3例为短型,1例为变异型,检测结果为阴性的患者处于缓解期;连续监测患者融合基因转录表达水平与临床缓解和复发的变化情况相吻合。结论：实时定量荧光PCR技术成熟、操作简便,检测白血病融合基因结果准确稳定,对于临床明确诊断、具体分型、动态观测肿瘤负荷、选择治疗方案、评估治疗效果和预后都有较大价值,值得推广应用。     

Real Time PCR监测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的临床意义

目的通过Real Time PCR实时监测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的表达,探讨其在诊断及预后评价价值。方法采用荧光定量Real Time PCR反应技术检测39例慢性粒细胞白血病及其它血液系统疾病20例的bcr/abl融合基因表达水平。结果骨髓原始、外周血原始与bcr/abl融合基因拷贝数有显著相关性,初诊慢性粒细胞的bcr/abl融合基因表达水平普遍明显增高,经羟基脲±干扰素治疗后表达明显下降,复发或加速期患者可提前2-4个月左右早期发现,格列卫或移植治疗后,多数bcr/abl融合基因可转阴性。结论 bcr/abl融合基因检测对诊断慢性粒细胞白血病有重要价值,同样是慢性粒细胞白血病治疗和预后观察的决定性指标。     

实时定量PCR监测B细胞恶性肿瘤患者造血干细胞移植后的IgH水平及意义

本研究评价实时定量PCR(RQ-PCR)技术检测IgH水平对B细胞恶性肿瘤患者造血干细胞移植(HSCT)后残留肿瘤细胞监测的意义.采用家族一致性TaqMan探针联合等位基因特异性寡核苷酸(ASO)上游引物技术检测22例B细胞恶性肿瘤患者HSCT前后骨髓单个核细胞的IgH水平动态变化.IgH水平以内参基因GAPDH进行归一化.结果表明,RQ-PCR实验可重复灵敏度为1个拷贝.9例IgH单克隆重排患者,在HSCT后1个月骨髓中IgH的拷贝数较初治时明显降低(6.67×103/106 GAPDH vs 29/106 GAPDH,p＜0.01).3例移植后15个月IgH的拷贝数持续小于102/106 GAPDH,18个月后IgH水平为0的患者获得了完全的临床和分子遗传学缓解(CCyR);5例移植后3个月以内IgH拷贝数持续小于102/106 GAPDH,随后IgH拷贝数持续小于103/106 GAPDH的患者临床获得完全缓解(CR).1例患者移植后近3个月时IgH拷贝数为4.5×103/106 GAPDH,4个月时临床复发.RQ-PCR检测8例干细胞采集物的肿瘤污染水平为3.68×102(0-1720)/106 GAPDH,外周血采集物中的肿瘤污染小于骨髓[75(0-890)/106 GAPDH vs 1.1×103(527-1720)/106 GAPDH,p＜0.05].采集物可用于RQ-PCR检测的8例患者无论肿瘤污染程度如何,临床均无复发.采集物中肿瘤污染的水平与初治及移植后1个月的IgH水平呈正相关(r值分别为0.810、0.708,p＜0.05).结论RQ PCR能够有效监测B细胞恶性肿瘤患者移植后IgH水平动态变化.移植后3个月内IgH拷贝数大于103/106 GAPDH可能是预测患者复发的标志.     

多发性骨髓瘤患者免疫球蛋白重链基因重排的检测及意义

目的 探讨免疫球蛋白重链（IgH）基因重排在多发性骨髓瘤（MM）诊治中的应用。方法 采用半巢式PCR技术,分别用MM患者的IgH基因的CDR2和CDR3区的两组引物,对61份MM患者的骨髓和外周血单个核细胞进行扩增。结果 27份骨髓标本中,IgH基因重排Fr2A阳性率为70．4％（19／27）,34份外周血标本阳性率58．8％（20／34）。骨髓标本的Fr2A阳性率略高于外周血标本,而Fr3A的阳性率两者无明显差异。MM患者的IgH基因重排与Ig型别,临床分期及浆细胞数有关。IgG和IgH基因重排阳性率高于IgA型及轻链型;Ⅲ,期患者IgH基因重排阳性率高于Ⅰ,Ⅱ期患者;浆细胞数大于5％时,IgH基因重排阳性率略高;7例达临床完全缓解的患者中,仅有1例IgH基因重排Fr2A,Fr3A均转为阴性。结论 PCR技术检测MM患者IgH基因重排可作为诊断,疗效观察,预后判断及微小残留病监测的参考指标之一。     

Lyn激酶在伊马替尼耐药的慢性髓系白血病中的作用

本研究探讨Lyn激酶在伊马替尼耐药的慢性髓系性白血病（CML）中的作用。76例CML患者分为初治组、伊马替尼耐药组和伊马替尼治疗有效组,用Western blot方法检测CML患者骨髓单个核细胞中Lyn蛋白的表达水平,比较各组患者Lyn的表达差异,分析Lyn与I临床特征、BCR／ABL融合基因和染色体的关系。结果表明,76例CML均表达Lyn;伊马替尼耐药组Lyn表达明显高于正常对照组、初治组及伊马替尼治疗有效组（P〈0．05）,初治组和伊马替尼治疗有效组的Lyn表达水平与正常对照组无明显差别（P〉0．05）。Lyn表达水平与性别、年龄、平均血红蛋白水平、平均血小板计数、外周血幼稚细胞比例和脾脏大小无明显相关（P〉0．05）,但与初诊时外周血白细胞计数增高相关（P〈0．05）。Lyn表达与BCR／ABL融合基因定量无明显相关性（P〉0．05）;10例伊马替尼耐药的CML中,1例患者存在t（6;22）和t（2;9）改变,与Ph染色体共存,其余9例患者仅存在Ph染色体改变。结论：CML患者和正常人骨髓细胞均表达Lyn,Lyn在伊马替尼耐药的CML中表达明显增高,Lyn高表达与CML患者初诊时白细胞计数明显增高相关。     

B细胞淋巴瘤bcl-2基因重排与14号染色体微卫星改变的研究

目的 研究bcl-2/IgH基因重排与微卫星DNA改变在B细胞淋巴瘤发生发展中的作用以及bcl-2/IgH基因重排与微卫星不稳定和杂合性缺失之间的关系.方法 应用巢式PCR方法检测bcl-2/IgH基因重排;选取14号染色体上2个微卫星多态性标记,采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析法（PCR-SSCP）检测37例B细胞淋巴瘤中微卫星不稳定和杂合性缺失.结果 37例B细胞淋巴瘤中,bcl-2/IgH基因重排频率为24.3％ （9/37）;微卫星不稳定发生率为48.6％ （18/37）,杂合性缺失发生率为40.5％ （15/37）,其中D14S65位点微卫星不稳定和杂合性缺失频率较高,分别为29.7％（11/37）和27％（10/37）.经统计学分析结果显示：D14S65位点bcl-2/IgH基因重排与微卫星不稳定有关（P＜0.05）,与杂合性缺失无关（P＞0.05）;但D14S45位点bcl-2/IgH基因重排与微卫星不稳定和杂合性缺失无关（P＞0.05）.结论 D14S65是B细胞淋巴瘤中敏感的检测位点,bcl-2/IgH基因重排和微卫星不稳定性可能共同导致B细胞淋巴瘤的发生.     

核干细胞因子mRNA在原代白血病细胞中的表达

【目的】探讨急性白血病（AL）患者骨髓单个核细胞（BMNC）核干细胞因子（NS）基因的表达水平。【方法】采用半定量RT—PCR方法检测52例AL患者及20例骨髓正常的非恶性血液病（对照）的BMNCNS基因的表达水平。【结果】在52例AL患者的BMNC中均存在NS基因的表达,20例非恶性血液病对照的BMNC极低表达或不表达NS基因。急性淋巴细胞白血病患者和急性非淋巴细胞白血病患者NSmRNA的相对表达量均明显高于对照组（P〈0．01）。但在AL各亚型之间NSmRNA的表达无明显差异（P=0．253）,NSmRNA的表达水平与患者初诊时骨髓原始细胞数呈正相关,与外周血白细胞数及血小板数无关。【结论】Ns基因在AI。原代细胞中表达上调,但NSmRNA表达水平与AL患者某些临床特征无相关性。     

Quantitative PCR detection of t(14;18) bcl-2/JH fusion sequences in follicular lymphoma patients: comparison of peripheral blood and bone marrow aspirate samples

In patients with follicular lymphoma (FL), it is unresolved whether peripheral blood (PB) can replace bone marrow (BM) aspirate samples for detection of bcl-2/JH fusion sequences that result from the t(14;18)(q32;q21). We compare here the results of quantitative polymerase chain reaction (q-PCR) analysis for bcl-2/JH involving the major breakpoint cluster region (mbr) on paired PB and BM aspirate samples from 60 consecutive FL patients. There was a significant correlation between the level of bcl-2/JH fusion sequence obtained from PB and BM aspirate samples (r = 0.886), with 82% of samples showing less than one log of difference. Patients who had histological evidence of FL involving concurrent BM biopsy specimens had moderate to high levels of bcl-2/JH in both PB and BM aspirate samples, allowing unequivocal determination of translocation status (median bcl-2/JH to cyclophilin level was 8.014%). In contrast, patients with no detectable FL in their BM biopsy specimens often showed low levels of bcl-2/JH in both PB and BM aspirate samples (bcl-2/JH to cyclophilin median level = 0.006%), in a range similar to background levels that could be detected in patients without FL (n = 15, median bcl-2 mbr/JH to cyclophilin level = 0.002%). We conclude that PB can be used in place of BM aspirate samples to test for the presence of bcl-2 mbr/JH fusion sequence in FL patients and that either PB or BM aspirate testing yields a rough approximation of the degree of BM involvement by FL. However, in patients with minimal levels of bcl-2/JH in PB or BM aspirate samples, confirmation of this result by testing the primary tumor is recommended to confirm the presence of an identical bcl-2/JH fusion sequence and exclude false-positive results.     

B-NHL患者骨髓和外周血细胞克隆性IgH基因重排的检测及临床意义

为探讨骨髓(BM)和外周血(PB)细胞克隆性免疫球蛋白重链(IgH)基因重排在B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)分期、疗效及预后判断方面的价值,采用半巢式PCR,对治疗前B-NHL患者BM 46例和PB 38例及治疗缓解后的BM和PB 10例进行了该标志的检测.对照组为非肿瘤或非B细胞来源肿瘤患者的BM或PB共33例.结果显示在B-NHL组,治疗前形态学有瘤细胞侵犯的3例BM及2例PB,克隆性IgHCDR3重排阳性;在形态学未见异常的BM和PB中克隆性IgH重排阳性率分别为65.1%及44.4%,与B-NHL分期及有无全身症状无关.10例病理组织克隆性IgH重排阳性的病人,7例缓解后BM和PB重排转为阴性,处于持续完全缓解状态;2例行自体外周血干细胞移植后BM或PB重排持续阳性者复发;1例移植后10个月BM克隆性IgH重排阳性,仍处于完全缓解.对照组33例中仅1例克隆性IgH重排阳性,本方法的特异性为97%.研究提示,PCR法能早期诊断BM及PB的瘤细胞浸润.临床缓解期BM或PB克隆性IgH重排阳性预示可能近期复发,阴性者可能持续缓解,个别IgH阳性者仍长期生存,其机理有待进一步研究.     

儿童急性髓系白血病WT1基因的实时荧光定量RT-PCR检测及其临床意义

本研究建立实时荧光定量RT-PCR方法检测儿童急性髓系白血病WT1基因(AML)mRNA的表达并探讨其临床意义。采用SYBR G reen I实时荧光定量RT-PCR方法,检测30例初治AML患儿、12例缓解期患儿(30份)、18例复发患儿,30例细胞形态学正常人的骨髓标本中的WT1基因的表达水平,并动态检测20例初治患儿WT1基因的表达。以ABL为内参照,采用2-△△ct法计算其相对表达量。结果表明:①初治AML患儿WT1基因的表达高于正常对照组和缓解组(p<0.001);缓解AML患儿WT1基因的表达与正常对照组的差异无统计学意义(p>0.05);复发AML患儿WT1基因的表达与初治组的差异无统计学意义(p>0.05);②动态监测儿童AML20例显示,初治时W T1高表达,完全缓解后W T1表达水平下降,复发时W T1表达水平明显升高。20例中5例在临床复发前3-7个月表达水平开始上升。③动态检测的20例患儿初治时W T1阳性组和阴性组完全缓解率(CR)、3年总生存率(O S)无显著差异(p>0.05),治疗后第22-30天的W T1阳性组3年O S显著低于阴性组(p<0.05)。结论:SYBR G reen I实时荧光定量RT-PCR方法是一种快速有效,灵敏度高,特异性好的方法。WT1基因在儿童急性AML中表现为促癌基因的作用,WT1基因表达水平的变化有助于疗效评价,微小残留病的检测和预后判断。     

非霍奇金淋巴瘤bcl-2／IgH基因重排及微小残留病变的检测

探索bcl-2基因重排在非霍奇金淋巴瘤(NHL)的发生及演变中的作用,以bcl-2/IgH重排为克隆标志,建立敏感的检测淋巴瘤微小残留病变的方法。用多聚酶链反应(PCR)检测bcl-2/IgH基因重排,用系列稀释试验检测该方法的灵敏度。经检测9种恶性淋巴瘤细胞系中Su-DHL-4和Su-DHL-6有bcl-2/IgH基因重排,用系列稀释试验检测该方法的灵敏度为1:10~5。29例NHL石蜡包埋的组织标本中,共检出6例有bcl-2基因重排,其中滤泡型NHL(F-NHL)4例(36.4％),弥漫型NHL(D-NHL)2例(18.2％),全部在B细胞性NHL中检出。16例F-NHL患者中,4例外周血和骨髓中同时检出bcl-2(MBR)/IgH基因重排,化疗达CR后依然存在。结论提示,bcl-2基因重排主要与低度恶性的B细胞性淋巴瘤有关,重排方式以bcl-2(MBR)/IgH为主。bcl-2基因重排的检测为对滤泡性淋巴瘤微小残留病变的检测提供了一个快速、敏感、特异的方法,对该疾病的分期、疗效和预后的评估有一定的临床价值。     

急性髓系白血病TFPI-2基因表达及启动子甲基化的研究

本研究检测了组织因子途径抑制物-2（tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2）基因在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）患者骨髓单个核细胞中的表达水平及其甲基化状态,探讨其与AML发生、发展及危险度分层的关系.分离33例初治、19例完全缓解、12例复发/难治AML患者及15例单纯缺铁性贫血患者（对照组）骨髓单个核细胞,采用实时定量PCR （RT-PCR）检测TFPI-2 mRNA在其中的表达水平,采用甲基化特异性PCR （MSP）检测启动子CpG岛甲基化状态.结果表明,初治组、完全缓解组及复发/难治组TFPI-2 mRNA表达水平均低于对照组（P＜0.05）,复发/难治组TFPI-2 mRNA表达水平明显低于初治组（P =0.006）,与完全缓解组相比,初治组TFPI-2 mRNA表达水平也显著降低（P=0.030）;64例AML患者TFPI-2基因启动子甲基化频率为64.63％ （42/64）,其中初治组、完全缓解组和复发/难治组患者中TFPI-2基因启动子甲基化频率分别为66.67％（22/33）、52.63％ （10/19）和83.33％ （10/12） （P＞ 0.05）;甲基化AML患者与非甲基化AML患者骨髓单个核细胞中TFPI-2 mRNA的相对表达量分别为0.165（0.005-2.099）和0.597（0.011-2.787） （P ＜0.05）,在对照组骨髓单个核细胞中未检测到TFPI-2基因启动子的甲基化;初治组经2个疗程化疗后,完全缓解组（CR）骨髓单个核细胞TFPI-2 mRNA表达量显著高于未完全缓解组（PR＋ NR） （P=0.031）.结论：在AML中TFPI-2基因表达下调或沉默与启动子甲基化有关,TFPI-2基因表达水平及启动子甲基化状态可以作为AML分层及病情进展的指标.     

Detection of bcl-2/IgH rearrangements by quantitative-competitive PCR and capillary electrophoresis.

BACKGROUND: PCR is the primary method for detecting minimal residual disease in hematologic cancers. One such gene target is the bcl-2/immunoglobulin heavy chain (IgH) translocation found in a majority of cases of follicular lymphoma. METHODS AND RESULTS: We report an accurate method for quantitative detection of the bcl-2/IgH translocation marker of follicular lymphoma in a series of patients in various stages of remission and relapse who had been treated with a combination of ifosfamide, mitoxantrone, and etoposide (MINE) chemotherapy and monoclonal anti-CD20 antibody (Rituximab). The approach uses seminested PCR followed by analysis of the products on a fluorescent capillary electrophoresis system. The quantitation of bcl-2/IgH translocation-positive cells was sensitive and reproducible, capable of detecting as few as five malignant cells out of 300,000 normal cells. CONCLUSION: Quantitative PCR enables one to monitor the kinetics of tumor reduction in patients treated with MINE chemotherapy in combination with Rituximab.