结核分枝杆菌RD1区PPE68/GST融合蛋白表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌PPE68/GST融合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌JM109中诱导表达. 方法: 利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因,并将其定向克隆pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并转化E.coli JM109,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.采用GST蛋白纯化试剂盒进行重组融合蛋白纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组表达产物. 结果:成功构建原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并表达出约Mr 63 000大小的PPE68/GST融合蛋白,占总菌体的40%. Western Blot检测该融合蛋白能和结核患者多价抗血清发生反应. 结论:成功地构建了原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873,并在大肠杆菌得到表达.     

多功能转录因子CTCF重组质粒构建及其表达鉴定

目的 构建人CTCF cDNA全长及N端、Zn指、C端3个片段的原核融合表达载体,纯化融合蛋白并进行鉴定.方法 以编码CTCF全长序列的质粒为PCR模板,分别构建GST融合表达重组质粒pGEX-4T-2-CTCF,pGEX-4T-2-CTCF-N,pGEX-4T-2-CTCF-Zn,pGEX-4T-2-CTCF-C,转化大肠杆菌BL21,酶切、测序鉴定;优化IPTG诱导表达条件,并对亲和层析纯化的GST融合蛋白CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF进行Far-West-ern blot鉴定.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实构建成功.GST融合蛋白CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF-C均在大肠杆菌中成功诱导表达,融合蛋白经亲和层析纯化获得纯化蛋白.各纯化蛋白经SDS-PAGE和Far-Western blot鉴定,均为诱导表达蛋白质.结论 成功构建了GST融合表达CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF-C的重组质粒,对融合蛋白表达条件进行了优化.获得了高效表达的GST融合蛋白.     

GST/RIPX融合蛋白表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

目的 构建GST/RIPX融合蛋白基因表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达.方法 以质粒pcDNA3.1.RIPX为模板,通过BamH1和Xho1酶切位点将RIPX定向插入pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-RIPX,并转化E.coil DH5а,筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入化E.eoli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达.鉴定.结果 酶切及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-4T-2-RIPX,并用SDS-PAGE方法证实了GST/RIPX融合蛋白的表达.结论 成功构建了RIPX原核表达载体,并证实了融合蛋白的表达,为进一步纯化RIPX蛋白和研究RIPX的生物学功能奠定了基础.     

GST-hZimp10融合蛋白的重组及抗体制备

目的:构建pGEX-4T-1/hZimp10重组质粒,并在大肠杆菌中表达,纯化出GST-hZimp10融合蛋白,用以制备抗hZimp10抗体。方法:采用PCR技术以pcCDNA3.1-Flag-hZimp10为模板,扩增出hZimp10蛋白N端128个氨基酸对应DNA片段,并将其与谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-4T-1进行重组,酶切鉴定后获得重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达,获得GST-hZimp10融合蛋白,纯化后将其作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting法检测抗体特异性。结果:经BamHⅠ和XhoⅠ 双酶切鉴定,确定PGEX-4T-1/ hZimp10重组质粒中包含384bp的片段,与测序结果一致,表明pGEX-4T-1/hZimp10重组质粒构建成功。SDS-PAGE电泳,融合蛋白成功表达,蛋白相对分子质量大小与预期相符。间接ELISA法检测抗hZimp10抗体效价可达1:100 000以上。Western blotting法,hZimp10在LNCaP细胞中具有很高的特异性。结论:成功获得GST-hZimp10融合蛋白,且制备了抗hZimp10抗体。     

迁移侵袭抑制蛋白 MIIP 基因 K167E 位点突变体的构建和表达

目的构建人迁移侵袭抑制蛋白（MIIP）蛋白K167E突变体的原核表达载体pGEX-4T-1-MIIP（K167E）并进行表达和纯化,为MIIP的后续功能研究提供有效工具。方法以pGEX-4T-1-MIIP重组质粒为模板,PCR扩增得到人MIIP基因（K167E）突变体的eDNA全长,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建获得pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体,经酶切鉴定及测序验证完全正确后,将其转化至大肠杆菌B121细胞中诱导表达,纯化获得GST—MIIP（K167E）融合蛋白。结果酶切鉴定和测序结果显示,pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体表达载体构建成功。经诱导表达及纯化后,成功获得的GST—MIIP（K167E）融合蛋白。结论成功构建了pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体表达载体,并获得了GST—MIIP（K167E）融合蛋白。     

GST-CTCF融合蛋白原核表达载体的构建及表达

目的构建人CCCTC结合因子(CCCTC-binding factor,CTCF)与谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase,GST)重组蛋白的原核表达载体,并进行诱导表达。方法以pEASY-T1-SIMPLE-CTCF为模板,设计引入限制性酶切位点的CTCF引物,PCR方法扩增目的片段,产物经限制性内切酶酶切后与原核表达载体pGEX-4T-1连接,构建成pGEX-4T-1-CTCF原核表达载体,转化至大肠埃希菌BL21中,经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)进行诱导,Western blot检测GST-CTCF融合蛋白的表达情况。结果经菌液PCR、质粒双酶切分析、基因测序分析证实重组表达质粒pGEX-4T-1-CTCF构建成功,GST-CTCF融合蛋白产物经Western blot鉴定为特异性表达。结论成功构建了pGEX-4T-1-CTCF原核表达质粒,获得特异性的GST-CTCF融合蛋白,为进一步研究转录因子CTCF的功能奠定了基础。更多还原     

重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1的构建及表达

目的:构建人肿瘤相关抗原MAGE-1基因原核表达载体.方法:从人肝细胞性肝癌组织中提取总RNA,RT-PCR扩增出MAGE-1基因.酶切鉴定后,将其插入pGEM-T载体,再克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1.将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4 h,SDS-PAGE及凝胶密度扫描分析目的蛋白的表达情况.结果:RT-PCR扩增出长度为927 bp的MAGE-1基因.重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1转化大肠杆菌BL21(DE3)后经诱导表达,目的蛋白约57 000,占菌体总蛋白的23%.结论:成功构建出重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1,该载体在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达.     

巢蛋白样结构域蛋白的表达?纯化与鉴定

目的:重组构建原核表达载体以正确表达巢蛋白样结构域(nidogen domains,NIDO)蛋白,并进一步纯化与鉴定?方法:PCR法拼接NIDO基因,经T-A连接亚克隆至pMD19-T载体,测序鉴定?采用质粒抽提?纯化?酶切?连接?感受态细胞制备和转化等技术,构建并鉴定原核表达载体pGEX-4T-1-NIDO?药物诱导方式诱导NIDO-GST融合蛋白的表达?对表达产物进行分离,用SDS-PAGE检测上清与包涵体沉淀中目的蛋白的表达量?对包涵体进行变性和透析复性后,进行GST亲和层析纯化?采用SDS-PAGE和质谱分析,鉴定纯化的目的蛋白?结果:测序证实了NIDO基因的正确合成和pMD19-T-NIDO克隆载体的构建?原核表达系统pGEX-4T-1-NIDO构建成功,在大肠杆菌BL21中被诱导,获得高表达量的N-末端带有GST标签序列的重组融合表达蛋白(30%)?超声裂菌法分离的结果显示,目的蛋白在菌体沉淀中以包涵体形式居多?将包涵体变性?复性后用GST亲和层析纯化,纯化蛋白> 80%并经质谱鉴定证实?结论:成功构建原核表达载体pGEX-4T-1-NIDO,能正确表达NIDO-GST融合蛋白,GST亲和层析对于NIDO-GST融合蛋白有较好的纯化效果?     

迁移侵袭抑制蛋白MIIP的GST融合蛋白表达及生物学活性鉴定

目的构建人MIIP蛋白与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达及生物学活性鉴定。方法 RT-PCR扩增得到人MIIP基因全长编码序列,采用重组DNA技术将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建获得重组原核表达载体pGEX-4T-1-MIIP,经酶切鉴定及测序验证完全正确后,将其转化至大肠杆菌BL21细胞中,用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经纯化获得目的蛋白,用Western blot鉴定所得融合蛋白。结果构建了pGEX-4T-1-MIIP原核表达载体,在大肠杆菌中表达获得了GST-MIIP融合蛋白,经Glutathione Agarose纯化和Western blot检测,证实所得GST-MIIP融合蛋白具有生物学活性。结论成功获得了有生物学活性的GST-MIIP融合蛋白。     

弓形虫GRA7基因在大肠埃希菌中的表达

目的　在大肠埃希菌中表达致密颗粒蛋白(GRA7)。方法　将弓形虫GRA7基因克隆入原核表达载体p GEX- 4 T- 1,构建重组质粒p GEX- 4 T- 1/GRA7并转化大肠埃希菌BL2 1。IPTG体外诱导重组质粒菌的表达,对表达的GRA7融合蛋白进行SDS- PAGE和Western- blotting分析。结果　成功构建了p GEX- 4 T- 1/GRA7重组质粒,该重组质粒在大肠埃希菌中表达了目的蛋白,该蛋白能与抗GST抗体结合。结论　GRA7基因在大肠埃希菌中以GST融合蛋白的形式得到表达。     

pGEX-5X-1-hLMO4原核质粒构建及重组蛋白表达

目的:构建hLMO4的原核表达载体并诱导、纯化和鉴定其表达。方法:hLMO4全长编码基因经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)在BL21大肠杆菌中诱导GST-hLMO4融合蛋白表达,利用Glutathione Sepharose 4B纯化诱导的融合蛋白,并经Western blot鉴定结果。结果:hLMO4编码序列克隆至pGEX-5X-1载体中,双酶切鉴定片段大小为500 bp,在E.coli BL21中IPTG诱导融合蛋白的表达,分子质量约为49 000 Da,成功纯化出GST及GST-hLMO4蛋白,Western blot检测到蛋白表达。结论:构建了hLMO4基因原核表达载体,鉴定了GST-hLMO4融合蛋白表达。     

人Tau基因多表位肽段原核表达载体的构建与表达

目的构建含人Tau多表位肽段基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并纯化目的蛋白,检测Tau多表位DNA疫苗免疫小鼠后特异性抗体产生情况。方法以质粒pVAX1-Tau为模板,用PCR扩增人Tau多表位肽段基因,插入表达载体pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-TauP1/P2。将鉴定后的阳性重组质粒转入E.coli BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并采用GST法纯化、SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达。以TauP1/P2 DNA疫苗免疫小鼠获取血清,Dot-blot检测TauP1/P2特异性抗体产生情况。结果 PCR扩增出约300 bp的基因片段,克隆至表达载体后,经酶切和测序验证正确;获得了纯化的目的蛋白,并证实了GST-TauP1/P2融合蛋白的表达。Dot-blot检测到特异性TauP1/P2抗体的产生。结论成功构建和表达人Tau多表位肽段基因的目的蛋白GST-TauP1/P2,能够识别Tau多表位DNA疫苗免疫后小鼠产生的特异性TauP1/P2抗体。     

幽门螺杆菌儿童分离株中性粒细胞激活蛋白克隆及表达序列

目的：从幽门螺杆菌临床儿童分离株GZCH1基因组扩增中性粒细胞激活蛋白（NAP）基因,克隆入T载体,并亚克隆入表达载体pGEX-4T-1,进行测序及基因比对分析,为幽门螺杆菌疫苗研制奠定基础.方法：根据GenBank中幽门螺杆菌NAP序列,设计一对特异性引物扩增幽门螺杆菌临床儿童分离株NAP全长基因,与T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒进行酶切、测序鉴定,经EcoR Ⅰ、Not Ⅰ双酶切后与做相应酶切的pGEX-4T-1连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定,IPTG诱导重组蛋白表达,并对基因进行测序及比对分析.结果：以幽门螺杆菌儿童分离株GZCH1为模板,成功扩增了NAP基因,基因大小为435 bp,重组pGEX-4T-1-NAP双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示NAP在正确读框中,序列比对分析显示其与幽门螺杆菌J99株氨基酸一致性达99.2％,IPTG诱导后,pGEX4T-1-NAP/BL21在相应分子量（42.8 kD）可见融合蛋白的表达.幽门螺杆菌儿童分离株GZCH1 NAP序列已登录GenBank（登录号：GU301881）.结论：从幽门螺杆菌临床儿童分离株GZCH1中成功克隆了NAP基因,并获得重组蛋白的表达,为NAP幽门螺杆菌疫苗研制奠定了良好的基础.     

表皮生长因子受体胞外区的原核表达和鉴定

目的 克隆表皮生长因子受体(EGFR)胞外区段基因序列(EGFR ECD),构建重组融合表达载体.方法 采用常规PCR方法 扩增EGFR的胞外区DNA序列,并将扩增产物克隆入GST融合表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒pGEX-4T-1/EGFRECD,转化BL21(DE3)宿主菌;采用Sal Ⅰ和Not Ⅰ双酶切和序列分析鉴定插入序列的正确性:并用IPTG诱导工程菌,SDS-PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达.结果 双酶切鉴定表明,EGFR胞外区序列已经正确克隆到GST融合表达载体中,测序结果证实插入DNA序列与EGFR胞外区序列完全一致.SDS-PAGE电泳显示,融合蛋白在BL21(DE3)中以包涵体形式表达,重组融合蛋白GST-EGFRECD的表达量占菌体总蛋白的12%左右.经Western blotting分析证实,重组融合蛋白可以被EGFR特异性抗体所识别.结论 本试验成功克隆了EGFR胞外区DNA序列,构建了融合表达载体,并进行了融合蛋白的诱导表达和鉴定,可进一步用于EGFR功能及免疫学研究.     

MAGE-3目的基因原核表达载体的构建和表达

目的构建原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3并检测其在大肠杆菌（E．coli）BL21中的表达，为制备以黑色素瘤抗原-3（MAGE-3）基因片段为基础的肽疫苗及特异诊断试剂提供抗原打下基础。方法通过逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）法制备MAGE-3目的基因，以pGEM—T Easy为克隆载体，DGEX-4T-1为原核表达载体，将MAGE-3目的基因克隆至pGEM—TEasy载体和亚克隆至pGEX-4T-1载体上。筛选、鉴定阳性克隆并将其转化E．coli BL21．经IPTG诱导，12％SDS—PAGE电泳分离和Western Blot表达鉴定。结果正确构建了原核重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-3；在E．coli BL21中检测到含该重组表达质粒的转化菌表达出分子量35kD的融合蛋白；基因测序结果表明，阳性克隆中的MAGE-3目的基因序列与GenBank公布的已知序列完全一致。结论成功构建的原核重组表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3及其所表达的融合蛋白，为以MAGE-3目的基因为基础的肽疫苗及特异诊断试剂的研制提供抗原打下了基础；为后续实验提供了依据。     

骨桥蛋白融合蛋白的原核表达

目的：研究骨桥蛋白（Osteopontin ,OPN ）的作用及机制,探索可大量制备OPN的方法。方法利用重组DNA技术,将OPN 的cDNA片段插入到原核表达载体pGEX-4T-1中,转入大肠杆菌诱导表达GST-0PN融合蛋白。结果成功得到pGEX-4T-1-0PN表达载体且顺利获得大量融合蛋白。结论利用重组DNA技术,将OPN 的cDNA片段插入到原核表达载体pGEX-4T-1中可以制备大量OPN蛋白。     

A型流感病毒核蛋白原核表达载体的构建与表达

目的:构建A型流感病毒核蛋白(NP)的原核表达质粒,分析其在大肠杆菌中的表达状况.方法:采用逆转录聚合酶链式反应技术从A型流感病毒基因组中扩增出编码核蛋白的基因片段,克隆至pGEM-T Easy载体,PCR筛选阳性克隆并测序.经酶切后将目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL2(CDE3),PCR和酶切鉴定转化菌落.将阳性菌落经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析目的蛋白的表达.结果:RT-PCR扩增出NP基因序列,将其亚克隆至表达载体pGEX-4T-1构建成重组表达质粒,并在BL2(CDE3)中表达了NP融合蛋白.结论:成功构建A型流感病毒NP的重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达了NP融合蛋白.     

大鼠BTCe蛋白原核表达及功能鉴定

目的原核表达获得大量具有生物活性的大鼠BTCe蛋白。方法RT-PCR法从大鼠肾脏中扩增出150bp BTCe片段,插入原核表达载体pGEX-4T-2,构建质粒pGEX-BTCe。转化BL-21菌,IPTG低温诱导表达融合蛋白,亲和层析法纯化获得融合蛋白,凝血酶酶切后获得目的蛋白,经SDS-PAGE、Western blot及质谱鉴定。以0.5nmol/L BTCe作用于3T3-L1细胞连续培养4d,MTT法检测其促增殖能力。结果融合蛋白以水溶性形式分泌于大肠杆菌BL-21胞浆中。酶切后的目的蛋白经质谱证实其与BTCe蛋白氨基酸序列相符;作用于3T3-L1细胞可明显促进其增殖。结论大鼠BTCe蛋白在pGEX-4T-2原核表达载体可获得高效表达,所纯化蛋白具有促进3T3-L1细胞体外增殖的作用。     

一种合成人血小板因子4基因的简便有效方法

目的:用一种简便有效的方法合成hPF4基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行高效表达.方法:根据hPF4基因的序列,用touch-down PCR的方法合成hPF4基因,将合成的基因片断克隆到表达载体pCEX-4T-1中,构建了重组质粒pGEX-4T-1-hPF4,并将之转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达由谷胱甘肽转移酶和hPF4组成的融合蛋白.结果:用touch-down PCR的方法成功合成了hPF4基因.融合蛋白形成包含体,表达量约为全菌体蛋白的30%.结论:Touch-down PCR方法可作为合成其它目的基因的简便有效方法.BL21(DE3)/pGEX-4T-1表达系统能高效表达合成的hPF4基因,为下一步hPF4的纯化与生物学活性研究打下了基础.