增强型绿色荧光蛋白-C1转染示踪骨髓间充质干细胞

目的：应用增强型绿色荧光蛋白-C1（enhanced green fluorescent protein,pEGFP-C1）标记骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells,MMSCs）,以期为MMSCs的体内移植提供示踪方法。方法：在体外分离培养大鼠MMSCs,流式细胞仪检测细胞表型,以脂质体介导法转染质粒增强型绿色荧光蛋白基因,荧光显微镜观察基因表达。结果：pEGFP-C1在基因转染24 h后开始表达,48-72 h达高峰,12-14 d后有较多的表达。结论：由脂质体介导的质粒pEGFP-C1可较为安全、有效地转染MMSCs,是一种较为理想的干细胞示踪方法。     

NKX2．5基因修饰骨髓间充质干细胞对心肌梗死大鼠心功能的影响

目的：以NKX2．5融合绿色荧光蛋白基因（NKX2．5-pEGFP）质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,将基因修饰后MSCs移植入大鼠心肌梗死模型中,评价其对心功能的影响。方法：体外分离培养大鼠MSCs,构建NKX2．5-pEGFP基因质粒,以lip02000将质粒转染入MSCs。将基因修饰后MSCs植入心肌梗死后10d的大鼠心肌梗死区（MSCs组,n=20）,同时将注射等体积无血清改良依格尔（DMEM）培养液于心肌梗死区的大鼠作为DMEM组（n=20）。移植注射后4周,通过检测左心室射血分数（LEVF）、左室缩短分数（FS）等研究其对心功能的影响。结果：移植4周后,MSCs组大鼠LEvF[（79±4）％]较DMEM组[（47±3）％]显著提高（P〈0．01）,MSCs组大鼠FS[（48±9）％]较DMEM组[（25±6）％]显著提高（P〈0．01）。结论：移植NKX2．5基因修饰后的MSCs能够改善心肌梗死大鼠心功能。     

逆转录病毒介导外源基因高效感染大鼠骨髓间充质干细胞

目的 通过逆转录病毒系统将小鼠同源盒基因Soxl转移至大鼠骨髓间充质干细胞（rMSC）。检测外源基因的表达，感染效率及感染时间。方法 常规分子生物学亚克隆技术构建重组逆转录病毒载体，转染至包装细胞株PT67，制备含目的基因的重组逆转录病毒液，感染rMSC，并用带EGFP表达盒的pLEGFP-N1载体的逆转录病毒系统作为平行对照，评估感染率；使用Westernblot以及免疫组织化学的方法检测携带目的基因的重组逆转录病毒在rMSC中的感染和表达情况。结果 本实验成功地制备了pLXSN—Soxl重组逆转录病毒载体并制备出高滴度病毒颗粒；将病毒上清感染rMSC，EGFP阳性细胞为21％，感染时间持续20d，而对照脂质体转染法EGFP阳性细胞仅为3％。免疫组化及Westernblot显示用重组逆转录病毒液感染的rMSC可表达外源基因产物Soxl蛋白。结论 采用逆转录病毒介导的方法可以将外源性基因高效转移至rMSC中，并有外源性基因的稳定表达。     

增强型绿色荧光蛋白转染对大鼠骨髓间充质干细胞体外神经元样细胞分化的影响

目的:利用质粒载体将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)转染大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem cells-rMSC),研究EGFP对rMSC体外诱导分化神经元样细胞的影响.方法:以质粒为载体将EGFP基因转染rMSC,流式细胞仪检测转染后rMSC的表面标志物,并对转染EGFP的rMSC在体外向神经元方向诱导分化.结果:转染EGFP基因的rMSC与未转染的rMSC在细胞形态学和生长特性方面一致.转染EGFP基因的rMSC在细胞表面标志物上符合rMSC的特点,呈CD44(+),CD11b(-),CD45( -),经体外培养后可诱导分化神经元样细胞,并且2组诱导分化神经元样细胞阳性率差异无统计学意义(P＞0.05).结论:转染EGFP基因对rMSC在体外诱导分化神经元样细胞无明显影响,EGFP可作为研究rMSC分化潜能机制的有效示踪标志.     

增强型绿色荧光蛋白转染对大鼠骨髓间充质干细胞体外神经元样细胞分化的影响

目的:利用质粒载体将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)转染大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem cells-rMSC),研究EGFP对rMSC体外诱导分化神经元样细胞的影响.方法:以质粒为载体将EGFP基因转染rMSC,流式细胞...     

绿色荧光蛋白基因腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

[摘要] 目的：研究腺病毒载体绿色荧光蛋白基因（Ad-GFP）在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCc)转染和表达的量效关系及对细胞生物学特性的影响,探讨用该载体构建基因修饰BMSCc的可行性。方法：在体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞免疫表型,293细胞包装制备病毒,以不同滴度的Ad-GFP(1×103-1×1010 PFU/ml)转染BMSCc,细胞计数法分析转染率,倒置显微镜观察细胞形态学改变,CCK8法检测细胞增殖活性,用血清撤离加入β- 巯基乙醇诱导感染Ad-GFP的BMSCc向神经样细胞定向分化。结果：3-6代BMSCc表面标志CD34、CD45阴性而CD29、CD44阳性,当病毒滴度为1×107PFU/ml时感染率为55%,为1×109及1×1010PFU/ml感染率均为85%,但1×1010PFU/ml时出现细胞病理现象,7d荧光表达最强,28d 仍可见荧光表达,感染Ad-GFP的BMSCc经β- 巯基乙醇诱导可分化为神经元样细胞,神经元特异性烯醇化酶（NSE）阳性。结论：合适滴度的Ad-GFP可以高效感染BMSCc,对细胞的生物学特性影响较小不影响诱导分化功能,BMSCc可以作为Ad-GFP载体系统进行基因治疗的种子细胞。     

BMP7和EGFP重组腺病毒体外转染兔骨髓间充质干细胞的研究

目的 观测体外培养的兔骨髓间充质干细胞生物学特性,并转染重组腺病毒Ad5-EGFP-BMP7,观察BMP7与EGFP的表达情况.方法 通过密度梯度离心联合贴壁法,分离、纯化间充质干细胞;流式细胞仪检测细胞周期和表面标记;体外诱导间充质干细胞向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定.转染后,荧光显微镜及免疫细胞化学染色检测外源基因的表达.结果 原代及传代间充质干细胞为成纤维细胞样细胞;87%以上处于G0/G1期;CD44表达阳性,CD45表达阴性;经成骨细胞诱导后,碱性磷酸酶染色阳性,并有矿化结节形成;经成脂肪细胞诱导后,细胞内出现大量脂滴.转染Ad5-EGFP-BMP7后,荧光显微镜下可见EGFP表达阳性;免疫细胞化学染色显示细胞内BMF7表达阳性.结论 成功分离、纯化间充质干细胞,并鉴定其具有成体干细胞特性;重组腺病毒介导BMP7和EGFP体外成功转染间充质干细胞,并稳定表达BMP7、EGFP,为下一步实验奠定了基础.     

骨髓间充质干细胞表达分泌型蛋白IFN-β/EGFP对前列腺癌PC-3细胞增殖的影响

目的β干扰素(interferon-beta,IFN-β)/增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)真核质粒转染人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs),观察转染后的hMSCs(IFN-β-hMSCs)对前列腺癌细胞株PC-3增殖情况的影响。方法构建IFN-β/EGFP分泌型真核表达质粒pEGFP-N2-IFN-β,脂质体介导下转染hMSCs,使用荧光显微镜检测IFN-β/EGFP蛋白中绿色荧光的表达;ELISA法检测细胞上清中IFN-β的表达水平。将IFN-β-hMSCs与PC-3在Transwell培养体系中共培养,同时设立hMSCs共培养组、空质粒转染hMSCs共培养组、PC-3单独培养组为对照组,分别于共培养后第1、3、5天对PC-3进行台盼蓝染色,计数存活细胞数目。结果荧光显微镜下观察到IFN-β-hMSCs显示出绿色荧光,ELISA检测证实IFN-β-hMSCs的细胞上清中存在IFN-β的分泌表达。实验组PC-3细胞增殖受抑制,实验组与各对照组之间比较差异存在统计学意义(P<0.05)。结论分泌型蛋白IFN-β/EGFP在hMSCs中可获得表达且保持其各自的生物学特性,在Transwell共培养中可以有效抑制前列腺癌细胞增殖。     

骨髓间充质干细胞两种示踪方法的优缺点比较

【目的】探讨荧光染料CM-DiI直接标记和慢病毒感染法EGFP标记人骨髓间充质干细胞（hMSC）用于体内示踪的优缺点。【方法】利用FUGW质粒构建携带EGFP基因的慢病毒载体,并感染P3代hMSC,荧光倒置显微镜下观察细胞的感染效果及传代前后细胞EGFP表达情况的变化;CM-DiI直接标记P3代hMSC,观察CM-DiI标记对细胞生物学特性的影响及传代前后细胞标记效果的变化。分别将CM-DiI和EGFP标记的P3代hMSC移植入新生大鼠左侧脑室,2周后取大鼠脑组织行冰冻切片,比较两种标记方法用于体内示踪的效果。【结果】慢病毒感染hMSC 48h后,约40%细胞表达绿色荧光,体外培养1个月,EGFP阳性细胞数增至50%左右,荧光强度基本保持不变,细胞生长不受病毒转染的影响。CM-DiI标记hMSC 12h后,95%以上细胞呈现很强的红色荧光,1个月后,阳性细胞减少至50%左右,荧光强度也有一定程度降低,未见染料对细胞形态和生长产生明显影响。CM-DiI标记的hMSC移植后2周脑冰冻切片可以找到红色荧光的标记细胞,EGFP标记的hMSC移植后2周脑冰冻切片未找到绿色荧光细胞。【结论】CM-DiI和EGFP均可在体外高效标记hMSC,但CM-DiI标记的hMSC体内示踪效果优于EGFP标记。     

骨髓间充质干细胞两种示踪方法的优缺点比较

  【目的】 探讨荧光染料CM-DiI直接标记和慢病毒感染法EGFP标记人骨髓间充质干细胞(hMSC)用于体内示踪的优缺点&#65377;【方法】 利用FUGW质粒构建携带EGFP基因的慢病毒载体,并感染P3代hMSC,荧光倒置显微镜下观察细胞的感染效果及传代前后细胞EGFP表达情况的变化;CM-DiI直接标记P3代hMSC,观察CM-DiI 标记对细胞生物学特性的影响及传代前后细胞标记效果的变化&#65377;分别将CM-DiI和EGFP标记的P3代hMSC移植入新生大鼠左侧脑室,2周后取大鼠脑组织行冰冻切片,比较两种标记方法用于体内示踪的效果&#65377;【结果】 慢病毒感染hMSC 48 h后,约40%细胞表达绿色荧光,体外培养1个月,EGFP阳性细胞数增至50%左右,荧光强度基本保持不变,细胞生长不受病毒转染的影响&#65377;CM-DiI标记hMSC 12 h后,95%以上细胞呈现很强的红色荧光,1个月后,阳性细胞减少至50%左右,荧光强度也有一定程度降低,未见染料对细胞形态和生长产生明显影响&#65377;CM-DiI标记的hMSC移植后2周脑冰冻切片可以找到红色荧光的标记细胞, EGFP标记的hMSC移植后2周脑冰冻切片未找到绿色荧光细胞&#65377; 【结论】 CM-DiI和EGFP均可在体外高效标记hMSC,但CM-DiI 标记的hMSC体内示踪效果优于EGFP标记&#65377;     

逆转录病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因转染标记间充质干细胞

目的:为使间充质干细胞(MSCs)被绿色荧光蛋白(GFP)稳定标记,探讨通过逆转录病毒载体介导的GFP基因高效转染MSCs的方法,以便为研究在体干细胞分化奠定基础。方法:全骨髓法分离培养纯化大鼠MSCs,利用携带GFP基因的复制缺陷性逆转录病毒(R t-GFP)转染MSCs,荧光显微镜观察GFP阳性的MSCs。结果:R t-GFP转染后,80%~90%MSCs可激发出明亮的绿色荧光,且荧光不随培养时间延长和传代次数增加而衰减。结论:R t-GFP可以使MSCs获得长效稳定标记。     

绿色荧光蛋白小鼠骨髓间充质干细胞培养及其示踪的可行性

目的观察并比较两种小鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法及选取GFP-BMSCs作为移植实验示踪的种子细胞可行性。方法通过骨片培养法(A法)和全骨髓贴壁法(B法)培养扩增小鼠骨髓间充质干细胞,并参照不同的培养方法优化其换液方式;观察两种培养方法原代及传代GFP小鼠骨髓MSCs形态变化;取第3代细胞进行生长曲线测定及多向分化功能检测;观察GFP小鼠骨髓MSC经多次传代及诱导分化后绿色荧光的稳定性。结果 1)A法原代培养可见贴壁细胞增殖形成大小不等的克隆集落,并向周围进一步扩展、融合,而B法在原代培养时由于混杂较多血液系统细胞,传代至3、4代即可获得较纯的BMSCs;2)观察其生长曲线,A法细胞扩增速度快,纯度高,B法细胞由于受杂细胞的影响,扩增难度大;3)BMSCs可被诱导成脂肪细胞,油红O染色可见红色脂肪颗粒;在成骨分化过程中可见骨结节结构形成;4)GFP-BMSCs传代后生物学特性稳定,传代至5代及诱导分化后其GFP表达仍为强阳性。结论与传统全骨髓贴壁法相比,骨片培养法可在原代或1代就获得高浓度的足量干细胞,GFP-BMSCs经多次传代后荧光不减退,可作为体内细胞示踪。     

同种异体骨髓间质干细胞移植在大鼠肝内定居能力初步研究

目的 探索绿色荧光蛋白标记的大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)经不同途径移植到同种异体大鼠后其定居于肝脏的能力。方法 从大鼠骨髓中分离培养获取MSCs,以绿色荧光蛋白进行标记,体外扩增后,分别从大鼠尾静脉和门静脉注入同种异体正常和肝脏损伤大鼠体内,于移植后的第3、7天通过荧光定量PCR检测移植的MSCs在大鼠肝内的表达情况。结果 所有大鼠移植同源异体MSCs后全部存活,无意外死亡。从门静脉、尾静脉注入MSCs,在大鼠肝脏受损时其定居量大于非肝脏受损大鼠(P<0.05)。在肝细胞受损大鼠,从门静脉注入MSCs与从尾静脉注入比较肝脏定居量差异不显著(P>0.05)。非肝脏受损大鼠,从门静脉注入MSCs与从尾静脉注入比较细胞定居于肝脏量差异显著(P<0.05),并与移植后时间有关。结论 干细胞定居于肝脏的时间与细胞数量可能与肝脏是否受损伤关系密切,与移植途径关系不密切;在正常动物干细胞可定居于肝脏,定植的细胞量与移植途径和移植后时间有关。     

重组腺病毒介导的绿色荧光蛋白基因转染大鼠间充质干细胞的实验研究

目的 体外研究重组腺病毒载体介导绿色荧光蛋白基因转染大鼠间充质于细胞(MSCs)的方法.方法 用密度梯度离心及贴壁法相结合的方法分离纯化大鼠MSCs并进行鉴定,重组绿色荧光蛋白的腺病毒载体Ad-GFP转染,荧光显微镜检测其转染效率,CCK-8法检测转染细胞的增殖能力.结果 Ad-GFP对大鼠MSCs的感染率高达90.0%,感染1月后仍有稳定表达;转染细胞的增殖能力与未转染细胞相比,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 重组腺病毒载体Ad-GFP可高效感染MSCs,基因转染后细胞的增殖能力不受影响,可作为一种高效的大鼠MSCs的标记方法.     

同种异体骨髓间质干细胞移植在大鼠肝内定居能力初步研究

目的探索绿色荧光蛋白标记的大鼠骨髓间质干细胞（MSCs）经不同途径移植到同种异体大鼠后其定居于肝脏的能力。方法从大鼠骨髓中分离培养获取MSCs，以绿色荧光蛋白进行标记，体外扩增后，分别从大鼠尾静脉和门静脉注入同种异体正常和肝脏损伤大鼠体内，于移植后的第3、7天通过荧光定量PCR检测移植的MSCs在大鼠肝内的表达情况。结果所有大鼠移植同源异体MSCs后全部存活，无意外死亡。从门静脉、尾静脉注入MSCs，在大鼠肝脏受损时其定居量大于非肝脏受损大鼠（P〈0．05）。在肝细胞受损大鼠，从门静脉注入MSCs与从尾静脉注入比较肝脏定居量差异不显著（P〉0．05）。非肝脏受损大鼠，从门静脉注入MSCs与从尾静脉注入比较细胞定居于肝脏量差异显著（P〈0．05）．并与移植后时间有关。结论干细胞定居于肝脏的时间与细胞数量可能与肝脏是否受损伤关系密切．与移植途径关系不密切；在正常动物干细胞可定居于肝脏，定植的细胞量与移植途径和移植后时间有关。     

人胎盘来源间充质干细胞和大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征比较

目的:从人足月的胎盘羊膜中和Wistar 大鼠股骨及胫骨骨髓中分离、培养间充质干细胞（MSCs）,研究人胎盘来源MSCs（HPMSCs）和大鼠骨髓来源MSCs（BMSCs）的分离培养方法和生物学特征、表面标志及其多分化潜能。方法:将人足月胎盘组织通过胶原酶Ⅱ消化培养获取HPMSCs,采用全骨髓贴壁法从4周龄Wistar大鼠双侧股骨及胫骨中分离、纯化大鼠BMSCs,运用活细胞计数法检测其增殖能力,采用流式细胞术检测2种细胞表面标志物的表阳性率;
用地塞米松、维生素C和β磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,用茜素红染色鉴定;用胰岛素、地塞米松、IBMX和吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,以油红O染色鉴定。结果:HPMSCs为梭形贴壁细胞,增殖能力较强,CD44和CD34表达阳性率分别为94.45%和1.67%;BMSCs为圆形、梭形和多角形,增殖能力强,CD44和CD34表达阳性率分别为93.11%和2.68%。2种细胞经过成脂诱导液和成骨诱导液诱导后,茜素红和油红O染色结果均为阳性,表明2种细胞均可向脂肪细胞和成骨细胞分化。结论:HPMSCs与大鼠BMSCs的生物学特征相似,同样具有多分化潜能,HPMSCs具有更强的增殖能力。     

增强型绿色荧光蛋白基因转染兔间充质干细胞的实验研究

目的建立增强型绿色荧光蛋白标记间充质干细胞（MSCs）的方法,并观察标记方法对MSCs的分化功能影响。方法应用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、培养兔外周阻MSCs,以携带EGFP的腺病毒（Ad-CMV-EGFP）转染MSCs,荧光倒置显微镜下观察其瞬时表达及转染效率,并对转染后的MSCs进行诱导分化为内皮细胞以观察其部分分化功能。结果①MSCs于体外培养14～20d可达到80％～90％融合,细胞形态为梭形、多角形及纺锤状等。传代MSCs变为形态均一、排列有序的长梭形细胞,增殖活跃;②MSCs经携带EGFP腺病毒转染后24h即可表达EGFP,4～5d时表达最强,此后逐渐减弱,2wk时明显减弱,到4wk时无EGFP表达;③测定腺病毒转染MSCs效率约为60％;④经诱导后分化的内皮细胞呈铺路石样排列,CD31呈阳性表达。结论Ad．CMVoEGFP转染后的MSCs可有效表达EGFP,且本法转染效率较高,基本不影响细胞分化功能,是一种较好的MSCs标记方法。     

NKX6.1协同PDX1诱导人胎肝间充质干细胞分化为胰岛B样细胞

目的探讨NKX6.1对PDX1诱导人胎肝间充质干细胞(fetal liver-derived mesenchymal stem cells,FL-MSCs)向胰岛B细胞分化的协同作用及可能机制,以获取足够用于移植的胰岛B样细胞。方法构建含PDX1与NKX6.1双基因的重组腺病毒载体,用该载体感染FL-MSCs并联合相应的细胞因子分步诱导,检测诱导后的细胞中PDX1和NKX6.1基因以及NGN3、NeuroD1/Beta2、MafA因子和胰岛素等多种胰腺B细胞相关分子的表达情况。结果腺病毒载体转染24h后FL-MSCs细胞即开始表达PDX1与NKX6.1基因,检测显示诱导后的细胞先后开始表达NGN3、NeuroD1和MafA等因子,持续稳定表达胰岛素等B细胞相关分子;且这些分子表达存在时序性。结论PDX1与NKX6.1联合细胞因子在体外能有效诱导FL-MSCs分化为胰岛B样细胞;可能是通过先后活化的NGN3、NeuroD1和MafA等转录因子,限定细胞向内分泌前体细胞、进一步向B内分泌前体细胞、B细胞分化发育。