3D打印皮肤成体干细胞来源类器官人工皮肤修复小鼠皮肤缺损

目的构建3D打印皮肤成体干细胞来源类器官人工皮肤并探讨其修复小鼠皮肤缺损的效果。方法将人皮肤角质形成细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞以2∶1∶1制备细胞混合悬液, 在超低吸附培养板中培养, 倒置相差显微镜观察细胞球的形态变化。培养7 d后收集细胞球, 进行免疫荧光染色, 检测其真皮、表皮及血管标志物的表达情况及结构分布情况。采用3D打印技术打印类器官人工皮肤, 观察打印出的人工皮肤的形态。将10只免疫缺陷balb/c雌性小鼠按随机数字表法分为水凝胶组和类器官组, 每组5只。所有小鼠建立直径1 cm的全层皮肤缺损模型, 水凝胶组创面覆盖水凝胶敷料, 类器官组创面覆盖相同大小类器官人工皮肤。建模后0、4、8、12及16 d观察两组创面愈合大体情况及创面愈合率。建模后16 d时创面皮肤取材, HE染色观察创面表皮角化情况及表皮真皮连接情况, Masson染色观察创面胶原纤维的疏松致密程度及真皮层纤维厚度。结果 (1)角质形成细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞的细胞混合悬液在超低吸附培养板中可自聚集形成细胞球;倒置显微镜观察显示, 随着培养时间延长, 细胞球体积逐渐增大。(2)细胞球免疫荧光染色结果...     

TGFβ通路介导的低剂量5-氨基酮戊酸光动力疗法重塑光老化皮肤真皮胶原

目的:探索低剂量ALA-PDT重塑光老化皮肤真皮胶原的作用机制。方法:采用transwell共培养体系,通过Western Blotting、ELISA实验检测角质形成细胞中的TGFβ1的表达和真皮成纤维细胞中TGFβ通路的活化,光镜下细胞数量观察和增殖细胞核抗原(PCNA)免疫荧光实验检测成纤维细胞增殖活力,小鼠活检取材检测Pp IX的分布和真皮胶原的组织学改变。结果:低剂量ALA-PDT可诱导角质形成细胞表达TGFβ1;与低剂量ALA-PDT处理后的角质形成细胞共培养可激活真皮成纤维细胞的TGFβ通路,促进其胶原合成和增殖;低剂量ALA-PDT可重塑光老化小鼠真皮胶原,且Pp IX主要分布在表皮。结论:低剂量ALA-PDT诱导表皮角质形成细胞释放TGFβ1,活化真皮成纤维细胞的TGFβ通路,重塑真皮胶原。     

去分化来源表皮干细胞的分离、培养和鉴定

目的 分离培养去分化来源的表皮十细胞(dedifferentiation-derived epidermal stem cells,DDESCs),并进一步观察其表型特征.方法 包皮皮片去除皮下脂肪后,中性蛋白酶消化过夜,分离表皮和真皮.分离的表皮片用Ⅳ型胶原反复粘贴并冲洗去除表皮十细胞后,移植到BALB/c裸鼠背部全层皮肤缺损创面,移植5 d后收集皮片制备单细胞悬液,流式检测CK10、CK19和β1整合素阳性细胞白分数,然后用Ⅳ型胶原粘贴法分离皮片内DDESCs,并采用免疫荧光法和荧光定量PCR法分别检测去分化细胞内CK19、β1整合素、Oct4和Nanog的表达.结果 流式检测结果表明,皮片移植5 d后,CK10阳性细胞减少(P＜0.01),CK19和β1整合素阳性细胞增加(P＜0.01).Ⅳ型胶原粘贴分离DDESCs,结果表明,移植皮片组在10 min内约有4.56%的贴壁细胞出现.细胞的表型分析结果表明,DDESCs内CK19、β1整合素、Oct4和Nanog的表达量类似于原始表皮干细胞(P＞0.05),但明显高于成熟表皮细胞(P＜0.01).结论 DDESCs的表型特征与原始表皮干细胞相类似,提示去分化细胞有可能代替原始表皮干细胞应用于创伤部位的修复和再生.     

Wnt信号通路在创伤微环境诱导的表皮细胞去分化过程中的作用

目的 研究创伤微环境对表皮细胞的去分化诱导作用,并探讨Wnt通路在这一过程中的作用. 方法 包皮皮片去除皮下脂肪后,中性蛋白酶消化过夜,分离表皮和真皮.分离的表皮片用Ⅳ型胶原反复粘贴并冲洗去除表皮干细胞.处理后的表皮片经免疫组化鉴定后移植到BALB/c裸鼠背部全层皮肤缺损创面,5 d后用免疫组化法检测皮片内细胞的表型特征,RT-PCR和Western blot检测表皮细胞表型转化过程中Wnts分子及下游分子的表达变化. 结果 未经处理的表皮片基底部细胞呈CK10染色阴性,CK19和β1整合素染色阳性;Ⅳ型胶原处理后的表皮片内细胞全呈CK10染色阳性.而去基底皮片移植后5 d,在皮片的基底侧重新出现CK10染色阴性、CK19和β1整合素染色阳性的细胞.同时在移植皮片内Wnt-10b、Wnt-4和Wnt-7a mRNA的表达分别增加了3.1倍、2.2倍和1.4倍,而Wnt通路下游β-catenin、cyclin D1和c-myc蛋白表达分别增加了3倍、1.5倍和2倍(P<0.01). 结论 创伤微环境可诱导表皮细胞去分化,Wnt/β-catenin信号通路可能在这一过程中起关键性的调控作用.     

基质糖基化对角质形成细胞迁移功能损害的机制

目的 探讨糖尿病条件下大鼠创面愈合过程中角质形成细胞迁移功能受损的可能机制.方法 选用SD大鼠6只,取背部表皮进行角质形成细胞培养;制作并鉴定糖基化基质模型;评价糖基化基质对正常大鼠角质形成细胞迁移功能的影响;测定糖基化基质对正常大鼠角质形成细胞粘附功能、培养12,24 h黏附形态、伪足形成、微丝表达、整合素表达的影响.结果 糖基化层黏连蛋白对细胞迁移较对照组有明显抑制(P＜0.05);对细胞贴壁率无明显影响(P＞0.05),但抑制了细胞的伸展及伪足的伸出,干扰了微丝的聚集,降低了整合素的表达(P＜0.05).结论 正常大鼠皮肤角质形成细胞在糖基化基质上出现迁移功能受阻,这可能是与整合素信号传导出现障碍,引起整合素、肌动蛋白表达减少和微丝形成,从而引起丝状伪足和板状伪足形成减少有关.     

糖尿病大鼠表皮角质形成细胞生物学变化的机制研究

目的 通过体内、外2部分实验,研究糖尿病状态下表皮角质形成细胞(KCs )增殖能力的变化及其信号转导途径.方法 STZ(streptozotocin,链脲佐菌素)诱导正常SD大鼠,成模后8周(晚期糖尿病大鼠模型),荧光自显影技术检测皮肤组织中晚期糖基化终末产物(advanced glycation end-products,AGEs)的沉积;ELSA法检测表皮层中EGF(epidermal growth factor表皮生长因子)含量;提取大鼠KCs,用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)法测定细胞增殖速度;检测细胞周期;观察KCs核内NF-κB活性.分离培养正常SD大鼠KCs,加入不同浓度AGEs干预细胞,选择细胞反应敏感,差异显著的100mg/L AGEs干预组进行实验:测定细胞增殖速度;细胞对EGF的利用;检测KCs周期的变化,观察KCs核内NF-κB的活化状态.抑制NF-κB活性后观察细胞周期、细胞对EGF利用的变化.结果 晚期糖尿病大鼠KCs细胞周期循环阻滞,细胞的增殖能力受到了抑制;体外100mg/L AGEs可以明显抑制KCs的增殖.抑制NF-κB的活性后,部分恢复细胞的增殖能力.结论 AGEs可以通过NF-κB途径影响糖尿病大鼠表皮角质形成细胞的增殖能力.     

坏血病1例报告

坏血病是因食物中维生素Ｃ缺乏引起的营养障碍性骨疾病 ,现已少见 ,我院收住 1例报告如下。患者　女 ,10个月 ,人工喂养。臀部及双下肢水肿 40ｄ ,查体 :发育正常 ,精神差 ,贫血貌 ,全身皮肤粘膜苍白 ,干燥 ,未见瘀血斑点 ,弹性尚可 ,臀部及双下肢非凹陷性水肿。呈屈髋 ,屈膝外翻 ,小腿内收形如“蛙状”之被动体位 ,触痛明显 ,双下肢肌力 0级 ,生理反射存在。实验室检查 :血红蛋白 :98ｇ/Ｌ ,白细胞 10 .0× 10 9/Ｌ ,血小板 312× 10 9/Ｌ ,红细胞 2 .6× 10 12 /Ｌ ,骨髓象正常。Ｘ线表现 :双侧股骨近端先期钙化带形成一密度增高的带状阴…     

表皮干细胞体外分离与培养

探索和建立表皮干细胞体外分离与培养的技术方法。通过酶消化法获得幼鼠表皮 ,并制成单表皮细胞悬液 ,以表皮干细胞培养基 ,即无钙EMEM培养基 (添加 9%FBS ,0 0 5mmol/LCaCl2 ,4ng/mlEGF ,0 5ng/ml硫酸庆大霉素及 5 0 %成纤维细胞条件培养基 )置细胞培养箱内培养。成纤维细胞条件培养基为无钙EMEM培养基(添加 9%FBS、0 0 5mmol/LCaCl2 、0 5 μg/ml硫酸庆大霉素 )培养幼鼠皮肤块 4 8h后所得培养液。将 1×10 6/ml上述培养的角质形成细胞经TGG细胞消化液 37℃下振荡消化后 ,接种至鼠Ⅳ型胶原包被的培养瓶内 ,37℃下静置 10～ 15min,留用快速贴壁细胞继续培养 ,所得细胞分别以能否呈克隆状生长和透射电镜观察其超微结构及β1整合素、K19免疫细胞化学染色进行鉴定。结果显示 ,鼠Ⅳ型胶原包被的培养瓶内快速贴壁细胞经继续培养 ,可见细胞呈克隆状生长。电镜观察其超微结构示非成熟细胞特征 ,β1整合素、K19免疫细胞化学染色阳性。研究表明 ,表皮干细胞可在体外分离与培养 ,本实验方法为较好方法之一。     

人工表皮构建及其结构的研究

目的 :以角朊细胞作为种子细胞 ,构建人工表皮 ,检测培养的人工表皮的结构 ,为进一步进行动物移植试验奠定基础。方法 :(1)采用分散酶 (dispase)分离表皮细胞 ,以无血清培养法培养表皮细胞。 (2 )人工表皮构建成功后 ,分别进行HE染色及透射电镜观察。 (3)角蛋白免疫组织化学染色。结果 :经过 2～ 3周的培养 ,表皮细胞连接成片 ,呈现典型的“铺路石”状 ;继续培养 5～ 7d后 ,将细胞膜消化下来 ,HE染色显示由 2～ 4层细胞组成 ,电镜可以观察到桥粒及张力微丝束的结构 ;免疫组织化学染色显示培养细胞和细胞膜角蛋白染色阳性。结论 :该人工构建表皮与人正常表皮结构类似 ,可作为移植物进行深入研究     

肝内胆囊误诊为肝脓肿1例

肝内胆囊误诊为肝脓肿 ,此例病人经过经皮穿刺证实 ,回顾Ｂ超、ＣＴ扫描结果及结合临床资料报道如下。1　病历简介患者 ,男 ,6 8岁。发热、右上腹痛 1个月余 ,尿黄、目黄 10天。体检 :神志清楚、体温 38.5℃ ,皮肤巩膜轻度黄染 ,肝区扣击痛阳性 ,肝、脾肋下未及。实验室检查 :肝功能及酶谱 :总蛋白 6 1.4ｇ/Ｌ ,白蛋白 2 7.8ｇ/Ｌ ,丙氨酸氨基转移酶 5 2 μ/Ｌ(正常值0～ 30 μ/Ｌ) ,胆红素 82 .4μｍｏｌ/Ｌ ,(正常值 1.71～ 17.1μｍｏｌ/Ｌ) ,碱性磷酸酶 415 μＫ(正常值 30～ 90 μＫ) ,血常规 :白细胞 10 .1× 10 9/Ｌ ,淋巴细胞 0 .15…     

表皮细胞培养最佳条件的探索

目的：研究表皮细胞培养的最佳条件,为进一步将其作为皮肤组织工程种子细胞奠定基础。方法：以DMEM作为基础培养液,改变培养条件后,计数2周内克隆形成数,检测细胞增殖能力,确定最佳条件。结果：表皮细胞以分离酶分离可得到大多数基底细胞,在培养液pH值为7．0－7．2,钙离子浓度为0．4mmol/L,血清浓度为18％,温度为36℃,CO2浓度为6％时,表皮细胞克隆形成数量高。结论：在最佳培养条件下,表皮细胞生长状态良好,为人工表皮的构建奠定了基础。     

海绵状胶原膜作为真皮支架构建复合皮的研究

探讨以海绵状胶原膜作为真皮支架体外构建复合皮的可能性。由新鲜猪皮提取胶原后与硫酸软骨素混合，经真空干燥制成具有立体网状结构的膜片；取正常人包皮环切后的废弃皮肤组织，常规方法分离表皮细胞制成单细胞悬液，滴加于海绵状胶原膜上进行体外培养，观察表皮细胞的生长、增殖情况。结果显示，人表皮细胞种植于海绵状胶原膜上可生长、增殖，融合成片。提示此种海绵状胶原膜对人表皮细胞无明显毒性作用，可作为组织工程构建复合皮的真皮支架。     

去分化来源表皮干细胞的分离与鉴定

目的 分离培养和鉴定去分化来源的表皮干细胞.方法 采用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导表皮细胞去分化形成表皮干细胞,采用Ⅳ型胶原黏附法分离获得去分化来源的表皮干细胞.观察去分化来源表皮干细胞的形态及增殖特点,并通过免疫细胞化学、免疫荧光及流式细胞技术对其形态和表型进行鉴定.结果 去分化来源的表皮干细胞能够表达表皮干细胞及其亚群特异性的表面标志蛋白,如β1整合素、CK19、CK14等,而CK10的表达为阴性.激光共聚焦检测显示a6整合素和CD71在去分化来源表皮干细胞及其亚群中的分布均存在着区域性差异.此外,流式细胞检测结果显示去分化来源的表皮干细胞中主要包含a6+CD71-和a6+ CD71+的两种细胞群落,分别占被检测细胞总数的24.52%±7.88%及66.97%±5.04%.结论 去分化来源的表皮干细胞与机体自身来源的表皮干细胞在形态和表型上具有相似性,可以作为表皮干细胞的替代细胞应用于皮肤重建与再生的相关研究.     

利用HaCaT细胞构建新型组织工程皮肤检测模型

 目的 构建以人永生化角质形成细胞HaCaT为种子细胞的组织工程皮肤模型。方法 以丝素蛋白修饰聚酯聚酰胺无纺布为支架,以人永生化角质形成细胞和成纤维细胞为种子细胞,构建检测用的新型组织工程皮肤模型。选取10 种化学品作为检测物质,局部接触皮肤模型表面15 min,应用MTT 比色法测定细胞相对活力。结果 3个不同批次的模型中,根据相对细胞活力值作为判定,构建的新型检测模型能够判断出8种化学品的刺激性,加入IL-1α试验后提高了模型的准确性,准确率达到75%。结论 这个新的体外模型提供了有效的试验结果并证明了模型的可行性。同时它应该使用更多数量的物质进行进一步的验证,并测试在不同的实验室以适当评估重现性。     

表皮移植术治疗白癜风68例

笔者应用表皮细胞分离机分离自体表皮，然后行皮肤移植治疗白癜风68例，收到较满意效果，现报告如下。1临床资料1．1一般情况本组男24例，女44例，年龄11～65岁，病程2个月～15年。病灶分布多在面、颈、四肢。1．2治疗方法（1）选准正常皮肤取皮位置，确定治疗病灶区后，行碘酒、乙醇常规消毒，覆盖洞巾，将表皮细胞分离机的负压定在40～60kPa，温度定在35～45℃．分别将取皮器置放在预定皮肤上，开机60～80min，见取皮器孔内水疤形成即表明表皮与真皮已分离。停机取下取皮器，清除病灶上表皮，而后将正常皮肤的痕壁沿边缘剪下移植在病灶创…     

光动力疗法治疗皮肤鳞状细胞癌的进展

皮肤鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)是一种起源于表皮或附属器角质形成细胞的恶性肿瘤。常规治疗方法包括手术、放疗以及化疗。近年来光动力疗法(Photodynamic therapy,PDT)成为治疗皮肤鳞癌的有效辅助治疗技术,本文就近年来国内外PDT治疗SCC的文献进行综述,主要通过五个方面(作用机制、影响因素、临床疗效以及如何提高疗效)进行总结,以期对皮肤鳞状细胞癌的临床治疗和基础研究有所帮助。     

白血病引起血型A抗原减弱1例

笔者在对 1例白血病患者进行ＡＢＯ血型鉴定时 ,发现其正、反定型不符 ,经一系列血型血清学试验 ,证实患者因白血病引起红细胞血型Ａ抗原减弱 ,现报道如下。1　病例简介患者 ,女 ,36岁 ,因头晕、乏力、皮肤出现散在瘀斑 ,月经量增多 ,经期明显延长 ,鼻腔内有少量渗血及牙龈出血 ,于 2 0 0 0 - 0 5- 2 0来我院 ,查血常规ＷＢＣ 16.2× 10 9·Ｌ- 1,Ｈｇ 7.9ｇ·Ｌ- 1,ＰＬＴ 2 7× 10 9·Ｌ- 1,细胞形态示 :原粒 0 .32 ,早幼粒 0 .16,行骨髓穿刺检查示 :有核细胞增生极度活跃 ,粒 :红 =1.4 :1,粒系统增生明显活跃 ,原粒 早幼粒 54.8% ,少数…     

稀土对小鼠表皮Langerhans细胞的影响

用ＡＴＰ酶染色等方法观察了稀土对ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠表皮Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ细胞（ＬＣ）的影响。结果显示：接触组表皮ＬＣ密度及Ｉａ抗原阳性ＬＣ密度明显下降，细胞分布不均匀，ＬＣ树支状胞突减少、变短或消失。组织学表现为接触组皮肤增厚和弹力纤维、网状纤维增生。认为稀土可以损伤表皮ＬＣ。     

糖基化终末产物对人表皮角质形成细胞周期调控的影响机制

目的通过体外试验探讨糖基化终末产物（AGEs）对表皮角质形成细胞周期调控的影响机制。方法体外培养的人表皮角质形成细胞经AGEs（150mg／m1）作用后,用噻唑兰（MTT）法研究其增殖活力、流式细胞仪研究细胞周期和凋亡率。用小片断RNA干扰（siRNA）的方法阻断细胞中AGEs受体（receptor of AGEs,RAGE）mRNA的表达,realtime PCR鉴定其阻断效率。RT-PCR法检测RAGE阻断前后各组细胞内RAF-1、黏着斑激酶（FAK）、周期素（cyclin）D1、cyclinBl、周期表依赖性激酶4（CDK4）的核酸水平表达差异。结果经AGEs干预后表皮角质形成细胞增殖活性下降,凋亡率升高,细胞周期G2期的比例显著增高,而细胞周期调控相关因子及信号因子RAF．1、cyclinDl、cyelinBl、CDK4的核酸表达较对照组却明显升高,用RAGE阻断以上因子后表达则与对照组相比无差异。结论在上述体外模型下,表皮角质形成细胞的周期调控因子升高,而增殖却下降且凋亡增加,可能是AGEs干预后细胞内启动内源性代偿调控机制,且这种调控机制与其受体（RAGE）途径相关;AGEs也可能还通过以上细胞周期调控因子以外的其他途径或机制影响细胞生物学功能。     

小鼠烧伤应激影响鼠尾皮肤增殖和角化的形态学观察

目的观察烧伤应激对小鼠鼠尾皮肤的影响,探索应激在银屑病发病中作用。方法在鼠背制作2cm×1cm的烧伤创面,于烧伤后1h、24h、1w、2w、4w分别取鼠尾皮肤观察表皮的增殖和角化情况。结果与正常小鼠鼠尾皮肤对照,烧伤应激后1w、2w、4w,鼠尾皮肤角质形成细胞(KC)明显增殖,角化过度和角化不良,4w时最明显。结论烧伤应激可促进小鼠鼠尾皮肤KC增殖、角化过度和角化不全。