HIV-1 Tat蛋白对DNA修复基因及细胞周期相关基因表达的影响

目的:探讨HIV-1 Tat蛋白对DNA修复基因及细胞周期相关基因表达影响.方法:使用包含102个与DNA损伤修复和细胞周期相关的基因微阵列检测人横纹肌肉瘤细胞(TE671)及已转染tat基因的TE671细胞(TT2)基因表达谱的改变;使用半定量RT-PCR分析DNA-PKcs在mRNA水平表达;Western印迹法检测DNA-PKcs表达变化;荧光染色法检测电离辐射后细胞凋亡.结果:在基因芯片的检测中,发现与DNA损伤修复及细胞周期调控相关的6个基因CdC25C、KIF2C、CdC20、DNA-PKcs、CTS1、WEE1在转染tat基因的细胞中表达下调;DNA-PKcs的表达在表达Tat蛋白细胞中不论是在mRNA和蛋白水平均被抑制;接受电离辐射后,表达Tat蛋白的细胞凋亡增加.结论:HIV-1 Tat蛋白使细胞对电离辐射敏感,部分通过抑制DNA-PKcs表达来降低DNA双链断裂的修复能力,本研究为了解AIDS合并肿瘤患者对放射治疗敏感性提供了重要实验数据.     

低剂量辐射对肿瘤细胞凋亡、细胞周期以及凋亡相关蛋白bcl-2的影响

目的　探讨低剂量辐射对小鼠移植肿瘤细胞的凋亡、细胞周期以及相关蛋白bcl 2表达的影响。方法　昆明种雄性小鼠左后肢腹股沟皮下接种S1 80肉瘤细胞 ,接种后 7dγ射线全身照射 75mGy,照射后 2 4 ,48h分别处死 ,直接测量肿瘤大小变化 ,并取肿瘤组织分别进行流式细胞仪分析凋亡、细胞周期 ,以免疫组化染色半定量分析凋亡相关蛋白bcl 2表达的变化。结果　与直接荷瘤组相比 ,低剂量照射组肿瘤生长缓慢 (P <0 0 5) ,2 4h后肿瘤细胞阻滞于G1 期 ,bcl 2蛋白表达下降 ,48h后肿瘤细胞凋亡增加 (P <0 0 0 1 )。结论　低剂量辐射可使机体肿瘤细胞阻滞于G1 期 ,并通过凋亡相关蛋白表达变化导致肿瘤细胞凋亡增加 ,明显提高机体抗肿瘤的作用 ,具有肿瘤治疗和辅助放化疗的实际临床意义     

p53基因状态与辐射诱导的G1期阻滞

Ｇ１期阻滞是细胞对ＤＮＡ损伤作出的一种保护性反应，它与ｐ５３基因状态密切相关，本文对Ｇ１期阻滞的发生机制，生物学意义及ｐ５３突变对辐射诱导Ｇ１期阻滞的影响进行综述。     

电离辐射诱导的细胞G2期阻滞

哺乳动物受X射线照射后,可以使细胞周期延迟或阻滞,包括G1期阻滞、S期延迟和G2期阻滞。G1期阻滞仅在野生型p53基因存在时出现,在清除DNA损伤的细胞中具有重要作用;而G2期阻滞更有利于损伤后DNA的修复和细胞存活,并且与p53基因存在状态无关。因此,对电离辐射诱导细胞G2期阻滞机制的探讨成为近年来国内外放射生物学领域的研究热点。     

ras-raf信号转导途径对受辐射细胞G_1期阻滞的调控作用

目的　探讨ras raf信号转导途径在受辐射KG 1细胞中对周期的调控作用方式。方法　通过转染DN ras阻断GM CSF的信号传递后 ,瞬间转染cyclinD1,观察cyclinD1对受辐射细胞周期阻滞的影响作用。结果　转染DN ras的受辐射KG 1细胞即使用GM CSF刺激亦不能跳出G1期阻滞 ;瞬间转染cyclinD1能促进受辐射细胞跳出周期阻滞。 结论　ras raf信号转导途径通过促进周期蛋白cyclinD1的表达而对受辐射细胞周期进行调控。     

细胞周期蛋白D1在肺癌的表达及其临床病理意义

为探讨细胞周期蛋白Ｄ１（Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１）在肺癌发生中的作用及其与生物学行为的关系,采和免疫组化ＳＰ法观察Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１在肺癌前病变和正常肺组织的表达。结果显示,正常肺组织和鳞状化生的支气管上皮未见Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１,在轻、中、重度不典型增生、原位癌、浸润癌,Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１表达的阳性率高于中高分化癌（Ｐ〈０．０５）,癌还是腺癌,Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１阳性组的增殖活性高于阴性组（Ｐ〈０．０５）     

尿多酸肽对乳腺癌细胞周期蛋白D1表达的影响

目的研究肿瘤细胞分化诱导剂尿多酸肽（CDA-Ⅱ）对乳腺癌细胞周期蛋白D1（cyclin D1）表达的影响。方法将CDA-Ⅱ与不同生物学特性的乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231进行体外培养,同时以维甲酸为阳性对照,观察CDA-Ⅱ对乳腺癌细胞生长曲线、cyclin D1表达等方面的影响。结果CDA-Ⅱ可减缓两株乳腺癌细胞的生长和增殖能力,减少乳腺癌细胞cyclin D1表达。结论CDA-Ⅱ可抑制不同生物学特性的两株乳腺癌细胞的生长和增殖能力,减少乳腺癌细胞cyclin D1表达,为CDA-Ⅱ治疗乳腺癌提供了实验依据。     

Tat蛋白与Plk1相互作用位点的鉴定

目的确定Tat蛋白与Plk1的相互作用及作用位点。方法构建tat和plk1基因的不同表达载体,通过GST-pull down、免疫共沉淀检测它们表达产物的相互作用位点,激光共聚焦确定其在细胞内的定位。结果 GST-pull down和免疫共沉淀实验发现Tat蛋白能结合在Plk1 N端的激酶区域,激光共聚焦发现Tat蛋白和Plk1在细胞核内有相同的亚细胞定位。结论 Tat蛋白能结合在Plk1 N端的激酶区域引起Plk1 T210的磷酸化水平提高,从而激活Plk1的活性,导致细胞周期的紊乱。     

p16负向调控通路与辐射诱导的G1期阻滞

辐射诱导细胞发生G1期阻滞，其分子调控机制尚不十分清楚。近期献报道，独立于p53基因之外的p16-Cyclins-CDKs(细胞周期素依赖性激酶)细胞周期负向调控通路在紫外线和电离辐射照后发生改变，提示此通路可能在辐射诱导的G1期阻滞中发挥至关重要的作用。     

不同剂量率60Co γ射线照射对人外周血辐射敏感基因表达变化的影响

目的 探讨不同剂量率⁶⁰Co γ射线照射对辐射诱导的基因表达水平改变的影响。方法 ⁶⁰Co γ射线照射3例正常人离体外周血,剂量率分别为0.2、1.0和2.0 Gy/min,照射剂量为0、1、2、4和6 Gy,照射后24 h收集细胞,实时荧光定量（PCR）法对11个基因（CDKN1A、MDM2、PCNA、FDXR、GADD45A、PHPT1、ASTN2、TNFSF4、POLH、GDF-15和PPM1D） mRNA表达水平进行相对定量检测;逐步回归法构建不同剂量率基因组合表达模型。结果 不同剂量率0.2、1和2 Gy/min ⁶⁰Co γ射线照射后,辐射诱导的11个基因的相对表达量随照射剂量增加而升高,具有显著的剂量依赖性（R²=0.744~0.998,P< 0.05）;0.2 Gy/min ⁶⁰Co γ射线照射2 Gy后,CDKN1A、FDXR、PHPT1和TNFSF4基因的表达量明显高于1和2 Gy/min剂量率组,差异具有统计学意义（t=3.73、5.73、2.44、2.77、3.53、2.68、2.43、2.05,P< 0.05）;2 Gy/min ⁶⁰Co γ射线照射6 Gy后,PPM1D基因表达量明显高于其他两个剂量率组（t=3.82、2.54,P< 0.05）;不同剂量率基因组合表达模型由2~3个基因组成,回归方程的R²值为0.951~0.976（P< 0.05）。结论 在0.2~2 Gy/min剂量率范围内,不同剂量率⁶⁰Co γ射线照射可能会影响辐射诱导人外周血基因表达水平的改变。     

HIV-1耐药性突变位点研究进展

HIV耐药性的产生是抗病毒治疗的瓶颈,而耐药性的发生主要是因为HIV基因组中部分密码子位点发生突变所致。随着HIV耐药性研究的逐步深入,导致HIV耐药的突变位点也逐渐明晰化,尤其是针对高效抗病毒治疗中经常使用的抑制剂的耐药突变位点的研究取得了明显进展。明确HIV耐药突变位点单独存在或与其他位点联合作用下对病毒抑制剂的影响,将使得抗病毒治疗更有针对性。     

与HIV-1共感染的HHV-6毒株的分离、传代培养与鉴定

目的：对一株从中国河南省一名艾滋病患者体内分离的、可在MT4细胞上稳定传代的未知病毒29A进行鉴定，确定该病毒种类及型别。方法：用从该患者外周血单核细胞中分离的病毒株感染MT4细胞，获得可在该细胞上稳定传代的病毒株29A。通过细胞病变特征、电镜观察结果、HIV-1 p24抗原检测以及HIV-1 pol区基因扩增结果，对该毒株是否为HIV-1进行鉴别。在电镜下对病毒感染细胞的超薄切片进行观察，发现该病毒呈现疱疹病毒形态特征，因此设计人类疱疹病毒6型（HHV-6）U69、U16／U17、U60／U66三个不同基因片段的特异性引物并进行巢式PCR扩增，对扩增产物进行序列测定和结果分析。结果：该毒株HIV-1 p24抗原检测为阴性；用HIV-1 pol区特异性引物未扩增出目的片段；细胞病变形态不同于HIV-1引起的病变；电镜观察该病毒直径为160～200nm，明显大于HIV—1，表明该传代株不是HIV-1。用人类疱疹病毒6型（HHV-6）U69、U16／U17、U60／U66等基因的特异性引物均扩增出了目的片段，序列分析的结果表明该毒株为HHV-6病毒B亚型。结论：在国内首次从艾滋病患者的外周血淋巴细胞中分离出HHV-6，为进一步研究HHV-6和HIV-1的相互作用奠定了基础。     

福尔马林固定的猴淋巴组织中HIV-1DNA的扩增

本文尝试从福尔马林固定的猴淋巴组织提取HIV-1CNA，并用PCR方法进行扩增和对扩增产物HIV-1DNA进行检测。结果认为，采取从福马林固定标本中提取PNA的方法是可行的。在提取DNA中，采用过量TE（ph9.0）长时间浸泡标本。并适当提高蛋白酶K（100μq/ml）和SDS（2%-3%）的浓度，可有助于DNA的提取，同时适当提高提取液的PH值（PH9.0），对DNA具有一定的保护作用。     

HIV-1B亚型假病毒的制备与鉴定

目的：制备携带增强绿色荧光蛋白（ EGFP）基因和ENV包膜蛋白的HIV-1 B亚型假病毒用于感染研究,并建立可行的鉴定方法。方法双质粒共转染HEK293 T细胞后收获病毒上清, TRIzol法提取病毒基因组并采用RT-PCR进行报告基因扩增,Western印迹和ELISA法检测病毒P24抗原。假病毒感染HIV-1允许细胞,进行报告基因检测、病毒滴度测定以及单轮感染活性实验研究。结果与结论建立了HIV-1假病毒制备与鉴定方法,制备获得了B型HIV-1假病毒,经鉴定具备感染SupT1和TZM-bl细胞能力,为HIV-1与宿主细胞相互作用研究奠定了基础。     

人淋巴细胞H9体外感染HIV-1后APOBEC3G mRNA水平的监测

目的：观察人淋巴细胞H9体外感染HIV-1后,在其细胞内APOBEC3G蛋白水平降低的同时,APOBEC3GmRNA的水平是否也下降,阐明HIV-1抵抗APOBEC3G蛋白抗病毒作用的机制。方法：H9细胞感染HIV-1后,在不同时间点收集细胞和培养上清,提取细胞总RNA,应用实时定量PCR检测APOBEC3G mRNA的水平。检测上清液的HIV-1 p24抗原含量验证H9细胞是否感染了HIV-1。结果：（1）采用？？CT相对定量PCR方法检测APOBEC3G mRNA水平,其准确性高于94%。（2）在体外水平,H9细胞在感染HIV后,APOBEC3G mRNA水平没有显著变化（P＆gt;0.05）。结论：HIV-1可能主要通过降低APOBEC3G蛋白的水平而抵抗其抗病毒作用,这比通过降低mRNA水平来抵抗APOBEC3G的抗病毒作用更为快速、有效。     

两种HIV-1耐药准种分析方法的比较

目的比较两种HIV-1耐药准种分析方法 ---克隆PCR产物测序法和单基因扩增法（单基因组测序法,single-genome sequencing,SGS）。方法以本室贮存的某接受高效抗逆转录病毒治疗（highly active antiretroviraltherapy,HAART）的艾滋病患者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）为样本,分别用克隆PCR产物序列测定法和SGS方法得到HIV-1pol区准种序列,对准种序列进行离散率、耐药相关突变组合构成比等分析。结果克隆方法得到19条pol区序列,SGS方法得到18条pol区序列。对两种方法的核苷酸和蛋白质序列的平均离散率进行成对样本均值分析,采用t检验,P值（单尾）为0.311,差异没有显著性意义;两种方法检测出各种突变组合构成比的2检验结果 ,P〉0.25,差异也没有显著性意义。但是,准种中占较少比例的突变模式在两种方法检测的结果不一致,如T215Y/K103N/Y181C/H221Y以及M41L/F116L/T215Y/K103N/Y181C/H221Y两种突变组合模式只在克隆方法中检测到,而携带M41L/A62V/T69Si/T215Y/A98G/K103N/Y181C以及K103N突变的两种毒株仅在SGS方法中出现。结论两种分析HIV-1耐药突变准种方法检测该例样本的核苷酸序列和蛋白质准种序列无显著性差异,检出的主要突变组合的构成比也无显著性差异,对优势准种的检测中两种方法差异不大,但在劣势准种的检测中两种方法有一定差异。     

CDT1基因过表达对辐射诱发基因组不稳定肝细胞HL-7702凋亡及细胞周期的影响

目的 研究CDT1基因过表达对辐射诱发基因组不稳定肝细胞凋亡及细胞周期的影响.方法 选择基因组不稳定肝细胞HL-7702,利用慢病毒介导的过表达技术,上调辐射诱发基因组不稳定肝细胞中CDT1基因的表达,通过流式细胞术研究CDT1基因过表达对细胞周期及细胞凋亡的影响;利用实时荧光定量PCR方法,检测CDT1基因上调后p53、ATM、ATR、Bcl-2、Caspase-3基因的表达变化.结果 慢病毒介导的过表达能有效上调HL-7702细胞中CDT1基因的表达(t=15.56, P<0.05),与阴性对照组相比,CDT1基因的上调能够导致基因组不稳定肝细胞HL-7702凋亡率升高(t=4.19, P<0.05);CDT1基因的过表达能诱发基因组不稳定肝细胞p53、Bcl-2基因的表达显著下调(t=-4.21、-2.06, P<0.05),同时,ATM基因上调,ATR和Caspase-3基因下调,但差异均无统计学意义.结论 CDT1基因的过表达通过参与非p53依赖的凋亡途径以及细胞周期检查点适应性对基因组不稳定性进行调控.     

多层螺旋CT灌注成像评价周围型肺癌的血管生成及周期蛋白D1基因表达

目的 探讨多层螺旋CT灌注成像与周围型肺癌血管生成及细胞周期蛋白D1(cyclinDl)表达的相关性.方法 73例周围型肺癌行16层螺旋CT灌注成像,分析周围型肺癌的时间密度曲线(TDC)、灌注参数图像和各灌注参数[血流量(BF)、血容量(BV)、平均通过时间(MTT)、表面通透性(PS)、强化峰值(PH)、肿块-动脉强化峰值比(PHpm/PHa)].利用免疫组织化学测定微血管密度(MVD)并标定cyclinDl,评价周围型肺癌各CT灌注参数与MVD计数及cyclinD1表达的相关性.统计学方法采用单因素方差分析及Pearson相关分析方法.结果 3组周围型肺癌(腺癌、鳞癌、其他类型癌)的TDC曲线相似,都有明显的上升支,CT值明显增加[TDC曲线的峰值分别为(44.87±6.83)、(34.91±8.05)、(40.66±5.87)HU],达峰值后变化较小,较平坦,有一个平台期;cyclinD1阳性表达44例,周围型肺癌cyclinD1阳性表达患者的MVD值明显高于阴性表达者[分别为(33.88±14.81)、(23.17±11.66)条/高倍视野,P<0.01];周围型肺癌cyclinD1阳性表达者的PH、PHpm/PHa、BF、BV、PS值[分别为(60.56±6.27)HU、(20.71±2.54)、(245.54±69.73)ml·100 mg-1·min-1、(12.17±3.50)ml/100 mg、(20.11±7.34)ml·100 mg-1·min-1]明显高于阴性表达者[(56.39±6.87)HU、(19.02±3.27)、(194.23±80.89)ml·100 mg-1·min-1、(9.67±3.00)ml/100 mg、(14.10±7.45)ml·100 mg-1·min-1],差异有统计学意义(P值均<0.05);3组周围型肺癌中,cyclinD1阳性表达的PH、PHpm/PHa、BF、BV、PS值与MVD均呈正相关,其中,BV、PS、BF值的r值分别为0.409、0.517、0.503,呈显著性相关(P值均<0.01);PH、PHpm/PHa的r值分别为0.319、0.324,呈低度相关(P值均<0.05).cyclinD1阴性表达者PH、PHpm/PHa、BF、BV、PS值与MVD均无相关性.结论 多层螺旋CT灌注成像与肿瘤血管生成具有较好的相关性,能够反映肿瘤的血管生成及cyclinD1表达,提供了一种定量评价周围型肺癌血流模式的非创伤性方法,有利于周围型肺癌的诊断.