山羊颈椎间盘纤维环成纤维细胞成骨潜能的体外观察

目的 诱导培养椎间盘纤维环成纤维细胞，探讨其成骨潜能，比较重组人骨形成蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein2，rhBMP-2）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF—α）对其成骨的不同影响。方法利用体外细胞培养技术，建立实验山羊颈椎间盘纤维环成纤维细胞培养体系，根据培养液的不同，分为空白对照组、TNF-α组（加入50U／ml TNF-α）、rhBMP-2组（加入0．1μg／ml rhBMP-2）和TNF—α＋rhBMP-2组（加入50U／ml TNF-α＋0．1μg／ml rhBMP-2），培养3周观察纤维环成纤维细胞在条件培养液诱导下的成骨表型变化、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和骨钙素（osteocalcin，OC）等成骨指标变化。结果 各实验组培养液对细胞增殖无明显影响。rhBMP-2组和TNF-α＋rhBMP-2组细胞趋化性生长明显，矿化结节出现，茜素红染色呈深红色钙阳性反应。各实验组ALP活力与空白对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。rhBMP-2组与TNF—α＋rhBMP-2组成纤维细胞的OC分泌量与空白对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．05），TNF—α组与空白对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论 体外培养的椎问盘纤维环成纤维细胞有成骨潜能，rhBMP-2对纤维环成纤维细胞有明确的诱导成骨作用。     

颈椎病患者颈椎间盘纤维环成纤维细胞成骨潜能的体外观察

目的研究纤维环成纤维细胞成骨化生在颈椎间盘退变机制中的作用,以进一步揭示颈椎病的发病机理。方法利用体外细胞培养技术,建立颈椎病患者的颈椎间盘纤维环中成纤维细胞的培养体系,观察其在细胞因子rhBMP、TNF-α条件培养液诱导下的成骨潜能表现。结果非条件培养组和条件培养组在传代的颈椎病患者纤维环成纤维细胞培养的各时间点的细胞增殖活力（MTY）测定无明显差异（P〉0．05）,细胞增殖速度较慢,条件培养液对细胞增殖无明显影响。rhBMP2、rhBMP2＋TNF-α条件培养组细胞趋化性生长明显,细胞呈漩涡状和复层生长,局部密度增高,可见有肉眼观呈黑色点状矿化结节出现。各条件培养组的ALP活力经测定均与空白对照组ALP活力有显著性差异（P〈0．05）,rhBMP2＋TNF-α组的成纤维细胞所形成的骨钙素分泌量均与空白对照组有显著性差异（P〈0．05）,而rhBMP1组、TNF-α组则与空白对照组无显著性差异。结论颈椎间盘纤维环成纤维细胞存在成骨潜能,rhBMP-2对纤维环成纤维细胞体外有明确的诱导成骨作用,纤维环成纤维细胞的骨化在颈椎退变的病理过程中有重要作用。     

rhBMP-2对不同培养时间骨髓基质干细胞成骨能力的影响

目的：探讨不同培养阶段骨髓基质干细胞成骨能力的变化及BMP-2对其成骨能力的影响。方法：培养兔骨髓基质干细胞，测定第3代和第18代细胞碱性磷酸酶及骨钙素活性；测定BMP-2对不同培养时间骨髓基质干细胞成骨能力的影响；测定rhBMP-2对细胞增殖的影响。结果：细胞传至第18代后，分泌的骨钙素（OC）水平及ALP活力明显降低，与第3代细胞相比，差异显著（P〈0．05）。第3代细胞在rhBMP-2的诱导下，分泌的OC水平及ALP活力在原基础上进一步升高，与对照组相比，差异显著（P〈0.05）。结第18代细胞在rhBMP-2的诱导下，分泌的OC水平及ALP活力在原基础上升高，与对照组相比，差异不显著（P〉0．05）；随培养时间的延长，各组细胞数量均有所增加，rhBMP-2诱导组与对照组细胞无显著性差异（P〉0．05）。细胞的传代次数对细胞增殖无明显影响（P〉0．05）。结论：rhBMP-2对细胞增殖无影响。随着传代次数的增加，骨髓基质干细胞的成骨能力下降，rhBMP-2促进其成骨的能力亦下降。     

bFGF增强rhBMP-2诱导成骨中Ⅰ、Ⅱ型胶原及碱性磷酸酶的表达

目的：对bFGF增强rhBMP-2诱导成骨中CollagenⅠ、Ⅱ及碱性磷酸酶（ALP）的表达进行研究。方法：110只BALB/c小鼠随机分为2组，每组55只，rhBMP-2/bFGF为实验组，rhBMP-2为对照组，分别于术后3-21d8个时间点取材，用免疫组化法对新生骨组织中的Ⅰ、Ⅱ胶原进行检测；对ALP活性进行定量分析，观察2组在诱导成骨中CollagenⅠ、Ⅱ及ALP的表达情况。结果：⑴Ⅱ型胶原和成软骨、软骨细胞的出现相伴随，但肥大、变性的软骨细胞并不表达Ⅱ型胶原。⑵作为成骨细胞成熟标志物的Ⅰ型胶原，ALP在骨形成期即有表达，但随着成骨细胞的出现，骨组织的形成Ⅰ型胶原表现为高表达，而ALP的表达则呈下降趋势。⑶实验组CollagenⅠ、Ⅱ及ALP的表达早于对照组。结论：bFGF增强了rhBMP-2诱导成骨中CollanenⅠ、Ⅱ及ALP的表达。     

碱性成纤维细胞生长因子增强重组人骨形态发生蛋白-2诱导成骨能力的剂量依赖性

目的 对碱性成纤维细胞生长因子（basic　fibroblast growth factor,bFGF）增强重组人骨形态发生蛋白-2（recombinant human bone　morphogenetic protein-2,rhBMP-2）诱导成骨能力的剂量依赖性进行研究。方法280只BALB/c小鼠随机分为8组,每组35只,实验组rhBMP-2的剂量均为0.5mg,bFGF的剂量分别为0、2、10、40、80、300、500活性单位（IU）;设立单纯牛松质骨载体组为对照组。按实验设计,分别将rhBMP-2混悬液及bFGF-PVP溶液与牛松质骨载体充分混匀,负压下真空抽吸,冻干。将复合植骨材料植入小鼠右侧股部肌袋内,各组分别于术后第3、5、7、9、14、21d六个时间点取材,进行组织学、X线分析以及钙含量测定,观察各组的诱导成骨情况。结果（1）bFGF剂量为10～80IU时,间充质细胞增殖、分化,软骨细胞及新生骨形成均早于其它各组,成骨量多于其它各组,组织钙含量明显高于其它各组（P<0.05）,提示此剂量bFGF使rhBMP-2的诱导成骨能力明显增强。（2）bFGF剂量为0.2、300 IU时,各组在间充质细胞增殖、分化,软骨细胞及新生骨形成以及组织钙含量方面差异均无显著性意义（P>0.05）,提示此剂量bhBMP-2的诱导成骨能力无明显影响。（3）bFGF剂量为500IU时,术后第21d,仅1例标本可见散在的极少量新骨形成,其组织钙含量明显低于其     

碱性成纤维生长因子对颅缝细胞成骨分化的影响

目的 探讨碱性成纤维生长因子（FGF-2）对颅缝细胞成骨方向分化的影响.方法 ①获取新生SD大鼠颅骨矢状缝及冠状缝处颅缝细胞.②添加不同浓度FGF-2,观察颅缝细胞ALP染色、ALP活性及成骨标志物（osteocalcin,OC）表达量,了解不同浓度FGF-2对颅缝细胞向成骨分化的影响.结果①各浓度FGF-2作用于颅缝细胞后,ALP染色、活性均较对照组减弱（P ＜0.05）.其中10ng/ml FGF-2诱导的细胞ALP受到的抑制最弱.②各浓度FGF-2作用于颅缝细胞后,OC表达量均较对照组增加（P ＜0.05）.其中10ng/mlFGF-2诱导的细胞其OC表达量最高.结论 ①FGF-2抑制颅缝细胞早期成骨标志物ALP的表达,而增强晚期成骨标志物OC的表达.②较低浓度的FGF-2（10ng/ml）对ALP抑制作用最弱,对OC促进作用最强,最利于促进颅缝细胞向成骨方向分化.     

联合rhBMP-2与成骨细胞诱导骨髓基质细胞成骨分化的实验研究

目的探讨rhBMP-2和成骨细胞联合诱导骨髓基质细胞(BMSCs)的成骨分化能力。方法应用全骨髓贴壁法分离培养4周龄SD大鼠的BMSCs,通过改进酶消化法结合反复贴壁法培养1日龄SD乳鼠成骨细胞。实验分为4组:rhBMP-2诱导组、成骨细胞诱导组、rhBMP-2+成骨细胞诱导组、单纯培养液组。倒置相差显微镜及扫描电镜观察细胞生长情况;分别收集第3、6、9天细胞培养液上清液定性及定量测定碱性磷酸酶并进行统计学分析。结果 rhBMP-2诱导组、成骨细胞诱导组、rhBMP-2+成骨细胞诱导组均检测出成骨细胞生成,其中,rhBMP-2+成骨细胞诱导组碱性磷酸酶含量明显大于前两组,差异有统计学意义(P0.05)。结论rhBMP-2、成骨细胞、rhBMP-2联合成骨细胞均能提供成骨微环境,并在体外诱导BMSCs向成骨细胞分化,rhBMP-2联合成骨细胞对BMSCs的成骨分化具有更优的诱导能力。     

碱性成纤维细胞因子和骨形态发生蛋白对股骨头坏死修复过程的研究

股骨头坏死修复后之重建血循环，主要依靠再血管化促进新骨形成和替代。研究表明多种生长因子在骨与软骨损伤的修复中有重要的调节作用，如碱性成纤维细胞因子（bFGF）。另外，骨形态发生蛋白（BMP）因具有异位诱骨活性而已在修复骨缺损的研究中得到广泛应用。近年来由于生长因子的基因重组产品问世，因而出现了多种生长因子复合应用的趋势。我们试图用重组人碱性成纤维细胞因子（rhbFGF）或与BMP复合使用（BMP／bFGF）治疗股骨头缺血坏死模型，观察bFGF对股骨头坏死修复的影响及其与BMP协同关系。     

兔脂肪干细胞的分离培养鉴定及成骨诱导分化研究

[目的]探讨在成骨诱导条件下兔脂肪干细胞的体外诱导分化情况：[方法]取3个月龄日本大耳白兔颈背部皮下脂肪，用Ⅰ型胶原酶消化获得细胞。Stro-1免疫细胞化学染色鉴定细胞性质；加入成骨诱导液后依次进行形态学、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶及钙盐沉积相关检测。[结果]（1）原代所获细胞Stro—1表达阳性？（2）在诱导条件下，Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶及钙盐沉积均呈阳性表达。[结论]脂肪干细胞来源广、易获取、对机体创伤小，与骨髓间充质干细胞类似，经体外诱导后可实现成骨分化，为骨组织工程提供了一种新的种子细胞：     

神经营养因子家族及其受体在重组人骨形态发生蛋白-2诱导成骨中的表达

[目的]通过观察重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）诱导成骨过程中神经营养因子（NTFs）家族及受体的表达，探讨神经营养因子在BMP骨诱导中的作用。[方法]建立小鼠右侧股后部异位成骨模型，实验组植入rhBMP-2胶原复合物，对照组仅植入相同体积的胶原海绵。分别于术后7、14和21d取材，进行组织学、免疫组化及RT-PCR检测。[结果]组织学证实rhBMP-2胶原复合物具有良好的骨诱导能力，而对照组未见成骨。术后第7d，在大量软骨形成期NGF和TrkA阳性染色达到高峰，成纤维细胞、成软骨细胞、软骨细胞、肥大软骨细胞和成骨细胞中均有阳性表达；BDNF在软骨细胞及软骨基质中有阳性染色，其受体TrkB仅在成软骨细胞和软骨细胞中有表达；NT-3与NGF表达相似，其受体TrkC仅在成软骨细胞和软骨细胞中有阳性染色。术后第14d，NGF和TrkA阳性表达局限于部分成骨细胞、骨样细胞和成骨样细胞；NT-3在软骨细胞、成骨细胞中明显表达。术后21d，只有少量成骨细胞、成骨样细胞中有NGF和TrkA的表达。RT—PCR检测结果显示，NTFs mRNA于术后第7d表达最高，与免疫组化中蛋白质的表达结果相一致。[结论]NTFs及其受体在rhBMP-2诱导成骨过程明显表达，提示NTFs可能通过直接和间接的方式协同BMP的诱导成骨过程。     

AAV2-hVEGF165与AAV2-hTGFβ1对退变兔椎间盘纤维环细胞的生物学效应

目的采用基因治疗方法，把AAV2-hVEGF165和AAV2-hTGFβ1共转染兔纤维环细胞，观察其生物学活性，并进一步评价人血管内皮生长因子165（hVEGF165）和人转化生长因子β1（hTGFβ1）逆转椎间盘退变的可行性。方法分离并培养兔椎间盘纤维环细胞，以腺相关病毒（AAV2）为载体，分别携带hVEGF165和hTGFβ1eDNA，转染兔纤维环细胞。用Westernblotting检测hVEGF165和hTGFβ1的表达，并用同样的方法检测纤维环细胞中Ⅰ型胶原的表达。结果AAV2能够感染兔椎间盘细胞。用Westernblotting可以检测到AAV2-hVEGF165和AAV2-hTGFβ1在退变椎间盘细胞中的表达，并且，两种因子联合转染纤维环细胞时Ⅰ型胶原的表达要比分别转染是显著增高。结论hVEGF165和hTGFβ1共同转染培养的兔退变纤维环细胞，Ⅰ型胶原的表达显著增高。     

兔髓核与纤维环细胞生物学特性差异的研究

目的:同时建立兔髓核细胞与纤维环细胞体外培养模型,比较两者生物学特性差异。方法:新西兰大白兔5只(2～3kg,雌雄不限),无菌条件下分离髓核及纤维环,酶消化法联合组织块法含15%FBS的DMEM/F12(1∶1)培养液培养,当细胞90%融合后进行传代培养。通过倒置相差显微镜观测细胞形态,台盼蓝染色测定细胞活力,甲苯胺蓝和HE染色进行组织学观察,MTT法测定细胞增殖,分析比较髓核细胞与纤维环细胞形态、活力、增殖的差异。结果:原代及第1代髓核细胞和纤维环细胞形态上无明显差异,第2代髓核细胞开始有空泡出现。髓核细胞较纤维环细胞贴壁时间晚、细胞活力低;原代髓核细胞从第9天开始增殖速度较纤维环细胞慢(P<0.05)。结论:纤维环细胞的细胞活性明显高于髓核细胞。椎间盘退变性疾病可能是由髓核发生衰退引起,从而局部生物力学改变,导致纤维环破裂等组织结构的改变及功能的丢失。     

碱性成纤维细胞生长因子增强人重组骨形态发生蛋白-2诱导成骨的调节机理

目的：对ｂＦＧＦ增强ｒｈＢＭＰ－２诱导成骨的调节机理进行探讨。方法：２１０只ＢＡＬＢ／ｃ小鼠随机分为３组,每组７０只,试验侧均位于右后肢。设立ｒｈＢＭＰ－２／牛松质骨载体、单纯牛松质骨载体为对照组,分别于术后１２ｈ～２１ｄ共１１个时间点取材,观察其诱导成骨过程。结果：ｒｈＢＭＰ－２／ｂＦＧＦ／聚乙烯吡咯啉酮／牛松质骨载体组在诱导间充质细胞增殖、分化,软骨细胞、新生骨形成方面均早于ｒｈＢＭＰ－２／牛松质骨载体组,成骨量优于ｒｈＢＭＰ－２／牛松质骨载体组,而单纯牛松质骨载体组在２１ｄ仅出现了少量增殖的间充质细胞。结论：ｒｈＢＭＰ－２和ｂＦＧＦ在诱导成骨调节中存在着协同作用。     

微载体立体培养腰椎间盘细胞蛋白多糖表达的研究

目的研究腰椎间盘细胞在微载体培养与单层培养中细胞表达蛋白多糖含量的差别。方法椎间盘疾病手术病例的术中切除组织采用酶消化法分别进行微载体三维细胞培养和单层细胞培养；取胎儿椎间盘组织，显微镜下区分髓核细胞和纤维环细胞，分别进行培养，同成入组对照。利用^35S放射标记渗入放免定量测定的方法进行蛋白多糖含量的检测。结果①椎间盘细胞胞内的蛋白多糖含量（cpm），细胞单层培养组为101．909±11．439，微载体立体培养组为136．607±10．792，P〈0．05；②椎间盘细胞表达的蛋白多糖含量（cpm），细胞单层培养组为105．119±13．040，微载体立体培养组为174．231±17．676，P〈0．05；③各组椎间盘细胞表达的蛋白多糖含量均高于细胞内的含量；④胎儿腰椎间盘细胞蛋白多糖的含量及表达量均高于成人退变椎间盘细胞，胎儿髓核细胞蛋白多糖的表达量高于纤维环细胞的表达量。结论椎间盘细胞的微载体三维立体培养相对单层培养具有较高细胞蛋白多糖的表达量，是一种较好的细胞培养方式。     

PDGF,bFGF and IGF-I stimulate the proliferation of intervertebral disc cells in vitro via the activation of the ERK and Akt signaling pathways

Intervertebral disc (IVD) degeneration is frequently characterized by increased cell proliferation, probably as a tissue regenerative response. Although many growth factors and their receptors have been shown to be expressed normally in the disc, and generally to be over-expressed during degeneration, not all of them have been thoroughly studied concerning their effects on IVD cell proliferation. In the present report, three potent mitogens, platelet-derived growth factor (PDGF), basic fibroblast growth factor (bFGF) and insulin-like growth factor-I (IGF-I) are examined regarding their capacity to induce proliferation in vitro of bovine coccygeal nucleus pulposus (NP) and annulus fibrosus (AF) cells, as well as to activate major intracellular signal transduction pathways. PDGF, bFGF and IGF-I were found to induce DNA synthesis in quiescent IVD cells in a dose-dependent manner. Maximum stimulation was induced by PDGF, while stimulation by all three factors simultaneously exceeded only slightly that caused by PDGF alone. All three growth factors were shown to phosphorylate immediately extracellular-signal regulated kinases (ERKs), while the stimulation by bFGF especially resulted in sustained ERK phosphorylation. Furthermore, all three growth factors induced phosphorylation of Akt in both Thr308 and Ser473 residues immediately after stimulation, although bFGF-induced phosphorylation was much weaker than that provoked by PDGF and IGF-I. In addition, the MEK inhibitor PD98059 and the PI 3-K inhibitor wortmannin were shown to block growth factor-induced ERK- and Akt-phosphorylation, respectively, in IVD cells. Inhibition of the MEK/ERK or the PI 3-K/Akt pathways provoked a significant decline of the proliferative effects of PDGF, bFGF or IGF-I on IVD cell cultures, while the simultaneous inhibition of both signaling pathways abolished completely the mitogenicity of these growth factors. The above effects of the three growth factors were reproduced similarly in both NP and AF cell cultures. Overall, the above results indicate that PDGF, bFGF and IGF-I stimulate the proliferation of IVD cells via the ERK and Akt signaling pathways.     

The effects of recombinant human bone morphogenetic protein-2, recombinant human bone morphogenetic protein-12, and adenoviral bone morphogenetic protein-12 on matrix synthesis in human annulus fibrosis and nucleus pulposus cells

BACKGROUND CONTEXT: Bone morphogenetic proteins (BMPs) are potential therapeutic factors for degenerative discs, and BMP-12 does not have the osteogenic potential of BMP-2, making it better suited for intradiscal injection. However, no reports have compared the actions of BMP-2 and -12 on human annulus fibrosus (AF) and nucleus pulposus (NP) cells nor evaluated adenoviral-mediated gene therapy in human AF cells. PURPOSE: To evaluate and compare the effects of recombinant human (rh) BMP-2, rhBMP-12, and adenoviral BMP-12 (Ad-BMP-12) on nucleus pulposus and annulus fibrosis cell matrix protein synthesis. STUDY DESIGN: In vitro study using rhBMP-2 and -12 and adenoviral BMP-12 with human intervertebral disc (IVD) cells. METHODS: Human NP and AF IVD cells were isolated, maintained in monolayer, and incubated with BMP-2 or -12 for 2 days. AF and NP cells were transduced with Ad-BMP-12, pellets formed, and incubated for 6 days. Growth factor-treated cells were labelled with either 35-S or 3H-proline to assay matrix protein synthesis. RESULTS: rhBMP-2 increased NP proteoglycan, collagen, and noncollagen protein synthesis to 355%, 388%, and 234% of control. RhBMP-12 increased the same NP matrix proteins' synthesis to 140%, 143%, and 160% of control. Effects on AF matrix protein synthesis were minimal. Ad-BMP-12 significantly increased matrix protein synthesis and DNA content of AF and NP cells in pellet culture. NP synthesis of all matrix proteins and AF synthesis of proteoglycans was increased when the data were normalized to pellet DNA. AF synthesis of noncollagen protein and collagen was not modulated by Ad-BMP-12 if the data are normalized to pellet DNA content. CONCLUSIONS: Both rhBMP-2 and -12 increase human NP cell matrix protein synthesis while having minimal effects on AF cells. However, Ad-BMP-12 did increase matrix protein synthesis in both NP and AF cells, making it a potential therapy for enhancing matrix production in the IVD. These responses plus the proliferative action of Ad-BMP-12 seen in the current studies, and the lack of an osteogenic action noted in other studies justifies future studies to determine if gene therapy with BMP-12 could provide protective and/or reparative actions in degenerating discs.     

多孔双相陶瓷复合重组人骨形态发生蛋白-2和碱性成纤维细胞生长因子缓释微球的生物相容性

目的 观察复合重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)缓释微球的多孔双相陶瓷(BCP)组织相容性.方法 A组(rhBMP-2+bFGF缓释微球/BCP)、B组(单纯BCP)、C组(bFGF缓释微球/BCP)、D组(rhBMP-2缓释微球/BCP)和E组(不含BCP).其中bFGF、dlBMP的浓度各为5、15μg,材料均为5 mm×5 mm×1mm.采用体外细胞培养的方法测定细胞黏附能力、浸提液对于兔骨髓基质细胞(BMSCs)增殖和成骨分化的影响及体外诱导BMSCs成骨分化的能力.结果 细胞在材料上黏附、生长良好.各组噻唑蓝(MTT)吸光度值、碱性磷酸酶(ALP)值均随培养时间的延长而增大.A组与B、D和E组比较对MSC有显著的促增殖作用,但低于C组(P<0.05).A组ALP活性显著高于B、C和E组,但低于D组(P<0.05).结论 复合rhBMP-2和bFGF缓释微球的BCP具有良好的生物相容性.     

实验性脊柱内固定后相应区域椎间盘超微结构观察

目的　观察脊柱内固定后相应区域椎间盘的超微结构变化。　方法　日本大耳白兔2 4只,随机分成实验组和对照组,每组12只。实验组骨膜下游离T1 0 ～L3棘突和关节突,克氏针制成“L”形,将钢丝横行穿过T1 1、1 2 ,L1、2 的关节突关节,并与置于T1 1 ～L3棘突两旁的克氏针系紧,对相应区域的脊柱行内固定术。对照组未行手术,仅喂养至实验完成。术后6个月,对两组动物摄X线片观察1次,随后处死动物。取两组动物的L1 椎间盘组织(髓核、纤维环内侧及纤维环外侧)行透射电镜观察,对两组T1 2 、L2 椎间盘组织分别行水平面和矢状面透射电镜及扫描电镜观察。　结果　X线片显示,实验组与对照组椎体及椎间隙差别不明显;透射电镜与扫描电镜观察,实验组椎间盘的髓核、纤维环内层细胞的结构改变较纤维环外层早;对照组的髓核、纤维环内层细胞的结构改变与纤维环外层差别不明显。在退变的椎间盘基质中,蛋白多糖颗粒和特殊结构明显减少。髓核与纤维环基质内有蛋白多糖颗粒和一种特殊结构,而特殊结构在髓核与纤维环内层的形态不一致。　结论　脊柱内固定术后6个月,实验组在异常应力环境下发生椎间盘退变。髓核、纤维环内层基质内的特殊结构分布有特殊规律,与蛋白多糖颗粒在椎间盘退变中的生物学行为密切相关。