荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐利福平突变研究

目的 对荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐利福平突变方法进行临床研究,评价其检测效能及在国境口岸应用价值.方法 应用荧光PCR熔解曲线法检测结核病人临床分离标本,与传统药物敏感性试验对比,衡量该方法的灵敏度、特异性.结果 对347例结核病人临床分离培养样本,药敏试验检出271例利福平敏感标本,76例利福平耐药标本;...     

Gene-Xpert MTB/RiF与熔解曲线法检测结核分枝杆菌利福平耐药分析

目的评价Gene-Xpert MTB/RiF法与熔解曲线法检测结核分枝杆菌利福平耐药的不同应用价值。方法入选235例涂阳结核病患者痰标本分别做传统比例法药敏试验、Gene-Xpert MTB/RiF和熔解曲线法检测结核分枝杆菌的利福平耐药,以传统药敏试验作为金标准进行比较。结果 235例标本中比例法药敏试验利福平耐药12例(5.1%)、Gene-Xpert MTB/RiF利福平耐药例15例(6.4%)、熔解曲线法利福平耐药19例(8.1%),Gene-Xpert MTB/RiF和熔解曲线法敏感度分别为91.7%和100.0%;特异度分别为98.2%和96.7%。结论Gene-Xpert MTB/RiF和熔解曲线法两者均可应用于结核分枝杆菌利福平耐药性的快速检测,Gene-Xpert MTB/RiF法在我国开展结核菌耐多药筛查具更有较强的实用性,有更广的应用前景。     

Xpert MTB/RIF检测技术用于耐多药结核分枝杆菌利福平耐药检测分析

目的了解利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert MTB/RIF)用于福建省耐多药结核病(MDRTB)利福平耐药检测的可行性。方法对来源于福建省结核病耐药性监测30个监测点纳入的79株耐多药和40株全敏感结核分枝杆菌分离菌株进行Xpert MTB/RIF检测,同时用PCR测序验证是否存在利福平耐药位点突变。结果119株菌Xpert MTB/RIF检测结果均为结核分枝杆菌。以比例法药物敏感试验结果作为对照,Xpert MTB/RIF检测MDR结核分枝杆菌利福平耐药的敏感度为97.47%(77/79),特异度为100.00%(40/40),Xpert MTB/RIF检测结果与PCR测序结果的一致性达到100%。结论 Xpert MTB/RIF方法用于耐多药结核分枝杆菌利福平耐药检测的意义较大,可用于福建省MDR-TB的快速筛查。     

两种结核分枝杆菌快速检测方法的比较

目的比较荧光定量PCR检测和直接扩增检测两种方法对结核分枝杆菌检测的敏感性、特异性,及在国境口岸卫生检疫工作中的应用前景。方法应用结核分枝杆菌荧光定量PCR和直接扩增检测47份疑似或确诊活动性肺结核空腹痰标本,并与液体培养结果进行比较。结果荧光定量PCR法与直接扩增法对结核分枝杆菌检测敏感性分别为46.7%和100%,特异性分别为81.2%和84.4%。结论结核分枝杆菌直接扩增检测是一种较为敏感而特异的快速检测方法,在国境口岸卫生检疫部门具有重要的应用价值。     

结核分枝杆菌利福平耐药株rpoB基因突变特征研究

目的了解郑州市结核分枝杆菌耐利福平临床分离株的相关耐药rpoB基因突变特征。方法应用PCR方法对40株结核分枝杆菌利福平耐药、40株结核分枝杆菌利福平敏感临床分离株及1株H37Rv结核分枝杆菌标准株中包含"利福平耐药决定区(RRDR)"在内的rpoB基因片段(385bp)进行扩增,并将扩增产物进行测序,以H37Rv结核分枝杆菌标准株的DNA序列作为参比序列,分析结核分枝杆菌临床分离株的突变特征。结果 40株结核分枝杆菌利福平敏感临床分离株及1株H37Rv结核分枝杆菌标准株均未检测到突变,结核分枝杆菌耐利福平临床分离株中有36株检测到突变,突变率92.3%,且突变均位于RRDR区域内;突变位点为8个,共有8个突变类型;最常见的突变热点依次为531位点,该位点突变率为64.1%;526位点,其突变率为12.8%和516位点,其突变率为10.3%。结论 rpoB基因是郑州市结核分枝杆菌对利福平耐药的最相关基因,其中在RRDR内的531位点基因突变率最高,并可通过对rpoB基因的突变检测,对耐多药结核病进行预测。     

高分辨率熔解曲线检测结核分枝杆菌对利福平耐药性研究

目的评价高分辨率熔解曲线(high resolution melt,HRM)技术检测结核分枝杆菌对利福平耐药性的临床应用价值。方法用传统结核分枝杆菌药敏试验对新疆石河子大学人畜共患病实验室保存的50株临床分离菌进行耐药性检测。以rpoB基因的利福平耐药决定区为靶标设计引物进行高分辨率熔解曲线分析,判断分离出的结核分枝杆菌是否对利福平耐药。应用SPSS 17.0分析,以传统结核分枝杆菌药敏试验结果为标准,计算两种方法的符合率。用χ~2检测分析比例法药敏结果与高分辨率熔解曲线检测结果的差异性。用Kappa检测分析两种结果的一致性。结果药敏试验结果显示,50株菌中有1株为非结核分枝杆菌;49株中有20株同时对利福平和异烟肼耐药、1株仅对利福平耐药;HRM检测结果显示,21株对利福平耐药,28株为敏感株。以传统药敏试验为参考,HRM检测利福平耐药性的敏感性为86.36%,特异性为92.59%,经Kappa检验显示,两种方法检测结果具有高度一致性。结论 HRM可快速检测结核分枝杆菌对利福平的耐药性,具有较高灵敏度,在耐药结核病的早期诊断上有一定的应用价值。     

线性探针技术快速诊断本溪地区耐多药肺结核效果评价

目的 评价线性探针技术(LPA)在本溪地区快速检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性的特异性和敏感性。 方法 采用传统罗氏培养法培养2013年3月-2014年6月期间全市县区所有登记的414例涂阳肺结核患者痰标本,获得菌株经比例法药物敏感性试验和线性探针技术检测利福平和异烟肼耐药性,并以比例法药物敏感性试验为金标准分析线性探针方法的特异性和敏感性。 结果 经培养获得394株结核分枝杆菌菌株,与比例法药物敏感性试验相比较,线性探针技术检测利福平和异烟肼的特异性分别为97.9%和96.6%,敏感性分别为91.1%和81.3%;对耐多药检测的特异性和敏感性分别为98.8%和89.9%。 结论 线性探针技术是一快速、敏感、特异的诊断结核分枝杆菌利福平、异烟肼耐药和耐多药(MDR)的有效方法,可在本溪地区推广应用。     

PCR熔解曲线法筛查结核分枝杆菌链霉素和乙胺丁醇耐药性

目的 利用PCR熔解曲线法快速筛查结核分枝杆菌(MTB)对链霉素、乙胺丁醇耐药性,并与药敏试验结果比较,评价其应用价值.方法 收集深圳市2007-2009年331株MTB临床分离株,应用PCR熔解曲线法检测embB基因306、378～380、406和497、rpsL基因43、88及rrs基因513～517、905 ～ 908位点耐药突变,并与药敏试验结果比较.结果 以药敏试验结果为标准,PCR熔解曲线法检测MTB链霉素耐药突变的敏感性为78.6％、特异性为90.1％、准确性为86.7％;检测MTB乙胺丁醇耐药突变的敏感性为83.0％、特异性为93.3％、准确性为91.8％.PCR熔解曲线法与药敏试验检测结果具有很好的一致性.结论 PCR熔解曲线法能够快速、特异地检测MTB对链霉素、乙胺丁醇耐药突变,可用于临床筛查.     

线性探针检测技术对痰标本中耐药结核分枝杆菌快速检测的应用评价

目的评价线性探针检测技术(LPAs)直接从痰标本中检测结核分枝杆菌复合群及其对耐多药结核病的快速检测。方法连续收取193例临床涂片抗酸染色阳性的痰标本,直接用LPAs法从痰标本中进行结核分枝杆菌复合群及其对利福平和异烟肼耐药性的检测,结果与MGIT960系统药物敏感性试验以及利福平、异烟肼耐药相关基因rpoB、katG、inhA和ahpC的基因测序结果进行比较,评价线性探针检测技术从痰标本中检测耐药结核分枝杆菌的灵敏度、特异度和符合率。统计学分析采用kappa检验。结果 LPAs法对涂阳痰标本结核分枝杆菌复合群检测的灵敏度为100.0%,耐利福平、耐异烟肼和耐多药结核分枝杆菌复合群检测的灵敏度分别为96.0%(48/50)、92.8%(64/69)和90.0%(45/50),特异度分别为99.3%(142/143)、100.0%(124/124)和99.3%(142/143),符合率分别为98.4%(190/193)、97.4%(188/193)和96.9%(187/193)。结论 LPAs法能够直接从涂阳痰标本中检测耐多药结核分枝杆菌,对耐利福平和耐异烟肼菌株具有较高的灵敏度和特异度,与MGIT960系统药物敏感性试验结果的一致性较好,能够明显缩短从样本接收到得到药物敏感性试验结果的报告周期,为临床准确、快速地诊断耐多药结核病提供可靠的实验室依据,有利于耐药结核病的早期诊断。     

DNA芯片联合检测耐利福平与异烟肼结核分枝杆菌及其临床应用

目的 开发快速检测耐利福平与异烟肼结核分枝杆菌rpoB、katG、inhA基因突变的DNA芯片.方法 根据结核分枝杆菌rpoB、katG、inhA基因序列设计探针并制作基因芯片,从临床样品中分离出结核分枝杆菌的基因组DNA,PCR扩增含有上述几个基因突变位点的特异DNA片段,并事先在PCR引物的5′端作生物素标记,然后与膜条芯片上的检测特异突变位点的寡核苷酸探针进行杂交,通过生物素-链霉亲和素-过氧化物酶体系显色,直接观察突变情况,以此来判断耐药结果 .结果 35个利福平和异烟肼单耐药或多药耐药的结核分枝杆菌中有82.9%用芯片法检出的结果 与药敏培养法一致;其中利福平耐药样品突变检出率为100.0%;有20.0%异烟肼耐药的样品芯片未检出突变,可能是突变发生在芯片检测位点范围之外.结论 用DNA芯片检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药性,具有较高的特异性和敏感性,可用于临床结核分枝杆菌耐药性检测.     

应用探针熔解分析法检测结核分枝杆菌rpoB基因突变

目的 研究结核分枝杆菌利福平耐药突变实时PCR检测试剂盒(探针熔解分析)的临床应用价值.方法 用37株非结核分枝杆菌考察该方法的特异性,用菌株H37Rv考察其检测限,并检测962份结核分枝杆菌培养标本的rpoB基因利福平耐药决定区突变,检测结果经测序验证.结果 37株非结核分枝杆菌中仅有3株出现耐药突变峰,检测限考察结果表明该方法每反应可重复检出30个菌.用该试剂盒检测962份标本,检出突变株186份,野生株751份,扩增失败标本25份.选取2009年11月以后的标本中试剂盒检出为突变的标本112份,并数字表法随机选取200份试剂盒检出为阴性的标本,进行测序验证,除5份测序失败其余107份标本的DNA序列分析结果与试剂盒检测结果一致.结论 该试剂盒准确快速,方便易行,是检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的有力工具.

Abstract：

Objective To evaluate the clinical performance of a probe melting analysis ( PMA)-based real-time PCR detection kit in rapid detection of rifampin-resistant mutations in Mycobacterium tuberculosis (MTB). Methods The specificity of the assay was evaluated by detecting 37 non-tuberculous mycobacteria (NTM) ,and the detection limit of the method was evaluated by genomic DNA of a standard strain H37Rv. Finally, 962 clinical isolates were analyzed with the PMA assay by detecting mutations in rifampin resistance-determining region (RRDR) of rpoB gene, and results were verified with DNA sequencing. Results Among 37 NTM strains,three strains showed drug resistant mutation signals. The PMA method could detect down to 30 bacteria per reaction. Sample analysis showed that 186 of 962 isolates were mutants,751 isolates were wild type and 25 isolates failed to give amplification signals. Among the mutant samples detected, 112 samples from November 2009 to April 2010 were further analyzed by sequencing, as well as 200 wild-type samples. The results showed a complete agreement with the PMA assay except for 5 samples failed in sequence analysis. Conclusion The PMA assay is rapid, accurate and easy-to-use, and thus can be used for detection of rifampin-resistant in clinical isolate samples.     

TaqMan-MGB荧光定量PCR快速检测痰结核分枝杆菌异烟肼耐药效果的评价

目的评价通过检测结核分枝杆菌katG基因突变以诊断异烟肼耐药并检测结核分枝杆菌的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。方法收集临床诊断为肺结核病的患者痰样本,用已建立的荧光PCR方法进行检测,与常规痰涂片抗酸染色、分枝杆菌培养和传统比例法药敏试验比较,评价检测结核分枝杆菌敏感性和特异性及异烟肼耐药的特异性和敏感性。统计学分析采用χ2检验,P值<0.05为差异有统计学意义。结果荧光定量PCR共检测186份痰液样本,敏感性为84.47%,特异性为100.00%。在确诊病人的痰液中阳性检出率84.47%,明显高于痰涂片40.99%(χ2=46.44,P<0.01),痰培养40.37%(χ2=47.89,P<0.01),且差异有统计学意义。其中荧光PCR在菌阳痰液中检出率94.44%,涂阴培阴的痰液中检出率75.28%。与常规药敏试验结果比较,培养阳性的61份痰样本的药敏符合率96.72%(59/61),敏感性33.33%(1/3),特异性100.00%(58/58)。结论 TaqMan-MGB荧光定量PCR的方法能特异、灵敏、快速诊断痰液中的结核分枝杆菌及其异烟肼耐药性。     

1699例结核分枝杆菌对利福平和异烟肼药物耐药性分析

目的分析结核分枝杆菌对利福平(RFP)和异烟肼(INH)的耐药情况,为结核病的防治、管理、制定控制策略提供科学的依据。方法采用WHO推荐的结核病耐药性监测的抗结核药物敏感试验比例法,对1 699例临床分离株进行耐药性测定。结果 1 699例结核分枝杆菌分离株中,耐RFP菌株112例,耐INH 165例,RFP的耐药率为6.6%,INH的耐药率为9.7%。在112例耐RFP中,INH同时耐药者83例,占RFP耐药株总数的74.1%;在165例耐INH中,RFP同时耐药者83例,占INH耐药株总数的50.3%。结论耐多药肺结核的诊断还是遵循同时进行抗结核药物RFP和INH药敏试验稳妥。     

47株结核分枝杆菌利福平耐药决定区基因突变特征的研究

目的了解吉林省结核分枝杆菌的利福平耐药决定区(RRDR)基因突变特征。方法结核分枝杆菌(MTB)分离自2008-2009年吉林省临床肺结核病人的痰液标本,培养方法为改良酸性罗氏(L-J)培养基。分离出的抗酸杆菌经对硝基苯甲酸(PNB)培养基初步鉴定后选出结核分枝杆菌复合群并应用比例法进行药敏试验(DST)。根据DST结果,选择22株利福平耐药株、22株利福平敏感株以及3株临界值标本进行聚合酶链式反应(PCR)扩增rpoB中包含RRDR在内的部分基因,阳性DNA片段通过基因测序以及Bioedit软件分析方法比对基因突变情况。结果 22株利福平耐药株中,16株同时对异烟肼耐药;22株利福平敏感株中,1株异烟肼耐药。利福平耐药菌株中,95%(21/22)的菌株在利福平耐药决定区RRDR发生了基因突变,其中第531位密码子突变频率占50%,第526位占27%,第533位占9%,第516位及513位均为4.5%;22株利福平敏感株中,RRDR区全部无基因突变发生;3株临界值标本中,1株在第531位密码子发生了基因突变,1株在533位发生基因突变,最后1株无突变。结论 RRDR区点突变的发生与利福平耐药高度一致;异烟肼耐药与利福平耐药高度相关。     

GeneXpertMTB/RIF和Hain技术对痰涂片阴性肺结核诊断价值及利福平耐药性的评估

目的探讨利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(GeneXpertMTB/RIF)、线性探针(Hain)技术对痰涂片阴性肺结核的诊断价值及利福平耐药性的评估价值。方法选择2018年3月至2019年6月上海市浦东新区肺科医院收治的3次痰涂片阴性的疑似肺结核患者254例,对其行痰GeneXpertMTB/RIF、痰Hain技术、痰罗氏培养、绝对浓度法药敏试验。以痰罗氏培养结果为金标准,采用受试者工作特征曲线(ROC)分析GeneXpertMTB/RIF、Hain技术检测痰涂片阴性肺结核的效能;以绝对浓度法药敏试验结果为金标准分析GeneXpertMTB/RIF、Hain技术检测利福平耐药的效能。结果GeneXpertMTB/RIF诊断痰涂片阴性肺结核的敏感度、特异度、准确度分别为82.18%、86.93%、83.52%;Hain技术诊断痰涂片阴性肺结核的敏感度、特异度、准确度分别为67.33%、77.12%、73.23%;GeneXpertMTB/RIF评估利福平耐药性的敏感度、特异度、准确度分别为73.33%、98.84%、95.05%;Hain技术评估利福平耐药性的敏感度、特异度、准确度分别为86.67%、82.56%、83.17%。结论GeneXpertMTB/RIF对痰涂片阴性肺结核的诊断价值及利福平耐药性的评估价值优于Hain技术,GeneXpertMTB/RIF对痰涂片阴性肺结核的快速诊断及治疗具有较好的应用价值。     

荧光置换探针多重实时PCR检测结核杆菌3种耐药突变

[目的]建立单管检测结核分枝杆菌3种耐药突变的多重实时PCR检测方法,考察其敏感性并应用于痰标本的检测。[方法]将荧光双链置换探针、实时PCR和多重PCR相结合,针对3种一线药物链霉素、异烟肼和乙胺丁醇中最常见的且都是由于点突变而导致的耐药突变位点进行检测。[结果]该检测体系可以检测到5个菌/test。用该体系检测9份已知基因型的结核分枝杆菌培养标本和118份痰标本,所有检测结果均通过ARMS体系验证。[结论]该检测体系具有很高的敏感性和特异性,检测快速,测定突变位点范围较其它技术有较大提高,且操作简便,有利于结核病菌的早期耐药检测和指导医生用药。     

杭州地区结核分枝杆菌氧氟沙星耐药株的MIRU-VNTR基因分型研究

目的：探讨MIRU-VNTR技术在杭州地区结核分枝杆菌氧氟沙星耐药株基因分型中的应用。方法收集杭州市2010年4月-2012年6月各结核病定点医院分离培养的临床菌株,进行药物敏感性检测。分别采用RD105缺失基因检测法和MIRU-VNTR技术对氧氟沙星耐药株进行菌株鉴定和基因分型。结果筛选出的52株氧氟沙星耐药株中,43株（82.69%）为北京家族菌株。经12个MIRU-VNTR位点组合分析,52株氧氟沙星耐药株呈52种MIRU-VNTR基因型,总Hunter-Gaston指数（ HGI）为0.999。除MIRU40和ETR-F外,其他10个MIRU-VNTR位点对北京家族菌株和非北京家族菌株均显示较高或中等程度的分辨率。结论筛选到的10个MIRU-VNTR位点具有较高分辨率,适用于杭州地区结核分枝杆菌氧氟沙星耐药株分型。     

3种荧光定量聚合酶链反应试剂筛查入境人员中疑似肺结核病例的效果比较

目的比较3种荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)试剂检测痰标本中结核杆菌的灵敏度和特异性,探讨FQ-PCR在国境口岸快速检测结核病人的价值。方法对129例疑似肺结核患者的痰标本分别采用FQ-PCR试剂法、痰涂片抗酸染色法、改良罗氏培养法检测结核分枝杆菌;以培养法为金标准比较艾康、匹基和博奥3种FQ-PCR试剂的特异性和灵敏度。结果艾康检测疑似肺结核病病例、涂片镜检阳性和涂片镜检阴性者的灵敏度为90.12%、93.55%、78.95%,特异度为95.65%、100%、95.65%;匹基检测疑似肺结核病病例、涂片镜检阳性和涂片镜检阴性者的灵敏度为87.50%、95.16%、61.11%,特异度为100%、100%、100%;博奥检测疑似肺结核病病例、涂片镜检阳性和涂片镜检阴性者的灵敏度为86.59%、95.24%、57.89%,特异度为100%、100%、100%。结论 FQ-PCR是一种简便快速方法,对于涂片镜检阳性结核病病例的检测具有很高的敏感性和特异性,对于涂片镜检阴性结核病病例检测有很高的特异性,适于国境口岸出入境人员中结核病病例的快速检测。