小鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养

探索在体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞 (Bone m arrow m esenchym al stem cells,BMSCs)的最适条件。以密度梯度离心技术及贴壁筛选法相结合 ,在体外分离 BAL B/C小鼠的 BMSCs,通过 MTT法测定了不同离心力、不同换液时间、不同血清浓度、不同种植密度等因素对 BMSCs分离和培养的影响。在 5 0 0 g× 30 min的离心力下分离细胞 ,加入 10 %的胎牛血清 ,原代按 (12～ 2 0 )× 10 5/m l的细胞密度接种 ,接种 2 4 h后换液 ,继代种植密度为 6 .4～ 2 5 .6× 10 4 /ml时最适宜细胞生长 ;在此条件下 ,细胞快速增殖 ,传代后 8h贴壁达 90 %以上 ,2 4 h便进入对数生长期 ,直至第 5 d,细胞约增殖 3倍。本研究建立了在体外分离培养骨髓间充质干细胞的细胞生物学方法和技术参数。     

人骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的 建立人胚骨髓间充质干细胞(MSCs)分离及培养的方法，探讨体外培养MSCs的生物学特性．方法 通过密度梯度离心、贴壁法分离培养人胚MSCs，在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化．应用流式细胞术测定细胞周期和CD44、CD34、CD45表达，并研究其增殖及生长特征．结果 原代及传代培养显示，14代以前的MSCs具有活跃的增殖能力，细胞周期分析显示有82％的MSCs处于Gp／Gl期．MSCs阳性表达CD44，阴性表达CD34、CD45．结论 体外培养14代以前的的MSCs生长稳定，增殖较快，可作为组织工程的种子细胞．     

犬骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定

目的建立犬髂骨骨髓间充质干细胞分离、培养的方法,并对间充质干细胞进行鉴定。方法采用密度梯度分离和贴壁培养相结合的方法分离培养犬的骨髓间充质干细胞(MSCs),并诱导间充质干细胞向成骨细胞、成脂肪细胞方向分化。相差显微镜观察其形态学变化,组化染色测定其分化结果。结果原代培养4～5d,镜下见细胞呈梭形或多角形,有较多的突起,胞核明显呈卵圆形,可见1-3个核仁,胞质丰富。成骨方向诱导形成的矿化结节茜素红染色阳性,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色阳性;成脂方向诱导形成的脂肪细胞苏丹Ⅳ染色阳性。结论采用密度梯度分离和贴壁培养相结合的方法能够成功分离和培养犬的骨髓间充质干细胞。     

两种不同方法分离兔骨髓间充质干细胞的生物学特性研究

目的比较两种不同方法分离兔骨髓间充质干细胞在体外培养环境下的生长增殖及表型特点，为软骨组织工程提供种子细胞。方法行全骨髓培养法和梯度密度离心培养法分离骨髓间充质干细胞，用倒置显微镜、透射电镜观察细胞生长状况，^3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷（^3H—TdR）掺入实验检测细胞的增殖情况，对骨髓间充质干细胞进行表型鉴定。结果今骨髓培养法的骨髓间充质干细胞，原代培养周期为14天，原代及传代细胞一致表达CD44，细胞^3H—TdR掺入实验每分钟脉冲数为15250cpm；梯度密度离心法的骨髓间充质干细胞，原代培养周期为28天，原代及传代细胞表达CD44，细胞^3H—TdR掺入实验每分钟脉冲数为13570cpm。结论用全骨髓培养法培养骨髓间充质干细胞不失为一种很好的方法。     

人骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的建立人胚骨髓间充质干细胞(MSCs)分离及培养的方法,探讨体外培养MSCs的生物学特性.方法通过密度梯度离心、贴壁法分离培养人胚MSCs,在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化.应用流式细胞术测定细胞周期和CD44、CD34、CD45表达,并研究其增殖及生长特征.结果原代及传代培养显示,14代以前的MSCs具有活跃的增殖能力,细胞周期分析显示有82%的MSCs处于G0/G1期.MSCs阳性表达CD44,阴性表达CD34、CD45.结论体外培养14代以前的的MSCs生长稳定,增殖较快,可作为组织工程的种子细胞.     

成年大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离

目的应用全骨髓贴壁法和密度梯度离心法以不同培养条件,探讨体外获得高质量、高活性的成年大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的方法。方法取成年雄性SD大鼠双侧股骨,应用全骨髓贴壁法,分为10%国产TBD胎牛血清+DMEM组、10%国产TBD胎牛血清+DMEM/F12组、12.5%国产TBD胎牛血清+DMEM/F12组、10%进口以色列胎牛血清+DMEM/F12组4组,3只/组;应用密度梯度离心培养法,以10%进口以色列胎牛血清+DMEM/F12作为培养基,取3只大鼠作为一组。比较不同培养方法及培养条件对BMSCs生长增殖的影响。结果全骨髓贴壁法中10%进口以色列胎牛血清+DMEM/F12组原代细胞即可7～9 d达融合,传代到第4代细胞活力仍很好。其余3组原代细胞达融合的时间均超过10 d,且传代后细胞活力差,容易出现老化。密度梯度离心培养法原代贴壁细胞太少,无法达融合。结论本实验采用的培养方法中,10%进口以色列胎牛血清+DMEM/F12培养基的全骨髓贴壁分离法,是体外获取成年大鼠BMSCs最佳方法。     

人骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

目的:探讨密度梯度离心结合贴壁筛选法分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)的条件,为组织工程选择合适的种子细胞奠定基础.方法:采用密度梯度离心法将人MSCs自少量骨髓中分离并培养,观察其增殖和生长特性,绘制生长曲线,测定贴壁率,免疫组化与流式细胞仪细胞表型鉴定.结果:人MSCs生物性状稳定.不同代次生长曲线相似,第5～6d细胞数日最多;传代后10 h贴壁率高达90%.MSCs表达CD44、CD90,但不表达CD34、CD45.结论:密度梯度离心法是分离人MSCs的理想方法.MSCs能为组织工程提供足量种子细胞.     

小鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法的建立

目的建立培养小鼠骨髓间充质干细胞(none mesenchymal stem cells,BMSCs)的分离培养方法。方法采用全骨髓体外分离并采用差速贴壁法纯化扩增C57BL/6小鼠BMSCs,形态学观察细胞生长情况,流式细胞仪检测其表面抗原情况并观察其多项分化潜能。结果使用该方法纯化扩增的BMSCs形态均一,生长良好,表达CD29、CD44和Sca-1,不表达CD11b、CD45和CD34,并具有成骨成脂潜能。结论通过全骨髓贴壁法可以成功的分离培养出小鼠BMSCs。     

胎儿骨髓间充质干细胞的分离培养及表面标志的检测

目的 建立胎儿骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC)的分离培养方法，并对其表面标志进行检测。方法 采用体外细胞培养技术，分离培养胎儿骨髓MSC，用流式细胞术对其进行鉴定，并研究其增殖及生长特征。结果 流式细胞术证明，MSC具有间质细胞的特征。原代及传代培养显示，胎儿骨髓MSC具有活跃增殖的能力。结论 胎儿骨髓MSC作为组织工程重建的种子细胞具有较强的可行性。     

恒河猴骨髓间充质干细胞的分离、培养及传代扩增

目的 建立成年恒河猴骨髓间充质干细胞(rMSC)体外分离、培养及传代扩增的有效体系,为探索新型人工生物骨替代材料提供种子细胞.方法 从恒河猴肋骨抽取骨髓,使用淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque)密度梯度离心法分离骨髓细胞.用含10%胎牛血清(FCS)的低糖DMEM培养基贴壁培养、胰酶消化传代扩增.通过形态学及流式细胞技术对rMSC进行细胞周期分析及表型特征鉴定.结果 成年恒河猴骨髓来源的rMSC为成纤维样细胞群体,以梭形的成纤维样细胞为主.流式细胞技术结果 显示,rMSC表达CD29、CD44表面分子,不表达CD34、CD45等造血细胞特异性表面分子.结论 成年恒河猴骨髓来源的rMSC的分离、培养及传代扩增的细胞群中无造血系细胞污染且符合干细胞增殖特性,为探索新型人工生物骨替代材料的种子细胞提供了一个可靠来源.     

小鼠骨髓间充质干细胞在体内向肝细胞的转化

为探讨小鼠骨髓间充质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)在体内向肝细胞转化的可能性,将来源于6-8周龄雄性BALB/c小鼠的BMSCs,通过尾静脉注射或经皮肝穿刺直接注入肝脏组织的途径移植入同源正常雌鼠体内。分别于移植术后1、2、4周处死受体雌鼠,取其肝组织,通过荧光原位杂交法(FISH)和免疫组化法同时检测Y染色体的存在和白蛋白的表达,以观察确定所注入的BMSCs在受鼠体内向肝细胞转化的情况。采取经皮直接肝穿刺注射途径移植BMSCs的两个实验组,无论移植细胞是新鲜分离的、还是P3代BMSCs,均可于移植后1周,在受鼠肝脏内检出Y染色体阳性细胞的存在,此类阳性细胞并可同时表达白蛋白。另一方面,经尾静脉注射法进行移植的实验组,于移植后2周,也可在其肝组织内检测到同时表达Y染色体和白蛋白的细胞。本研究证明了骨髓间充质干细胞在体内向肝细胞转化的可能性。     

三种高分子支架对骨髓基质细胞生长影响的研究

研究高分子复合支架聚乳酸均聚物(PLA)、聚乳酸/聚乙二醇共聚物(PLA-PEG)和聚乳酸/聚乙醇酸共聚物(PLGA)对骨髓基质细胞(M SC)黏附、增殖和分化的影响。分离、纯化兔骨髓基质细胞,分别和3种支架材料共培养。在不同时间段,应用细胞计数,碱性磷酸酶(ALP)定量分析,四环素荧光染色,扫描电镜,RT-PCR的方法,观察细胞在3种材料上生长,黏附和矿化沉积情况。结果表明细胞在3种支架材料上生长良好,PLGA上细胞生长的数量最多,其次是PLA-PEG、PLA,呈时间依赖性增加。3种材料上的细胞均表达ALP活性,PLA-PEG和PLGA组的ALP活性无差异,但显著高于PLA组,差异有显著性。RT-PCR反应可检测到骨钙素和纤维I型胶原在mRNA水平的表达。扫描电镜见细胞最初呈球形附着于材料上,7 d后细胞数量增加并分泌细胞外基质。两周后可见钙化结节形成,四环素荧光呈黄绿色染色。结果提示M SC细胞能较好的黏附于3种聚合物支架上,生长良好,并表达一定的成骨潜能,但PLA共聚物PLA-PEG和PLGA优于PLA均聚物,有望成为较好的构建组织工程骨的支架。     

去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞体外成脂肪分化能力的研究

探讨不同月龄、去卵巢对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向脂肪细胞分化能力的影响。选用健康3月龄和6月龄Spraque-Dawley(SD)雌性大鼠行双侧卵巢切除术,建立骨质疏松症的动物模型;使用密度梯度离心法分别获取各组骨髓间充质干细胞(MSCs),体外培养传至3代,加入成脂肪诱导液进行诱导,油红O染色观察细胞内脂滴;并用RT-PCR法检测成脂肪分化标志物脂蛋白脂酶(LPL)mRNA表达水平。实验分为8组:1)3月龄正常大鼠骨髓间充质干细胞组(MSCs3control);2)3月龄去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞组(MSCs3ovx);3)6月龄正常大鼠骨髓间充质干细胞组(MSCs6control);4)6月龄去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞组(MSCs6ovx);5)3月龄正常大鼠骨髓间充质干细胞成脂肪诱导组(MSCs ADI3control);6)3月龄去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞成脂肪诱导组(MSCs ADI3ovx);7)6月龄正常大鼠骨髓间充质干细胞成脂肪诱导组(MSCs ADI6control);8)6月龄去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞成脂肪诱导组(MSCs ADI6ovx)。结果显示:(1)年老组大鼠MSCs成脂肪细胞分化能力大于年幼组大鼠;(2)成脂肪诱导后,成脂肪诱导各组MSCs胞浆内均有脂滴形成,MSCs ADI3ovx和MSCs ADI6ovx明显多于相应对照组。(3)成脂诱导后,与相应的对照组相比,MSCs ADI3ovx和MSCs ADI6ovx LPL mRNA表达水平明显增高。研究结果表明,年老组和去卵巢骨质疏松大鼠(MSCs)向脂肪细胞分化能力皆增强。     

骨髓间充质干细胞在肝部分切除模型小鼠体内向肝细胞分化

以含20%胎牛血清的DM EM低糖培养基,原代细胞直接贴壁培养,48 h后换液继续培养,分离BALB/C小鼠的骨髓间充质干细胞,该细胞分为CD44 CD29 与CD44-CD29 两群。将第5代骨髓间充质干细胞注入部分肝切除小鼠肝右叶,术后5 d和14 d分别处死动物,测体重、肝重与肝功,制备肝组织芯片,原位杂交和免疫荧光同步检测Y染色体与肝细胞标记(白蛋白或CK 18),并作图像叠加。发现移植组小鼠在移植后5 d与14 d在注射肝叶与非注射肝叶内皆可检出大量同时表达Y染色体与白蛋白及Y染色体与CK 18的细胞。术后14 d,移植组肝重与肝脏器指数高于模型组。表明骨髓间充质干细胞能在有再生需求的小鼠体内向肝细胞分化并参与再生。     

猪骨髓间质干细胞分离培养及表面抗原鉴定

目的 建立猪骨髓间质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSC）体外分离培养、纯化的方法,观察其生物学特性,为其作为组织工程学种子细胞提供实验基础.方法 取猪的胸骨骨髓6～8ml,用Ficoll淋巴细胞分离液提取单核细胞,采用贴壁法培养.接种后2h利用倒置显微镜观察细胞的大体形态,并利用流式细胞仪检测细胞抗原表达.结果 原代培养接种3～4h后细胞开始贴壁,24h后贴壁细胞数量明显增多,3～4d后细胞呈纺锤形且形成为单个或数个细胞克隆,7～9d后集落迅速增多,细胞融合,在10～12d细胞铺满全层.流式细胞仪监测到BMMSC表达CD29、CD44、CD105、KDR,不表达HLA-DR、CD11a、CD14、CD31、CD34、CD45.结论 采用密度梯度离心法培养猪的BMMSC生长稳定,增殖能力强,具有间质干细胞的表面抗原特征,该方法可作为培养猪BMMSC的常规方法.     

力学应变对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化能力的影响

探讨周期性双轴力学应变对大鼠骨髓间充质干细胞(M esenchym a l stem ce lls,M SC s)增殖和成骨分化能力的影响。选用9月龄健康SD雌性大鼠,分离股骨、胫骨提取骨髓,采用密度梯度离心法分离M SC s。体外培养M SC s传至第3代,以1×105细胞浓度接种于双轴力学应变系统,选取4 000μstra in,频率为1hz的力学应变对M SC s加载。每天加载3次,每次2 h,间隔2 h。观察力学应变作用后1 d、3 d,M SC s增殖和成骨分化能力的变化,并与相应未加力学应变对照组比较。结果表明:(1)力学应变可增高M SC s的碱性磷酸酶(ALP)和骨桥蛋白(OPN)表达量;力学应变作用3 d后M SC s的ALP和OPN表达量明显高于力学应变作用1 d。I型胶原(COL I)仅在力学应变作用3 d增高;骨钙素(OCN)在各组无明显变化。(2)力学应变可促进M SC s增殖,但力学应变作用1 d和3 d对M SC s增殖的作用无明显差异。上述结果提示:力学应变可以促进M SC s的增殖和成骨分化能力。     

碱性成纤维细胞生长因子对骨髓间充质干细胞向颞下颌关节盘细胞分化的影响

为观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化的影响,采用bFGF诱导山羊BMSCs,通过组织学、免疫组织化学和酶联免疫吸附实验(ELISA)等方法检测BMSCs产生的细胞外基质(ECM)包括Ⅰ型胶原和蛋白多糖的情况,初步评价BMSCs做为颞下颌关节(TMJ)盘组织工程种子细胞的可行性。结果表明:经bFGF诱导,BMSCs向成纤维细胞样细胞分化,能够合成糖胺聚糖(GAG)和I型胶原,因此认为BMSCs作为工程化关节盘种子细胞是可行的。     

骨髓间充质干细胞研究进展

骨髓间充质干细胞是骨髓中除造血干细胞外的另一类具有自我更新和多向分化潜能的干细胞,在特定的诱导条件下可向三个胚层的细胞分化。本文就骨髓间充质干细胞的生物学特性、分离培养、活体示踪标记方法、诱导分化等方面的研究进展做一综述。     

Mesenchymal Stem Cells from Human Bone Marrow and Adipose Tissue: Isolation,Characterization, and Differentiation Potentialities

Comparative study of cultured human bone marrow and adipose tissue (lipoaspirate) mesenchymal stem cells was carried out. The main morphological parameters, proliferative activity, expression of surface and intracellular markers of these cells were characterized. Flow cytofluorometry and histological staining showed that both cell types exhibited similar expression of CD105, CD54, CD106, HLA-I markers, were positively stained for vimentin, ASMA, collagen-1, and fibronectin, but not HLA-DR, CD117, and hemopoietic cell markers. The cells underwent differentiation into adipocytes and osteoblasts under appropriate conditions of culturing. Incubation under neuroinductive conditions led to the appearance of a cell population positively stained for type III β-tubulin (neuronal differentiation marker). __________ Translated from Kletochnye Tekhnologii v Biologii i Meditsine, No. 3, pp. 158–163, September, 2005