非病毒载体聚乙烯亚胺介导DNA转染的研究

目的研究新型非病毒类载体聚乙烯亚胺(PEI)的最适转染条件。方法分析各种因素对25 ku线性PEI转染效率的影响,优化实验条件。结果PEI与DNA的质量比≥2能保证DNA与PEI完全结合,最佳混合时间为10 min,但血清的存在将降低其结合效率。在一定范围内提高PEI与DNA的质量比有利于提高转染效率。293T细胞最适转染密度为培养面积的80%。结论确定了PEI转染细胞的最优条件。     

聚乙烯亚胺用作基因转染的研究进展

 基因载体问题以及与载体相关的免疫反应、细胞毒性和安全性等问题，是基因治疗领域亟待解决的关键问题之一。聚乙烯亚胺（PEI）是阳离子聚合物非病毒载体的典型代表^[1]，是一种很早便为人所知并予以应用的有机大分子。目前，以 PEI 阳离子聚合物与 DNA 形成的 PEI/DNA 复合物已成为非病毒基因载体的研究热点。本文就近年来这方面的研究进展作简要综述。 1 PEI的特性 PEI 每 3 个原子中有 1 个胺基原子，使其具有较高正电荷密度。根据 pH 与质子作用之间的对应关系可得出：自由 PEI 的结构在生理条件下有 1/6 至 1/5 胺基发生质子化反应，从而使溶酶体肿胀破裂，从而起到“质子海绵”作用，使 PEI/DNA 复合物得以释放入胞质，很大程度上减少了 DNA 在吞噬泡内富集并进而被降解的作用，因而可以提高转染效率^[2]。     

新型非病毒载体聚乙烯亚胺介导基因转染参数的研究

聚乙烯亚胺是一种新型阳离子多聚物基因释放载体,可结合浓缩DNA,通过粘附内吞,进入细胞,使携带的质粒表达。本研究目的通过对聚乙烯亚胺各种转染参数的测定,为合成以聚乙烯亚胺为骨架的人工载体积累数据。方法:本研究利用聚乙烯亚胺分别结合含β半乳糖甙酶报告基因的pSVβ表达质粒、含绿色荧光蛋白报告基因的pEGFP质粒转染Cos-7细胞,通过组织化学法测定细胞抽提产物中β半乳糖甙酶的表达量、流式细胞仪法测定绿色荧光蛋白阳性细胞的表达比例,来测定影响转基因效率的各种参数。结果:在培养液中,6μg/ml聚乙烯亚胺作用24h,NIH 3T3细胞生存率为64.2%,7μg/ml聚乙烯亚胺细胞生存率为54.4%。电泳阻滞试验,聚乙烯亚胺在N/P比在3.0以上方可完全结合DNA。溶酶体抑制剂氯喹可增加聚乙烯亚胺的转染效率。培养液中的白蛋白、血清可降低转染效率。作为配制聚乙烯亚胺/DNA复合物的溶媒,HEPES缓冲液优于生理盐水,生理盐水优于5%葡萄糖。配制聚乙烯亚胺/DNA复合物的溶媒中加入Mg2+降低转染效率。聚乙烯亚胺转染效率优于SuperFectTM(断裂型树突状多聚物),而毒性低于SuperFectTM。结论:本研究首次报道了聚乙烯亚胺与DNA结合配伍的N/P比计算公式,N/P=7.75×b/c,这里b是PEI的质量(μg),c是质粒的质量(μg);PEI的工作终浓度应≤6μg/ml。通过体外细胞试验证明,聚乙烯亚胺是一种有效的真核细胞转染剂和人工合成基因载体的骨架。     

非病毒载体聚乙烯亚胺转基因因素的优化

聚乙烯亚胺属于阳离子多聚物,可浓缩DNA作为转基因非病毒载体。但其转染影响变量较多,如果不能充分控制将不能得到重复的、良好的结果。这里测定了聚乙烯亚胺转基因效率的影响因素,为合成更复杂的人工转基因载体创造条件。我们通过聚乙烯亚胺转染编码β-半乳糖苷酶的pSVβ质粒到CO S-7和N IH 3T 3细胞中,测定质粒因素、血清、细胞密度、操作方式以及转染复合物的保存因素对聚乙烯亚胺转基因效率的影响。结果表明:质粒中生物活性抑制剂明显降低转染效率,通过截流分子量3000或10000的超滤可以除去生活性抑制剂;断裂的质粒降低转染效率;培养液中的血清、白蛋白降低转染效率;细胞密度影响转染效率;PE I/DNA复合物与细胞作用8h后吸去,转染效果最优。冻存显著降低PE I/DNA转染复合物转染效率。聚乙烯亚胺可以作为合成新型非病毒载体的骨架,但必须控制有关因素才能发挥最佳的和可重复性的转染结果。     

聚乙烯亚胺-蛋白纳米复合体转染蛋白进入骨髓间充质干细胞的应用研究

目的:探索纳米材料聚乙烯亚胺(PEI)携载不同分子量的蛋白质转染进人骨髓间充质干细胞(h BMSCs)的作用及优化其最佳配比条件。方法:利用物理化学作用构建6组PEI-DNase I(DNA酶I)复合体,运用激光散射技术初步摸索其最佳摩尔比,用透射电镜直观复原纳米-蛋白复合体外貌;同时,原代分离培养健康人的骨髓间充质干细胞并进行体外扩增,通过构建成功的4组PEI-GFP(绿色荧光蛋白)纳米蛋白复合体对h BMSCs进行转染,共聚焦荧光显微镜下观察荧光表达情况,再通过MTT法检测该复合体对细胞增殖的毒性影响,并用β-半乳糖苷酶实验验证其转入蛋白的活性表现。结果:当PEI与蛋白质的摩尔比为4∶1时,形成的复合体转染效率最高,β-半乳糖苷酶实验细胞染色变蓝。结论:PEI能与蛋白质形成纳米复合体,并能转染多种蛋白质进入人骨髓间充质干细胞,所转染的蛋白质分子仍具有活性,为细胞重编程技术提供了新途径。     

聚乙烯亚胺-壳聚糖/DNA纳米粒的制备及介导体外转染关节软骨细胞

背景：壳聚糖对软骨细胞具有良好的生物相容性和可降解性,但存在基因转染效率偏低的缺陷。 目的：构建负载增强型绿色荧光蛋白基因的聚乙烯亚胺-壳聚糖/DNA纳米粒,检测其理化性能,以及体外对关节软骨细胞的基因转染效率。 方法：将聚乙烯亚胺共价连接于壳聚糖骨架上构建聚乙烯亚胺-壳聚糖复合物,再将聚乙烯亚胺-壳聚糖与负载增强型绿色荧光蛋白基因的质粒DNA以复凝聚法制成纳米粒,以扫描电镜检测纳米粒形态,Zeta电位粒度分析仪测定其粒径、表面电位;凝胶电泳阻滞实验观察聚乙烯亚胺-壳聚糖和质粒DNA的结合力。以聚乙烯亚胺-壳聚糖/DNA纳米粒、裸质粒DNA、脂质体2000及壳聚糖/DNA纳米粒转染体外培养的兔关节软骨细胞,流式细胞仪及荧光显微镜检测基因转染率;激光共聚焦显微镜检测DNA的入核情况。 结果与结论：聚乙烯亚胺-壳聚糖/DNA纳米粒多呈球形,粒径为(154.6±18.6) nm,表面Zeta电位为(24.68± 6.82) mV,可有效保护质粒DNA免受 DNaseⅠ的降解。体外转染实验证明聚乙烯亚胺-壳聚糖/DNA纳米粒能介导增强型绿色荧光蛋白基因转染关节软骨细胞并在细胞内表达绿色荧光蛋白,转染率达(23.80±1.74)%,转染率高于裸质粒DNA组及壳聚糖/DNA纳米粒组(P < 0.05),与脂质体2000组无显著差别(P=0.522)。表明聚乙烯亚胺-壳聚糖/DNA纳米粒能有效保护质粒DNA免受核酸酶降解,对关节软骨细胞有良好的基因转染能力。     

流式细胞仪三标记法检测白细胞介素-10对人树突状细胞表型的影响

目的观察白细胞介素(IL)10对体外培养人树突状细胞(DC)表型的影响,探讨流式细胞术三色荧光标记抗体检测细胞表面抗原的方法及意义。方法通过SCF、GMCSF、TGFβ1、Flt3和TNFα体外培养体系,将脐血CD34+造血干细胞诱导扩增获得DC,并于成熟过程中用重组人IL10进行干预。采用流式细胞术的三色荧光标记(FITC、PE、CY)单克隆抗体直接检测技术,分析细胞表型CD1a、CD11c、CD83、CD80、CD86和HLADR。结果IL10可下调成熟中DC表面CD11c、CD83、CD80和CD86的表达。结论IL10通过抑制DC表面黏附共刺激分子表达,可调节DC的递呈抗原功能;此外,采用流式细胞仪的三色荧光标记检测方法,不仅可以节约DC细胞用量,而且具有快速和准确的优点,值得推广应用。     

CD80/IgG融合基因真核表达载体的构建及在CHO细胞中的表达

目的：构建CD80/IgG真核表达载体，使其在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中呈分泌型表达，为白血病免疫基因治疗的研究奠定基础。 方法： 采用多聚酶链反应（PCR）技术分别从小鼠脾细胞和含小鼠CD80全长互补DNA（cDNA） 的质粒pcDNA/B7中扩增出免疫球蛋白IgG1的Fc段和CD80胞外区，以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.0中，获得重组表达载体pcDNA/CD80-IgG；采用脂质体转染技术转染CHO细胞,G418筛选得到稳定表达细胞株；免疫印迹、斑点ELISA及流式细胞术鉴定融合蛋白的表达,并初步检测其活性。 结果： DNA测序证明两段基因正确克隆至pcDNA3.0的多克隆位点，CHO细胞的培养上清中可检测到融合蛋白的表达，其分子量大小和预期的基本一致，该融合蛋白可提高白血病细胞表面CD80的表达。 结论： 成功构建pcDNA／CD80-IgG真核表达载体，并在CHO细胞中分泌性表达有活性的CD80-IgG融合蛋白。     

过表达VMAT2的CHO细胞可抵抗rotenone和MPP+的毒性作用

目的为研究毒物鱼藤酮(rotenone)和1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP )对野生型及过表达囊泡单胺转运蛋白(VMAT2)的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的毒性作用。方法将不同浓度的MPP r、otenone与野生型(WT-CHO)和过表达VMAT2的CHO细胞(VMAT2-CHO)共培养,通过形态学改变和MTT比色法检测细胞活力来观察毒物的毒性作用。结果VMAT2-CHO细胞活力明显增强,第5~7天VMAT2-CHO数量约为WT-CHO的3倍。0.2~2.0 mmol/L的MPP (P<0.05)和0.05~1.0μmol/L rotenone(P<0.01)作用72 h,VMAT2-CHO的存活率高于WT-CHO,细胞中毒后的形态改变不如WT-CHO明显。结论过表达VMAT2的CHO细胞对MPP 和rotenone的毒性作用有抵抗。     

流式细胞仪检测胶原诱导的关节炎大鼠γδT细胞胞内TNF-α和IL-10的表达

目的研究牛Ⅱ型胶原诱导的关节炎模型(CIA)大鼠外周血中γδT细胞胞内TNF-α和IL-10的表达情况,探讨其在CIA中作用的分子机制.方法于Wistar大鼠背部及尾根部多点皮内注射牛Ⅱ型胶原乳剂制作CIA模型.运用流式细胞仪,通过直接荧光标记的抗TNF-α和抗IL-10抗体来检测单个细胞水平γδT细胞胞内细胞因子的表达.结果与正常大鼠相比,CIA模型大鼠外周血中γδT细胞所占淋巴细胞的百分比显著下降(P＜0.01),γδT细胞胞内TNF-α(P＜0.01)和IL-10(P＜0.01)的表达均明显降低.结论γδT细胞在CIA中其前炎症细胞因子表达下调,可能γδT细胞在CIA的发病中不起致病作用.     

应用流式细胞术分析不同年龄大鼠脑组织细胞周期增殖特性

应用流式细胞术对不同年龄的大鼠的大脑、小脑和脑干组织的细胞周期进行分析。结果显示在相同年龄组不同部位的脑组织细胞增殖程度不均一,大脑细胞增殖明显高于小脑和脑干。同一部位的脑组织各年龄组之间细胞增殖情况亦存在差异。新生和幼年大鼠(出生后1天和21天)其脑细胞增殖较成年大鼠(6个月和1年)旺盛。实验还表明,特殊萤光素染色脑细胞DNA,然后用流式细胞仪测定DNA量,是一种简单、快速分析脑细胞增殖活性的可行技术。     

Antigen-Specific Electrophoretic Cell Separation (ASECS): Isolation of human T and B lymphocyte subpopulations by free-flow electrophoresis after reaction with antibodies

The electrophoretic mobility of human lymphocytes can be reduced by incubation with surface antigen specific antibodies under non-capping conditions. This renders subpopulations of human peripheral blood lymphocytes accessible to separation by free-flow electrophoresis.After reaction of lymphocyte preparations with anti-IgM antibody and a fluorescent second antibody, B lymphocytes showed a considerable shift in position in preparative cell electrophoresis and could be separated with high yield, purity and vitality. Similarly, a T cell subpopulation reactive with the monoclonal antibody T811 could be isolated, even though only small amounts of this antibody were bound, by using a double-sandwich method.Non-specific antibody uptake via Fc-receptors did not contribute to the observed shift of antibody-labelled cells to lower electrophoretic mobility. Flow cytometric analysis showed that cells were separated according to their antigen density.Thus cell electrophoresis can be used to separate antibody-labelled cells. With a flow rate of 100,00 cells/sec this method has a much higher separation capacity than fluorescence-activated cell sorting. The described method should be applicable to the separation of a wide range of cell populations for which specific antibodies are available.