SARS-CoV N蛋白对真核细胞基因谱的影响

N蛋白位于SARS冠状病毒（SARS-CoV）颗粒的核心，是SARS-CoV的主要结构蛋白之一，它可以与病毒基因组RNA结合。目前研究表明N蛋白可以选择性激活AP-1（activator protein 1）信号转导途径；并发现在压力条件下（即缺乏生长因子时），N蛋白可以诱导COS-1细胞凋亡和肌动蛋白重组。本文研究了体外转染N蛋白真核表达载体后细胞基因转录水平的变化。通过长寡核苷酸芯片和SAM统计学处理，得到了瞬时表达N蛋白的真核细胞转录谱。N蛋白对哺乳动物细胞转录的影响可能与SARS-CoV的致病机理相关。     

5-氮-2''-脱氧胞苷对人卵巢癌细胞SKOV3增殖凋亡及hMLH1和hMSH2表达的影响

目的 探讨5-氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'deoxycytidine,5-Aza-CdR)对人卵巢癌细胞系SKOV3增殖、凋亡及错配修复基因HMLH1和HMSH2表达的影响.方法 用0.5、5和50μmol/L特异性甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR处理SKOV3细胞3 d,继续常规培养7 d后,采用四唑盐(MTT)比色法检测生长活性,流式细胞术分析细胞的凋亡,半定量RT-PCR检测细胞HMLH1和HMSH2 mRNA的表达水平.结果 人卵巢癌细胞系SKOV3经0.5、5和50 μmol/L5-Aza-CdR处理后,均能明显抑制肿瘤细胞生长.各组细胞的凋亡率分别为10.59%±1.57%、17.52%±1.72%、34.10%±1.45%,显著高于对照组的5.35%±0.86%(P＜0.01);且凋亡率与5-Aza-CdR剂量成正相关(F=227.6,P＜0.01).在SKOV3中HMLH1和HMSH2呈弱表达,经5-Aza-CdR处理后mRNA表达量有不同程度的增加,且与药物存在剂量依赖性.结论 5-Aza-CdR可逆转卵巢癌细胞系中存在的HMLH1和HMSH2甲基化,DNA错配修复基因甲基化与卵巢癌的发生、发展有关.     

5-Aza-CdR抑制HepG2细胞DLK1基因表达及细胞生长

目的 探讨去甲基化药物5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对DLK1基因及肝癌细胞系HepG2增殖、侵袭的影响.方法 不同浓度的5-Aza-CdR及PBS作用HepG2细胞后,RT-PCR、Western blot检测DLK1基因及蛋白的表达水平;MTT、Transwell和流式细胞术检测HepG2细胞的生长、侵袭力及细胞周期的变化.结果 HepG2细胞经5-Aza-CdR处理后,DLK1 mRNA、蛋白表达量降低;MTT试验显示细胞生长速度依5-Aza-CdR浓度出现不同程度减慢;流式结果表明G1期细胞减少,S期细胞增加,出现S期阻滞;Transwell证实侵袭能力显著降低(P＜0.05).结论 去甲基化药物5-Aza-CdR能有效地抑制DLK1基因的表达,从而抑制肿瘤细胞HepG2生长、增殖、侵袭能力.     

沉默EMS1/cortactin基因对肝癌HepG2细胞迁移、侵袭和细胞周期的影响

目的研究原发性肝癌(HCC)Hep G2细胞中EMS1/cortactin的表达与定位,探讨其功能特性。方法 RTq PCR、免疫荧光法检测EMS1基因和cortactin(EMS1编码蛋白)表达,共聚焦显微镜观察cortactin定位,并以人正常肝细胞L02为对照。将靶向EMS1的质粒EMS1-shRNA转染Hep G2,并以CCK8法、流式细胞周期检测、划痕和Transwell小室实验检测细胞增殖、周期、迁移和侵袭能力。结果 Hep G2中EMS1 mRNA水平为LO2的10.5倍;cortactin在Hep G2中高表达,并聚集于细胞膜下皮质区,L02中cortactin弥散分布在胞质中。与未处理组相比,转染EMS1-shRNA组Hep G2中EMS1 mRNA水平下降68.00%,cortactin水平下降52.80%,细胞增殖能力下降9.50%,S期比例下降37.89%,迁移能力下降45.40%,侵袭能力下降64.91%(均P0.05)。结论 EMS1/cortactin主要与Hep G2细胞迁移和侵袭相关。     

Identification and purification of a novel fish allergen from largemouth bass (Micropterus salmoides)

The prevalence of fish allergies has become a serious health problem and has increased alarmingly over the past few years. To contain this problem, we would need to identify all commonly consumed fish allergens. To date, however, no report has identified largemouth bass allergens. This study attempted to identify and purify the major allergen implicated in the allergic response to largemouth bass (Micropterus salmoides), a freshwater fish widely consumed in China. Fifteen patients with a positive history of type I allergy to fish were recruited from skin-prick test and the allergy screen. Total protein extracts and purified allergenic protein from bass were tested for their immunoglobulin E–binding properties. Immunoblot assay resulted in strong reactivity with the 17-kDa protein in all patients. In summary, nucleoside diphosphate kinase B was identified as a novel fish allergen in largemouth bass. This finding is important for allergy diagnoses and the treatment of freshwater fish–allergic disorders.     

过表达Gnb2l1基因对体外节律基因mPer1表达的影响

目的:评价过表达Gnb2l1基因对节律基因mPer1表达的影响。方法:用PMA刺激NIH3T3细胞,使节律基因稳定表达后,用脂质体介导方法将质粒pcDNA3.1/Gnb2l1转染至NIH3T3细胞,并以空载体质粒pcDNA3.1/vector为对照。利用RT-PCR技术检测不同时间点Gnb2l1 mPer1在NIH3T3细胞中的表达水平,研究过表达Gnb2l1基因对mPer1基因表达的影响。结果:采用RT-PCR技术显示成功转染,实验组比对照组Gnb2l1表达量明显增高(p0.05)。并且发现实验组的mPer1表达量比对照组明显增高,但是经过余弦分析发现两组相比mPer1的表达周期无明显改变。结论:成功过表达Gnb2l1基因使节律基因mPer1表达量增加,中值增高(p=0.038)。     

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对HepG2细胞RUNX3基因表达及细胞增殖的影响

目的探讨人肝癌细胞系HepG2经5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2-’deoxycytid ine,5-Aza-CdR)处理后诱导高甲基化失活的RUNX3基因重新表达的可能性及对细胞生长的影响,寻找抗癌治疗的新靶点。方法RT-PCR检测抑癌基因RUNX3 mRNA的表达;MTT、集落形成实验观察细胞的生长活性;流式细胞术和透射电镜分析细胞周期及细胞凋亡的变化。结果肝癌细胞经不同浓度之5-Aza-CdR处理后,原无RUNX3 mRNA表达的细胞均检出基因重新表达,细胞生长速度出现不同程度减慢及细胞克隆形成率显著降低(P<0.01)。用药后肝癌细胞发生明显的S期阻滞,电镜显示肝癌细胞形态学改变。结论去甲基化制剂5-Aza-CdR能有效地激活肝癌细胞系HepG2因高甲基化所致RUNX3基因沉默的再转录,诱导该基因的表达,从而抑制肿瘤细胞生长。     

ADAR1通过RNA编辑上调ZNF655表达并促进人肝癌细胞系HepG2中HBV复制

目的探讨细胞中ADAR1对锌指蛋白ZNF655的作用及其对乙肝病毒(HBV)复制的影响。方法在人肝癌细胞系HepG2细胞中,利用桑格测序验证ZNF655 3'UTR存在ADAR1 RNA编辑位点;RT-qPCR检测ADAR1和ZNF655 mRNA的表达及HBV total RNA和HBV 3.5 kb RNA的表达;双荧光素酶报告基因检测荧光素酶的相对表达;Western blot检测ADAR1和ZNF655蛋白的表达;ELISA检测ZNF655对HBV标志物HBs Ag和HBe Ag的影响。结果 ZNF655基因3'UTR上chr7:99575277位点在DNA水平为纯合型,在RNA水平为杂合型;ZNF655基因3'UTR上chr7:99575277位点的编辑型G比正常型A的荧光素酶活性显著升高(P<0.001);在转录和翻译水平,ADAR1都显著增加了ZNF655的表达(P<0.001);ZNF655对HBV的表达起到促进的作用。结论 ADAR1通过编辑ZNF655的3'UTR上的chr7:99575277位点,使编辑位点A转换成G,上调了基因的表达,进而起到对HBV复制的促进作用。     

靶向泛素连接酶SIAH2的shRNA对人肝癌细胞株HepG2细胞周期和凋亡的影响

 目的：探讨shRNA介导的泛素连接酶SIAH2(seven in absentia homolog 2)基因表达抑制对人肝癌细胞株HepG2细胞周期和凋亡的影响。方法：用已构建的pGenesil-SIAH2重组质粒转染HepG2细胞,荧光显微镜下观察转染效率。采用RT-PCR和Western blotting 技术检测重组质粒对SIAH2 mRNA和蛋白表达的影响,MTS比色法测定重组质粒转染对细胞体外增殖能力的影响,流式细胞术检测重组质粒转染后细胞周期和凋亡的变化。结果：与对照组相比,pGenesil-SIAH2能显著抑制SIAH2 mRNA和蛋白的表达水平;pGenesil-SIAH2转染组细胞增殖速度明显减慢;pGenesil-SIAH2组细胞明显阻滞于G1期,细胞凋亡率明显升高。结论: pGenesil-SIAH2能有效抑制HepG2增殖,使细胞周期阻滞在G1期,并诱导其早期凋亡。上述研究为以SIAH2为靶点的肝癌基因治疗提供实验依据。     

Bif-1对前列腺癌LNCap细胞生物学行为的影响

目的研究Bif-1基因的过表达对前列腺癌细胞凋亡、增殖以及迁移过程的影响。方法构建Bif-1基因全克隆并转染LNCap细胞,上调细胞中Bif-1基因的表达水平,通过流式细胞术检测细胞转染前后的细胞凋亡情况;通过MTT法检测细胞的增殖能力变化;通过划痕试验检测细胞迁移能力的变化。结果转染Bif-1基因后,Real-time PCR检测发现LNCap细胞中Bif-1基因mRNA水平△△CT高于对照组10倍以上;Western blotting条带光密度值提高2倍以上。实验组细胞凋亡比例升高至31.90%,细胞增殖能力减弱。实验组和对照组中LNCap细胞划痕愈合速度基本相同,差异无统计意义（P〉0.05）。结论 Bif-1基因在LNCap细胞中的过表达促进了细胞凋亡,抑制细胞的增殖能力,而对前列腺癌细胞的迁移能力无显著影响。基因有可能作为一个潜在的前列腺癌治疗靶点。     

丙型肝炎病毒核心蛋白对HepG2细胞生长周期的影响

目的: 构建丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV-core-1b)真核重组质粒,获得稳定表达HCV-core-1b的HepG2细胞株,观察HCV-core-1b对HepG2细胞株生长周期及cyclin D1 和pRb/p130表达的影响,探讨丙型肝炎病毒慢性感染的可能机制。方法: 将HCV-core-1b亚克隆入pBabe-Flag-puro载体,获得重组质粒pBabe-Flag-HCV-core-1b;将重组质粒转染病毒包装细胞Pheonix 293T,筛选获得分泌HCV-core-1b的病毒包装细胞株。利用包装细胞产生的病毒上清感染靶细胞,筛选后获得稳定表达HCV-core-1b的HepG2细胞株,流式细胞仪检测靶细胞生长周期的变化,Western blotting检测cyclin D1 和pRb/p130蛋白的表达。结果: 基因测序确认HCV-core-1b亚型基因编码区完整无移位,与标签蛋白Flag形成融合蛋白。HepG2-HCV-core细胞株成功表达Flag-HCV-core-1b蛋白,并导致细胞cyclin D1 和 pRb/p130的水平下调,显著改变了HepG2细胞生长周期,使细胞阻滞在G₀/G₁期。结论: 成功构建了pBabe-Flag-HCV-core-1b真核表达质粒,获得稳定表达Flag-HCV-core-1b融合蛋白的HepG2细胞。由于HCV-core-1b蛋白的表达,下调了HepG2细胞 cyclin D1和pRb/p130的表达,显著抑制HepG2细胞生长周期。     

Cripto-1基因沉默对人肝癌MHCC-97H细胞侵袭、迁移能力的影响

 目的: 探讨Cripto-1蛋白在人肝癌组织和肝癌细胞系中的表达,研究沉默Cripto-1基因后对肝癌细胞MHCC-97H侵袭和迁移能力的影响及可能的机制。方法: 采用Western blot检测11对肝癌组织及相应的癌旁组织和不同肝癌细胞株中Cripto-1蛋白的表达;收集80例肝癌石蜡标本,免疫组织化学方法检测Cripto-1蛋白的表达情况;Cripto-1 siRNA转染肝癌细胞MHCC-97H细胞后,real-time PCR和Western blot分别检测转染效率;Transwell迁移和侵袭实验分别检测细胞的迁移和侵袭能力;Western blot分别检测基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白的表达。结果: Western blot检测结果显示肝癌组织中Cripto-1蛋白的表达明显高于对应的癌旁组织,Cripto-1蛋白在各肝癌细胞系中均有表达,且表达量高于对照细胞,其中高侵袭性肝癌细胞MHCC-97H表达量最高;免疫组织化学结果显示Cripto-1蛋白在88.7%的肝癌组织中表达;Cripto-1 siRNA转染MHCC-97H细胞后能显著降低Cripto-1 mRNA和蛋白的表达水平,并且能降低其侵袭和迁移能力;Western blot结果表明,Cripto-1基因沉默后能抑制MMP-2和MMP-9蛋白的表达。结论: Cripto-1在肝细胞癌中的高表达可能与肝癌的发生发展密切相关,下调Cripto-1的表达可以抑制肝癌细胞侵袭和迁移能力,其机制可能与下调MMP-2、MMP-9的表达有关。