细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31融合基因疫苗构建及鉴定

目的构建和鉴定细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95-EgA31融合基因疫苗。方法自行设计引物,从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后提取总RNA为模板,通过RT-PCR分别扩增Eg95和EgA31抗原编码基因,然后采用基因拼接法(gene SOEing)剪接Eg95和EgA31,得到Eg95-EgA31融合基因,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切,定向克隆到大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,构建重组质粒pGEX-Eg95-EgA31,抽提质粒进行双酶切鉴定,电穿孔法转化两歧双歧杆菌(Bifidobacteria bifidum,Bb),构建细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31融合基因疫苗,抽提质粒进行PCR扩增鉴定。结果RT-PCR扩增出约1 016bp的Eg95-EgA31融合基因;重组质粒用双酶切鉴定可切出预期大小片段,以具有氨苄青霉素抗性的rBb中抽提的质粒为模板进行PCR扩增可得到约1016bp的Eg95-EgA31融合基因片段。结论成功构建了细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31融合基因疫苗,为该疫苗的开发利用奠定了实验基础。     

细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗构建及鉴定

目的构建细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗并鉴定。方法从包囊中分离原头节,超声粉碎后抽提总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增Eg95编码基因并鉴定。将该基因片段定向克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pBCG中构建pBCG-Eg95重组质粒。用电穿孔法将重组质粒导入BCG菌构建rBCG-Eg95疫苗,用HgCl2筛选经PCR鉴定。结果经电泳及测序证实从原头节扩增出471bp Eg95蛋白编码基因。重组质粒pBCG-Eg95经酶切及PCR证实,并经PCR鉴定已成功转入BCG。结论成功构建细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗,为rBCG-Eg95疫苗进一步研究奠定基础。     

细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95质粒构建及鉴定

目的 构建并鉴定细粒棘球绦虫(Eg)转基因植物载体重组pBI-Eg95质粒.方法 从细粒棘球蚴包囊中分离原头节.经超声粉碎后抽提总RNA,反转录成eDNA,设计合成引物,以eDNA为模板.通过PCR从cDNA中扩增出目的 基因Eg95,经电泳及测序鉴定后,将该基因定向克隆到植物表达载体pBI121中构建pBI-Eg95重组质粒,电穿孔转化根癌农杆菌(At)LBA4404株;从转化的At阳性株中抽提质粒进行双酶切和以抽提的质粒为模板进行PCR鉴定.结果 RT-PCR扩增出1条约471 bp的特异性条带,DNA序列分析与GenBank知的序列同源性为100%.从转化的At中抽提的质粒,双酶切及PCR测定的结果与预期相符.结论 成功构建了细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95质粒,为进一步构建细粒棘球绦虫转基因植物疫苗奠定了基础.     

细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗的构建

目的 构建细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗(rsBCG-Eg95)。 方法 分别以卡介苗BCG基因组DNA和pGEX-4T-Eg95重组质粒为模板, PCR扩增获117 bp 的BCG抗原85B(BCG-Ag85B)信号肽序列和 471 bp 的Eg95基因序列。将这两个序列定向克隆至大肠埃希菌-BCG穿梭质粒pMV261, 经酶切、 PCR扩增及测序鉴定得到重组质粒pSMEg95。电穿孔法将重组质粒导入BCG菌构建rsBCG-Eg95疫苗, 卡那霉素抗性基因筛选并经PCR扩增鉴定。 结果质粒pSMEg95经双酶切、 PCR扩增及测序鉴定, 证实克隆基因Ag85B信号肽和Eg95基因序列正确插入载体pMV261, 并将此重组质粒导入BCG菌, 经PCR扩增鉴定证实细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗 (rsBCG-Eg95)构建成功。 结论 构建了含有BCG信号肽Ag85B和保护性抗原Eg95基因序列的细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗rsBCG-Eg95。     

细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95-EgA31质粒构建及鉴定

目的构建并鉴定细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95-EgA31质粒。方法从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后抽提总RNA为模板,采用RT-PCR方法分别扩增Eg95和EgA31编码基因,然后采用基因拼接法(gene SOEing)扩增Eg95-EgA31融合基因;将该融合基因定向克隆到植物表达载体pBI121中构建pBI-Eg95-EgA31重组质粒;电穿孔转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,At)LBA4404株,抽提质粒进行酶切及PCR鉴定。结果电泳及测序证实1 016bpEg95-EgA31融合基因克隆成功。经酶切及PCR证实重组质粒pBI-Eg95-EgA31成功转入根癌农杆菌。结论成功构建了细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95-EgA31质粒,为进一步构建细粒棘球绦虫转基因植物疫苗奠定了基础。     

铜绿假单胞菌重组Bb-OprF疫苗构建及鉴定

目的构建和鉴定铜绿假单胞菌重组双歧杆菌(rBb) OprF疫苗。方法以铜绿假单胞菌PAOl标准株提取总RNA为模板,自行设计引物,RT PCR扩增获得OprF抗原编码基因,经酶切、连接定向克隆入大肠埃希菌 双歧杆菌穿梭表达载体pGEX 1λT,构建重组质粒pGEX OprF。转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,抽提质粒行酶切电泳和测序验证后,电穿孔转化到Bb中,构建铜绿假单胞菌rBb OprF疫苗,抽提质粒进行PCR扩增鉴定。结果RT PCR扩增出1 016bp的OprF编码基因;重组质粒经双酶切鉴定,切出4 947bp的载体片段和10 16bp的目的基因片段;以rBb抽提质粒为模板进行PCR扩增可得到1 016bp的oprF基因片段。结论成功构建了铜绿假单胞菌rBb OprF疫苗,为该疫苗的进一步研究奠定基础。     

细粒棘球绦虫Eg95重组非分泌型和分泌型分枝杆菌疫苗的构建

目的分别构建细粒棘球绦虫Eg95重组非分泌型和分泌型卡介苗及耻垢分枝杆菌疫苗。方法分别以卡介苗(BCG)基因组DNA和PGEX-4T-Eg95为模板,PCR扩增获120bp的BCG抗原85B信号肽序列和423bp的Eg95基因序列。先将Eg95基因序列定向克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒pMV261,构建非分泌型重组质粒pMEg95。再将BCG-Ag85B信号肽序列定向克隆至pMEg95,构建分泌型重组质粒pSMEg95。电穿孔法将两型重组质粒分别导入BCG菌及耻垢分枝杆菌。结果双酶切、PCR扩增及测序鉴定证实,克隆基因Eg95序列和Ag85B信号肽序列正确插入载体PMV261,细粒棘球绦虫Eg95重组非分泌型和分泌型分枝杆菌疫苗构建成功。结论构建了含有Eg95基因序列和BCG-Ag85B信号肽序列的细粒棘球绦虫Eg95重组非分泌型和分泌型分枝杆菌疫苗。     

粪肠球菌介导的细粒棘球绦虫重组Efs-Eg95-EgA31疫苗的构建、鉴定及表达北大核心CSCD

目的构建粪肠球菌(Efs)为载体的细粒棘球绦虫重组Efs-Eg95-EgA31疫苗,并研究其表达效率。方法采用电穿孔技术将重组质粒pGEX-Eg95-EgA31转化粪肠球菌ATCC47077株,构建rEfs-Eg95-EgA31疫苗,抽提质粒进行PCR扩增鉴定;经IPTG诱导后进行10%SDS-PAGE和Western blot等分析和鉴定表达产物。结果以从rEfs抽提的质粒为模板进行PCR可扩增出约1016 bp的Eg95-EgA31融合基因片段,SDS-PAGE显示表达产物为62.5 ku的重组蛋白,表达蛋白约占菌体总蛋白的11%;Western blot表明重组蛋白能被细粒棘球蚴感染的鼠血清识别。结论成功构建了细粒棘球绦虫rEfs-Eg95-EgA31疫苗,表达的融合蛋白具有特异的抗原性。     

日本血吸虫重组两歧双歧杆菌(pGEX-Sj32)疫苗构建及鉴定

目的 构建和鉴定日本血吸虫重组两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum,Bb)pGEX-Sj32疫苗.方法 从重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所构建的重组大肠埃希菌BL21 (pET28α-Sj32)中抽提质粒pET28α-Sj32,通过PCR扩增Sj32抗原编码基因;将Sj32基因定向克隆至大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-Sj32,将该重组质粒转化至大肠埃希菌BL21感受态细胞(DE3),抽提质粒后进行双酶切鉴定;采用电穿孔法,将重组质粒pGEX-Sj32转化至Bb,构建Bb(pGEX-Sj32)疫苗,再从该疫苗中抽提重组质粒pGEX-Sj32,以其为模板进行PCR鉴定.结果 从抽提质粒pET28α-Sj32中PCR扩增出长度约为1 270 bp的Sj32基因片段;重组质粒pGEX-Sj32经双酶切鉴定,获得长度为4 947 bp的载体片段和长度为1 270 bp的Sj32基因片段;以抽提的疫苗质粒pGEX-Sj32为模板进行PCR扩增,得到了长度约为1 270 bp的Sj32基因片段,与预期结果相符.结论 成功构建了日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗.     

猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗的构建及鉴定

目的构建和鉴定猪带绦虫重组双歧杆菌(Bb)(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗。方法用疏水甘氨酸接头连接TSO45W-4B和TSOL18编码基因,通过全基因合成方法合成猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因。将该融合基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18。电穿孔法将该质粒导入Bb,构建猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗,从具有氨苄青霉素抗性的rBb中抽提质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。结果全基因合成789bp的TSO45W-4B-TSOL18融合基因片段。从具有氨苄青霉素抗性的rBb中抽提质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切得到4 944bp的pGEX-1λT载体片段和789bp的TSO45W-4B-TSOL18融合基因片段,与预期结果相符;以该重组质粒为模板进行PCR扩增得到789bp的TSO45W-4B-TSOL18融合基因片段,经测序基因片段为789bp,与预期大小相符。结论成功构建了猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗,为该疫苗的表达及免疫原性研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌重组Bb-hpaA-vacA疫苗的构建

目的 构建幽门螺杆菌( Hp) 重组双歧杆菌( Bb) Bb-hpaA-vacA疫苗。方法 通过 PCR 分别扩增hpaA和vacA抗原编码基因, 然后采用gene SOEing 剪接hpaA和vacA, 得到hpaA-vacA融合基因;将该融合基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT, 构建重组质粒 pGEX-hpaA-vacA,电穿孔法将该质粒导入Bb, 构建幽门螺杆菌重组hpaA-vacA 疫苗。结果 PCR成功扩增出分子量约为1500 bp的 hpaA-vacA融合基因,双酶切证实hpaA-vacA融合基因成功插入pGEX-1λT中,并成功转化入双歧杆菌,构建rBb-hpaA-vacA疫苗。结论 成功构建螺杆菌rBb-hpaA-vacA疫苗,为该疫苗的进一步研究奠定了基础。     

细粒棘球蚴95(Eg95)抗原基因的克隆及真核表达质粒的构建

目的　克隆Eg95抗原基因 ,构建携带目的基因的真核表达载体 ,为细粒棘球蚴DNA疫苗的研究提供材料。方法　应用PCR方法从细粒棘球蚴cDNA文库中克隆获得Eg95抗原基因 ,将其克隆至 pUCm -T载体 ,测序确定其正确性。利用定向克隆技术将Eg95抗原基因片段克隆至真核表达质粒pcDNA3上 ,根据选择标记的氨苄抗性基因筛选到阳性克隆 ,通过酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆 ,测序确定序列。结果　测序表明所选 pcDNA3-Eg95阳性克隆均为正确连接Eg95抗原基因的重组质粒 ,可以作为DNA疫苗作进一步的研究。结论　成功构建真核细胞表达载体 pcDNA3-Eg95。