肠出血性大肠杆菌O157：H7 TccP基因克隆、表达及其抗原性鉴定

目的克隆表达肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157：H7Tir细胞骨架偶联蛋白（TeeP）基因，并研究其抗原性。方法采用PCR法自EHEC0157：H7Sakai菌株基因组扩增TeeP基因，构建TeeP原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达。表达产物经初步纯化后，免疫新西兰白兔，制备兔抗TeeP多克隆抗体。抗体效价及特异性用ELISA法和Westernblotting法进行测定和分析。结果从EHECO157：H7Sakai菌株中克隆出了1014bp的TeeP基因。构建的重组质粒pET28a-TccP在大肠杆菌中获得了高效表达；以TeeP免疫家兔获得了高效价多克隆抗体，Westernblotting分析此抗体能与TeeP发生特异性抗原抗体反应。结论在大肠杆菌中成功克隆表达了TeeP基因，所获TeeP具有良好的抗原性，为进一步研究TeeP在EHECO157：H7致病机制中的作用奠定基础。     

大肠杆菌O157:H7 菌毛hcpA基因产物的小鼠免疫保护试验

大肠杆菌O157:H7的Ⅳ型菌毛与其粘附、定植和致病可能有着密切的关系,但相关报道鲜见。本文选用pET32载体,体外构建hcpA重组菌,在大肠杆菌中进行表达。家兔制备高滴度多克隆抗体,Western blot分析其免疫原性。Balb/c小鼠进行免疫试验,并对临床分离多株EHEC O157:H7进行hcpA基因检测和电镜观察菌毛的表达。成功获得高效表达重组HcpA蛋白,并制备了兔源HcpA多克隆抗体,Western blot分析此抗体能与提取的HCP发生特异性抗原抗体反应。重组HcpA经二免后,Balb/c小鼠较对照小鼠排菌量降低,而且排菌时间缩短。在大肠杆菌中成功克隆表达了hcpA基因,所获重组HcpA蛋白具有良好的免疫原性,可作为研制肠出血性大肠杆菌O157:H7基因工程疫苗或者检测试剂的候选抗原。     

结核分枝杆菌14000抗原基因的克隆、表达纯化及抗原性分析

目的对结核分枝杆菌14 000抗原基因进行克隆表达及纯化,并评价其抗原性。方法以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,用PCR方法获得目的基因构建大肠杆菌高效表达株;亲和层析柱纯化重组蛋白;进SDS-PAGE电泳鉴定;通用ELISA法进行重组蛋白的抗原性检测分析。结果获得了结核分枝杆菌抗原14 kD基因,在大肠杆菌BL21中高效表达,Western印迹结果证实该重组蛋白能与抗结核分枝杆菌多克隆抗体发生特异免疫结合反应。ELISA分析中,该纯化的重组抗原敏感性、特异性和准确性分别为:52.5%、96.7%和67.2%,具有良好的抗原性和较高的特异性。结论14 kD重组蛋白抗原具备良好的抗原性与特异性,为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及抗原、抗体的大规模制备打下基础。     

肠出血性大肠埃希菌O157∶H7外膜蛋白A的表达、鉴定和纯化

目的 构建肠出血性大肠埃希菌O157∶H7外膜蛋白A基因重组质粒,研究其在大肠埃希菌中的表达情况. 方法 用RT-PCR法从肠出血性大肠埃希菌O157∶H7菌株克隆OmpA基因,构建重组质粒pET-30a (+)-OmpA,经双酶切及基因测序鉴定后在E.coli BL21(DE3)原核表达系统中诱导OmpA的表达,通过蛋白质电泳技术检测蛋白的表达,用Western blot法测定和分析免疫反应性. 结果 获得的目的 基因为1 041 bp,与预期值相符,测序结果与GenBank公布序列的同源性达100%,重组质粒pET-30a (+)-OmpA在原核系统下可表达OmpA, Western blot分析His-Tag单抗能与OmpA(His-Tag)发生免疫反应. 结论 OmpA重组质粒构建成功,表达产物具有抗原性.     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 EspA与IntiminC300融合蛋白的构建表达

目的构建表达肠血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7Ⅲ型分泌蛋白EspA与紧密粘附素C-端免疫保护性片断(IntiminC300)的融合蛋白(EspA-IntiminC300)。方法采用PCR技术从EHEC O157∶H7基因组中扩增EspA的编码基因espA及IntiminC300的编码基因eaeC300,T-A克隆后依次构建至表达载体pET-28a(+),转化宿主细胞E.coliBL21(DE3),测序鉴定,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测其表达量及表达形式,亲和层析法纯化目的蛋白,免疫印迹分析免疫反应性。结果PCR法自EHEC O157∶H7基因组中分别扩增出了约580bp(espA)和900bp(eaeC300)的目的片段,将二者融合构建了重组质粒pET-28a(+)-espA-eaeC300,测序结果与理论预测值一致性为99.9%(1501/1502)。融合蛋白在工程菌中表达量约40%,PAGE初步测定目的蛋白的相对分子量(Mr)约54×103Da,破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式表达,包涵体洗涤后纯化,获得目的蛋白纯度约90%。免疫印迹显示融合蛋白能分别与兔抗EspA和IntiminC300血清发生免疫反应。结论高效表达了融合蛋白(EspA-IntiminC300),此融合蛋白具有良好的免疫反应性和免疫原性,为研制EHECO157∶H7多亚单疫苗奠定了基础。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7脂多糖抗原的制备及鉴定

目的提取纯化肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7脂多糖(LPS)抗原并对其鉴定,以探讨其应用于检测抗O157抗体的价值.方法应用热酚水法提取EHEC O157∶H7 S型933株LPS抗原,并经超速离心纯化.提取物以蒽酮硫酸法、紫外光谱吸收法、考马斯亮蓝染色法及鲎试剂分别测定多糖、核酸、蛋白含量和鲎试剂凝集活性.LPS抗原致敏醛化鸡血球,IHA法检测EHEC O157∶H7及其它肠道病原菌的抗血清.对凝集阳性的抗血清,经菌体抗原吸收、O157 LPS抑制及去脂质多糖抗原抑制试验,确定抗血清与LPS的反应位置.结果纯化后的O157 LPS抗原含多糖,具鲎试剂凝集活性,未检出核酸,蛋白含量＜0.5%.O157 LPS IHA检测O157多克隆和单克隆抗体均呈高效价凝集阳性反应,而大部分其它肠道病原菌抗血清均呈阴性反应,交叉反应仅见于沙门氏菌O30、EIEC O144∶K?及ESIECⅣ抗血清.EHEC O157和沙门氏菌O30抗血清与O157 LPS反应位置为多糖部分,而EIEC O144∶K?及ESIECⅣ抗血清的反应位置为脂质A部分.结论热酚水法提取的EHEC O157 LPS抗原纯度高、特异性强,可望应用于抗O157抗体的检测.O157 LPS抗原的去脂质可进一步提高反应的特异性.     

肠出血性大肠杆菌O157胶体金免疫层析试纸条的研制

目的建立一种简便实用的胶体金免疫层析检测方法用于食品样品中肠出血性大肠杆菌O157的快速筛查。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,以抗EHEC O157 LPS单克隆抗体标记,以兔抗O157多克隆抗体固定于硝酸纤维素膜作为捕获抗体,利用双抗夹心法,制成O157胶体金免疫层析检测试纸条,并进行了特异性和敏感性试验。结果该试纸条仅与O157反应,与其他受试菌株均不反应。检测敏感性为106CFU/mL,对人工污染EHEC O157模拟牛肉样品增菌后检测,敏感性为56 CFU/g。结论成功研制出EHEC O157胶体金免疫层析试纸条,敏感性高,特异性强,检测速度快,10min可出结果,操作简便,可用于现场大量样品的检测。     

出血性大肠杆菌O157菌壳的制备研究

目的利用温度控制噬菌体PhiX174裂解基因E的表达,制备出血性大肠杆菌O157∶H7菌壳,鉴定其裂解效率并观察其形态。方法利用PCR技术扩增得到噬菌体PhiX174裂解基因E并克隆到质粒pBV220中,将重组质粒导入出血性大肠杆菌O157∶H7。重组菌株O157∶H7(pBV220::E)培养温度从28℃突升至42℃,每20min检测菌液OD600值,绘制重组菌株生长曲线。体外菌落计数计算裂解效率,并通过电镜观察菌壳结构。结果获得了PhiX174裂解基因E全长基因及重组质粒,构建了大肠杆菌的重组菌株。重组菌菌液OD600值在温度突升至42℃后40min后开始显著下降,80min后OD600值趋于平稳。细菌的裂解效率为98.4%。电子显微镜观察显示,经诱导后,O157∶H7细菌内容物可以通过细菌表面的孔道流出,从而形成菌壳。结论本研究成功制备了大肠杆菌O157∶H7菌壳,为将来进一步研究O157菌壳的特性奠定了基础。     

浙江省O157大肠杆菌监测及其分子生物学特性

目的了解肠出血性大肠杆菌O157∶H7和其他O157大肠杆菌在浙江省动物、人群中的分布、流行以及PFGE分型、毒力基因携带状况。方法按全国O157∶H7监测方案在5-10月份肠道传染病高发季节,采集全省各地(市)肠道门诊腹泻病人粪便,进行O157大肠杆菌分离培养,并用免疫磁珠分离法对浙江省5个监测点的宿主动物进行O157∶H7分离培养、鉴定,可疑菌株以PCR法检测O157∶H7抗原、志贺样毒素(stx1和stx2)、粘附抹平因子(eaeA)及溶血素(hly)4种毒力基因。用脉冲场凝胶电泳(pulse field gel electrophoresis,PFGE)方法进行同源性分析,同时选择14种抗生素进行药敏试验,并将分析结果与本省首株患者粪便中分离的产志贺样毒素的O157∶H7菌株进行比较。结果全省5个监测点2006年共监测动物粪便标本2377份,分离到4株O157∶H7菌株,阳性率为0.17%;同时在绍兴、舟山肠道门诊腹泻病人粪便中分离到2株O157:H?菌株。4株O157∶H7菌株,stx2、Hly、eaeA均阳性,stx1均阴性;2株O157∶H?菌株仅1株携带eaeA毒力基因。脉冲场凝胶电泳分型显示,4株O157∶H7菌株分3个型,除金华地区2006年分离所得2株完全相似外,其它相同地区不同年代分离的O157∶H7菌株及相同年代不同地区分离的O157∶H7菌株则完全不相似。2株O157∶H?菌株1株PF-GE电泳条带降解,另1株与其它O157∶H7菌株电泳条带差异明显。结论浙江省大肠杆菌0157菌株在动物中以携带stx2毒力基因的O157∶H7菌株为主,但在腹泻患者中则以不带志贺样毒素的O157∶H?菌株为主。不同地区分离的O157∶H7菌株PFGE分型差异明显。羊、奶牛是携带stx2毒力基因的O157∶H7大肠杆菌的主要宿主。各级疾控应加强对宿主动物和腹泻病人大肠杆菌O157的分离监测和流行病学调查。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的　在大肠杆菌中表达恶性疟原虫乳酸脱氢酶 (LDHp)与谷胱甘肽S 转移酶 (GST)融合蛋白 ,测定重组蛋白的免疫活性。方法　采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫 (海南株 )乳酸脱氢酶基因 ,经双酶切后克隆入 pGEX 4T 1表达载体中 ,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清 ,并用琼脂双向扩散法检测效价 ,ELISA、Western bloting检测重组抗原的免疫活性。结果　得到了重组表达的蛋白抗原 ,表达产物能与兔抗恶性疟原虫血清发生反应 ,并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答 ,免疫琼脂扩散法抗体滴度为 1∶16。结论　LDHp在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

肠出血性大肠埃希菌O157：H7外膜蛋白A的表达、鉴定和纯化

目的构建肠出血性大肠埃希菌O157：H7外膜蛋白A基因重组质粒，研究其在大肠埃希菌中的表达情况。方法用RT-PCR法从肠出血性大肠埃希菌O157：H7菌株克隆OmpA基因，构建重组质粒pET-30a（＋）-OmpA，经双酶切及基因测序鉴定后在E．coliBL21（DE3）原核表达系统中诱导OmpA的表达，通过蛋白质电泳技术检测蛋白的表达，用Western blot法测定和分析免疫反应性。结果获得的目的基因为1041bp，与预期值相符，测序结果与GenBank公布序列的同源性达100％，重组质粒pET-30a（＋）-OmpA在原核系统下可表达OmpA，Westernblot分析His-Tag单抗能与OmpA（His-Tag）发生免疫反应。结论OmpA重组质粒构建成功，表达产物具有抗原性。     

贵州省首次从腹泻病例中检出肠出血性大肠杆菌O157∶H7

目的 从贵州省1例腹泻病例的粪便标本中分离鉴定O157肠出血性大肠杆菌并对其进行毒力基因检测。方法 收集腹泻病例的粪便标本,mEC肉汤增菌后,采用O157胶体金进行初筛,阳性者增菌液经免疫磁珠富集后进行肠出血性大肠杆菌的分离,对分离株进行系统生化鉴定,O157、H7诊断血清凝集,应用特异性PCR进行rfbE和fliC基因鉴定,以及stx1、stx2、eaeA和hlyA 4种毒力基因检测。结果 腹泻病例粪便标本经mEC肉汤增菌后,检测O157胶体金阳性;增菌液经免疫磁珠富集后培养出可疑菌落,经系统生化鉴定为大肠杆菌,血清型为O157∶H7;PCR检测O抗原特异性rfbE基因和H7特异性fliC基因均阳性;毒力基因eaeA、stx2和hly均阳性,stx1阴性。结论 分离株确诊为肠出血性大肠杆菌O157∶H7,为贵州省腹泻病例中首株该病原体。     

肠出血性大肠杆菌O157：H7脂多糖抗原的制备及鉴定

目的提取纯化肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157：H7脂多糖（LPS）抗原并对其鉴定,以探讨其应用于检测抗O157抗体的价值。方法应用热酚水法提取EHECO157：H7S型933株LPS抗原,并经超速离心纯化。提取物以蒽酮硫酸法、紫外光谱吸收法、考马斯亮蓝染色法及鲎试剂分别测定多糖、核酸、蛋白含量和尝试剂凝集活性。LPS抗原致敏醛化鸡血球,IHA法检测EHEC157：H7及其它肠道病原菌的抗血清。对凝集阳性的抗血清,经菌体抗原吸收、O157LPS抑制及去脂质多糖抗原抑制试验,确定抗血清与LPS的反应位置。结果纯化后的O157LPS抗原告多精,具鲎试剂凝集活性,未检出核酸,蛋白含量＜0．5％。O157LPSIHA检测O157多克隆和单克隆抗体均呈高效价凝集阳性反应,而大部分其它肠道病原菌抗血清均呈阴性反应,交叉反应仅见于沙门氏菌O30、EIECO144：K？及ESIECⅣ抗血清。EHEC157和沙门氏菌O30抗血清与O157LPS反应位置为多糖部分,而EIECO144：K？及ESIECⅣ抗血清的反应位置为脂质A部分。结论热酚水法提取的EHECO157LPS抗原纯度高、特异性强,可望应用于抗O157抗体的检测。O157LPS抗原的去脂质可进一步提高反应的特异性。     

霍乱弧菌和大肠杆菌O157∶H7检测芯片的制备

目的设计和制备快速检测霍乱弧菌和大肠杆菌O157∶H7基因芯片。方法选择霍乱弧菌特异的编码外膜蛋白的ompW基因和毒素ctxA基因以及大肠杆菌O157∶H7特异的编码菌体抗原rfbE、鞭毛抗原fliC和毒素SLT1、SLT2基因,设计引物和探针,并制备检测芯片,通过两次PCR扩增,制备荧光标记的靶序列,并与芯片进行杂交,检测霍乱弧菌和大肠杆菌O157∶H7。结果所有霍乱弧菌和大肠杆菌O157:H7菌株在采用单一和多重PCR两种方法制备的荧光标记靶序列与芯片杂交,均在芯片相应探针处出现阳性信号,非霍乱弧菌和非O157:H7菌株杂交结果均为阴性。结论基因芯片可以快速检测霍乱弧菌的O157∶H7。     

免疫捕获PCR法快速检测大肠埃希氏O157∶H7的研究

目的建立两种免疫捕获PCR法快速检测E.coliO157∶H7,并探讨其灵敏度和特异性。方法运用免疫磁珠集菌(IMS)和抗体包被扩增管(mACT)两种方法富集待测样品中E.coliO157∶H7,再应用巢式PCR法检测编码E.coliO157∶H7O抗原的rfbE基因,对13株E.coliO157菌和10株非E.coliO157菌进行检测。结果应用两种icPCR检测,所有E.coliO157∶H7和E.coliO157NM菌株均为阳性结果,而其它包括与O157抗血清能交叉凝集的菌株检测结果均为阴性;对于含有48×102cfu/ml以上浓度的E.coliO157∶H7菌悬液,两种方法,所有试验管都能检测到特异性扩增;并证实了这两种方法可用于检测鲜牛奶中E.coliO157∶H7,样品中E.coliO157∶H7的含量只要不少于101cfu/ml,经过6小时增菌均能检测出来。结论IMS-icPCR和mACT-icPCR用于检测E.coliO157∶H7,是快速、灵敏且高特异的方法。     

牛源大肠杆菌O157∶H7的分离鉴定及其生物学特性研究

目的 为了解郑州地区牛携带大肠杆菌O157∶H7的情况。方法 应用本实验室已建立的大肠杆菌 O157∶H7多重PCR方法对其进行了检测,并对临床分离的动物源大肠杆菌O157∶H7的生物学特性及携带的毒力基因情况进行了分析。结果 所采集的样品中共分离鉴定出2株大肠杆菌 O157∶H7,分别命名为L1和L2,其检出率为1.4%;临床分离菌株的生化试验结果均符合大肠杆菌的常规生化特性;L1和L2菌株的生长曲线一致,均比标准株的迟缓期短,较早进入对数生长期;L1菌株在48 h可形成成熟完整的生物被膜,L2菌株在36 h形成成熟完整的生物被膜;L1和L2菌株均携带有hlyA和eaeA毒力基因,同时L1还携带Stx2毒力基因。结论 该结果为大肠杆菌O157∶H7流行病学调查提供了相关数据,对郑州地区大肠杆菌O157∶H7有效的监测奠定了基础。     

实时PCR在大肠杆菌O157∶H7快速检测中的应用

目的建立一种快速、敏感、特异的大肠杆菌O157∶H7的定量检测方法。方法根据GenBank公布的O157∶H7大肠杆菌rfbE基因序列,应用分子生物学软件进行序列比对,在该基因的保守区设计引物和TaqMan探针,对荧光定量PCR反应条件进行优化,建立实时荧光定量PCR检测大肠杆菌O157∶H7的反应体系,并对该法的特异性、敏感性和重复性进行了评价。结果所有大肠杆菌O157∶H7菌株的检测结果均为阳性,而所有其它菌株检测结果均为阴性;该方法检测的灵敏度可达1cfu/μL,重复性检测的变异系数均小于5%。在模拟污染牛奶中,可检出1×102cfu/μL的细菌。从细菌核酸提取至完成检测约需3h。结论本研究建立的基于Taqman探针技术的实时PCR检测体系具有快速、灵敏度高、特异性强等优点,可用于大肠杆菌O157∶H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

肠出血性大肠埃希菌O157∶H7环介导恒温扩增快速检测方法的建立与应用

目的肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7是一种重要的人畜共患病致病菌,主要通过被污染的食物传播,引起出血性结肠炎,建立其快速检测方法具有重要意义。方法基于EHEC O157∶H7保守的rfbE基因序列,设计4条引物,利用环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP),成功建立了EHEC O157∶H7LAMP快速检测方法 ,60min内即可完成致病菌检测。结果利用该LAMP方法对30种共38株细菌进行检测,所试EHEC O157∶H7均为阳性结果 ,说明该方法具有高度特异性。本方法对纯培养的EHEC O157∶H7检测限为12CFU/mL,污染食品中EHEC O157∶H7的检测限为18CFU/g。实践应用表明,对1121份进出口肉类、奶类制品及人工污染样品等进行检测,检出57份LAMP阳性,与采用AOAC标准检测结果的符合率为100%。结论该LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性。     

鹦鹉热衣原体HSP60基因克隆及其表达产物抗原性的实验研究

目的验证新获得的鹦鹉热衣原体HSP60基因在E.coli中高效表达的产物是否具有足够的抗原活性,为进一步研究其在鹦鹉热衣原体感染检测上的应用奠定基础。方法根据GenBank鹦鹉热衣原体Hsp60基因序列X51404,设计一对特异性引物,扩增了鹦鹉热衣原体HSP60全长基因,克隆入pET32a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,利用IPTG诱导获得高效表达。结果扩增了鹦鹉热衣原体HSP60全长基因,表达产物分子量约为68kD,经Western blotting和胶体金免疫层析技术检测,表明表达产物具有较好的抗原性。结论扩增了鹦鹉热衣原体HSP60全长基因,并对其表达产物的抗原性进行免疫印记分析和免疫层析初步检测,表明具有较好的抗原性,为进一步研究其在鹦鹉热衣原体感染检测上的意义打下了基础。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7脂多糖抗原的提取鉴定及间接ELISA法的建立

目的提取并纯化具有强免疫反应性和高特异性的肠出血性大肠杆菌O157∶H7（E.coliO157∶H7）脂多糖（LPS）抗原,并研究其在E.coliO157∶H7 LPS抗体检测中的应用。方法应用热酚水法提取E.coliO157∶H7 LPS抗原,同时收集水相和酚相LPS,并对其产率、纯度及免疫反应性进行分析比较,用酸解法制备O-特异性多糖（O-SP）,并以不同的LPS为包被抗原,建立间接ELISA法检测E.coliO157∶H7 LPS抗体。结果大分子量的E.coliO157∶H7 LPS优先溶于酚相,而水相中含有更多的小分子量LPS,与水相LPS相比酚相LPS具有更高的免疫反应性和纯度,酚相LPS经酸解去脂得到的O-SP具有更高的反应特异性。结论酚相LPS和O-SP都可用于E.coliO157∶H7 LPS抗体的ELISA检测,O-SP具有更高的特异性,是检测E.coliO157∶H7 LPS特异性抗体的理想材料。