pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP真核表达质粒构建

目的:构建pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP、pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-GFP、pcDNA3.1(+)-CYP19R264C-GFP与pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-R264C-GFP真核表达质粒,并观察pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP质粒在MCF-7和Bcap-37细胞中的表达。方法:①采用RT-PCR技术扩增CYP19 cDNA,插入pcDNA3.1(+)载体中,构建pcDNA3.1(+)-CYP19表达质粒;酶切pcDNA3.1(+)-CYP19(304bp BamHⅠ)-GFP和pcDNA3.1(+)-CYP19质粒,构建pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP表达质粒;②以pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP质粒为模板,采用定点突变技术,构建pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-GFP和pcDNA3.1(+)-CYP19R264C-GFP及pcDNA3.1(+)-CYP19W39R-R264C-GFP表达质粒;③pcDNA3.1(+)-CYP19-GFP质粒通过脂质体介导转染MCF-7和Bcap-37细胞,荧光显微镜观察其在细胞中的表达。...     

t-PA基因克隆及pcDNA3.1t-PA真核表达质粒的构建

目的利用基因工程技术克隆组织纤溶酶原激活物(t-PA)基因并构建一种无细胞毒性、不激活原癌基因的真核表达的pcDNA3.1t-PA质粒载体.方法采用高效Trizol试剂快速从人肺组织中提取RNA,RT-PCR获得t-PA cDNA,扩增、纯化、回收t-PA基因片段并将质粒pcDNA3.1和t-PA基因片段分别双酶切,前者纯化回收大片段,后者纯化回收1.9kb片段,再将回收的pcDNA3.1大片段与t-PA基因片段(1.9kb)重组.对重组pcDNA3.1t-PA质粒进行单酶切和双酶切鉴定,并测序.结果成功地从胎儿肺组织中克隆了t-PA基因,并构建了以pcDNA3.1为载体的真核表达质粒载体.结论含t-PA基因新型表达质粒构建的成功将为基因防治血管重建术中局部血栓形成奠定基础.     

真核表达质粒pcDNA3.1(+)-rmCGβ的构建和鉴定

目的 构建恒河猴绒毛膜促性腺激素β亚基(macaca mulatta chorionic gonadotrophin β subunit,rmCGβ)基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-rmCGβ,并了解该质粒能否在真核细胞中表达.方法 通过PCR扩增rmCGβ的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的cDNA克隆至PGM-Teasy,测序后插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-rmCGβ,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染B16细胞,通过RT-PCR扩增出B16/pcDNA3.1(+)-rmCGβ细胞株中rmCGβ全段基因cDNA.结果 经4轮PCR,成功扩增出rmCGβ的cDNA全长基因,酶切和测序证明正确构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-rmCGβ,通过RT-PCR方法 证实该质粒能在B16真核细胞中正确表达.建立了稳定的细胞株B16/pcDNA3.1(+)-rmCGβ.结论 成功克隆和构建了rmCGβ的真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)-rmCGβ,为进一步研究rmCGβ的新功能和免疫治疗奠定了基础.     

pcDNA3.1(+)-NRP1真核表达载体的构建与鉴定

[目的]从人角质形成细胞系HaCaT中克隆NRP1(Neuropilin-1)基因全长cDNA,构建含NRP1基因的重组真核表达载体,为下一步的NRP1基因功能研究奠定基础。[方法]采用RT-PCR法从人角质形成细胞系HaCaT中扩增NRP1基因全长cDNA,扩增产物通过TA克隆连接到pMD18-T载体进行测序鉴定,然后通过双酶切将全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),最后得到pcDNA3.1(+)-NRP1重组质粒。[结果]成功克隆NRP1基因全长cDNA,并成功构建了pcDNA3.1(+)-NRP1真核表达载体。[结论]pcDNA3.1(+)-NRP1真核表达载体的成功构建可以为NRP1基因功能的进一步研究及其临床基因治疗奠定实验基础。     

pEYFP-hApelin-R重组真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建与增强型黄色荧光蛋白（EYFP）融合的人Apelin-R（Human Apelin receptor,hApelin-R）真核表达载体,用于Apelin-R介导的细胞内信号转导机制研究。方法以质粒pcDNA3.1-hApelin-R为模板,PCR方法扩增人Apelin-R。扩增的Apelin-R产物与质粒pEYFP-C1按常规方法酶切、连接、转化,并经酶切和测序进行鉴定。将重组质粒用脂质体法转染HEK293细胞,Western blot鉴定人Apelin-R的表达。用Apelin-13诱导后,共聚焦显微镜观察受体在细胞内的位移。结果扩增出了一条1143 bp的基因片段,序列与GenBank（NM_005161）相同。在69 kDa处有一蛋白条带,与预期大小相同。人Apelin-R表达在细胞膜上。诱导30 min后,发生受体向胞浆的位移。结论成功构建了pEYFP-hApelin-R重组表达载体,建立了该质粒转染HEK293的细胞模型。可用于Apelin-R介导的细胞内信号转导机制研究,其结果有助于寻找其作为药物的靶点。     

小鼠真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1的构建及表达

目的:通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1,并检测其在CHO细胞中的表达。方法:通过PCR扩增FGFR1的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体包裹转染CHO细胞,Western blot检测FGFR1目的蛋白的表达。结果:经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染CHO细胞后可表达FGFR1目的蛋白。结论:成功构建的pcDNA3.1(+)-FGFR1重组质粒能在体外表达FGFR1目的蛋白。     

pRluc-hNeurotensin1-R重组真核表达载体的构建及在离体细胞中的表达

目的 构建与海肾荧光素酶(Rluc)融合的人Neurotensin-R1(Human Neurotensin receptor1,NTS1 or NTSR1)真核表达载体,用于生物发光共振能量转移法检测人NTS与其它受体间的相互作用以及研究Neurotensin-R介导的细胞内信号转导机制.方法 以质粒pcDNA3.1-hNTS1为模板,PCR方法扩增人NTS.扩增的人NTS以及质粒pRluc-pcDNA3.1用Not Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切,然后将这2种酶切产物按常规方法连接、转化至大肠杆菌Top10中,该菌在培养箱中孵育12 ～ 16h后,挑取菌落培养,提取质粒,进行酶切鉴定,最后进行测序.将测序正确的重组载体用脂质体法转染人胚胎肾(human embryonic kidney293,HEK293)细胞.最后,通过共聚焦显微镜观察经过免疫荧光染色的细胞以及Western blot鉴定人Neu-rotensinl-R的表达.结果 通过PCR扩增出一条1257bp的基因片段,序列与GenBank (NM_002531)相同.Western blot中大约90kDa处有一蛋白条带,与预期大小相同.人Neurotensin-R表达在细胞膜上.结论 成功构建了pRluc-hNeurotensinl-R重组表达载体,建立了该质粒转染HEK293的细胞模型.可被用于检测与其它受体间的相互作用以及研究Neurotensin1-R介导的细胞内信号转导机制,这将有助于探究疾病的发病机制及开发新的药物靶点.     

pRluc-hNeurotensinl-R重组真核表达载体的构建及在离体细胞中的表达

目的构建与海肾荧光素酶（Rluc）融合的人Neurotensin-R1（HumanNeurotensinreceptorl，NTS1 or NTSR1）真核表达载体，用于生物发光共振能量转移法检测人NTS与其它受体间的相互作用以及研究Neurotensin—R介导的细胞内信号转导机制。方法以质粒peDNA3．1-hNTS1为模板，PCR方法扩增人NTS。扩增的人NTS以及质粒pRluc—pcDNA3．1用NotI和XbaI双酶切，然后将这2种酶切产物按常规方法连接、转化至大肠杆菌Top10中，该菌在培养箱中孵育12～16h后，挑取菌落培养，提取质粒，进行酶切鉴定，最后进行测序。将测序正确的重组载体用脂质体法转染人胚胎肾（humanembryonickidney293，HEK293）细胞。最后，通过共聚焦显微镜观察经过免疫荧光染色的细胞以及Westernblot鉴定人Neu—rotensinl—R的表达。结果通过PCR扩增出一条1257bp的基因片段，序列与GenBank（NM-002531）相同。Westernblot中大约90kDa处有一蛋白条带，与预期大小相同。人Neurotensin—R表达在细胞膜上。结论成功构建了pRluc—hNeurotensinl—R重组表达载体，建立了该质粒转染HEK293的细胞模型。可被用于检测与其它受体间的相互作用以及研究Neurotensinl—R介导的细胞内信号转导机制，这将有助于探究疾病的发病机制及开发新的药物靶点。     

pcDNA3.1(+)gpc-5真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建pcDNA3.1（＋）磷脂酞肌醇蛋白5（gpc-5）基因真核表达载体。方法：根据gpc-5基因序列设计一对引物,利用RT-PCR法扩增出gpc-5基因的编码区（CDS）,连接在PGM-T载体上,并进行pcDNA3.1（＋）gpc-5真核表达载体的构建、酶切鉴定以及测序。结果：gpc-5基因的体外扩增目的片段为2 083 bp。所构建的重组体pcDNA3.1（＋）gpc-5经双酶切鉴定,与预期片段大小一致,测序结果与NCB I收录gpc-5基因的CDS序列一致。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）gpc-5,为研究gpc-5基因在原发性肺癌的发生发展中的作用奠定了基础。     

小鼠pcDNA3.1/CXCL14真核表达载体的构建、表达及意义

目的 构建小鼠pcDNA3.1/CXCL14真核表达载体,观察其在293T细胞中的表达,为进一步探讨CXCL14对脂肪细胞因子、氧化应激及胰岛素信号转导通路的影响提供工具.方法 从C57/BL胚鼠肝脏组织中抽提RNA,RT-PCR扩增CX-CL14基因片段,并将其插入pcDNA3.1进行测序,鉴定正确构建pcDNA3.1/CXCL14后转染293T细胞,用RT-PCR法和Western blot法分别从mRNA水平和蛋白质水平分别检测CXCL14的表达情况.结果 重构质粒经PCR、限制性核酸内切酶Nhe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切以及DNA序列分析鉴定,表明真核表达载体构建正确;以脂质体法转染293T细胞后,RT-PCR、Western blot能检测到目的蛋白表达.结论 成功构建了小鼠pcDNA3.1/CXCL14真核表达载体并能在真核细胞中进行表达.     

pB2 R-Venus 重组真核载体的构建及在 HEK293T细胞中的表达

目的：构建带有黄色荧光蛋白突变体 Venus标签的人缓激肽2型受体（bradykinin receptor 2, B2R）真核表达载体,用于B2R与相关受体及蛋白的相互作用、B2R受体介导的信号转导机制的研究等。方法根据人B2R基因序列设计引物,以质粒pcDNA3．1-B2R为模板,PCR扩增目的基因人B2R。EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切扩增产物及质粒pVenus-N1,经回收、连接、转化,获取重组质粒。对重组质粒进行酶切、测序鉴定。转染重组质粒至 HEK293T细胞,荧光显微镜观察受体B2R的细胞定位,蛋白印迹法检测目的蛋白人B2R蛋白的表达。结果 PCR扩增出了1条长度为1176 bp的基因片段,测序结果与GenBank （AY275465）相同。荧光显示B2R表达于质膜。Western blot结果显示,实验组蛋白印迹条带与目的蛋白大小相同,为44kDa。结论成功构建了pB2R-Venus重组真核表达载体,瞬时转染成功,获得了转染有重组质粒的HEK293T细胞。成功构建的重组质粒pB2R-Venus可用于后续BRET、FRET等实验研究,有助于B2R介导的信号转导机制的探讨和药物靶点的寻找。     

真核表达质粒pcDNA3.1a-FGFR1构建及意义

目的:构建真核表达质粒pcDNA3.1a-FGFR1.方法:通过PCR扩增FGFR1目的片段,双酶切纯化PCR产物及pcDNA3.1a,将扩增的FGFR1基因片段插入pcDNA3.1a线性质粒,即构建成pcDNA3.1a-FGFR1真核表达质粒,将质粒转化感受态DH5α菌株,筛选阳性克隆行双酶切鉴定及测序鉴定.结果:酶...     

LETM1基因真核表达载体的构建

[目的]构建线粒体LETM1基因真核表达载体．[方法]从肾癌细胞株293T细胞中提取mRNA及合成cDNA,设计并合成线粒体LETM1基因引物,用PCR方法扩增LETM1基因,连接到真核表达载体pCMV-3Tag-6上,构建重组质粒pCMV-3Tag—LETM1,经酶切和测定序列进行鉴定．[结果]构建了重组质粒pCMV-3Tag—LETM1．[结论]成功地构建了线粒体LETM1真核表达载体．     

ADAM9基因真核表达质粒的构建及表达

目的:构建人源性去整合素金属蛋白酶9(ADAM9)基因真核表达载体并表达其编码蛋白(转染293T细胞).方法:利用包含ADAM9全长编码核酸序列的质粒PCR4-TOPO作为模板,用PCR扩增其核心编码区,将其克隆至PMD18-T Vector中构建PMD18-T-ADAM9质粒,同时双酶切PMD18-T-ADAM9及P...     

hERβ全长基因真核表达载体的构建及在PC-3M细胞中的表达

目的:构建人雌激素受体β(hERβ)全长基因的真核表达载体pEGFP-C1-hERβ,并转染激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3M。方法:RT-PCR法从人卵巢组织钓取hERβ全长基因,序列测定后,应用基因重组技术构建真核表达载体pEGFP-C1-hERβ。质粒经酶切和PCR电泳鉴定后,采用质脂体转染法转染PC-3M细胞。结果:经限制性酶切鉴定和测序分析证实,成功地完成hERβ的扩增和表达载体的构建;荧光显微镜下可见转染的PC-3M细胞有绿色荧光蛋白的表达,PCR测定分析,转染细胞hERβ的表达增加。结论:构建完成真核表达载体pEGFP-C1-hERβ,并在PC-3M细胞内成功表达。     

大鼠GPR17基因真核表达载体的构建及其功能鉴定

目的:构建大鼠GPR17(rGPR17)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并对其功能进行初步研究.方法:从大鼠脑组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增rGPR17 cDNA,与载体pcDNA3.1(+)连接,并转化到大肠杆菌DH5α以获得重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,以PCR、双酶切和测序鉴定;将重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17通过脂质体转染方法,转染HEK293细胞,RT-PCR、免疫荧光法检测rGPR17的表达,Fluo-4测定激动剂LTD_4处理后细胞内钙变化.结果:RT-PCR、双酶切和测序证明,重组的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17构建成功,并在HEK293细胞获得表达,加入外源性激动剂LTD_4可诱导细胞内钙的增加.结论:成功构建了rGPR17的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并在HEK293细胞功能性表达,为GPR17受体及其拮抗剂的研究提供了基础.     

人pcDNA3.1(+)-Cav-1真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建pcDNA3.1 (+)-Cav-1真核表达载体,建立稳定转染pcCav-1的6-10B细胞系(6-10B-Cav-1).方法 提取5-8F细胞总RNA,利用RT-PCR获取caveolin-1(Cav-1)开放读码框(Open reading frame,ORF)序列构建Cav- 1/TA亚克隆载体,再将双酶切后的目的片段连入pcDNA3.1(+)真核表达载体并转染6-10B细胞.结果 RT-PCR扩增Cav-1基因ORF序列在783 bp附近见目的条带;质粒酶切鉴定及菌落PCR鉴定分别在783 bp及346 bp附近见目的条带;转染6-10B细胞后,转染组与对照组相比,Cav-1在mRNA水平表达差异具有统计学意义(P =0.027),在蛋白质水平前者比后者高出2倍以上.结论 人Cav-1重组真核表达载体pcDNA3.1( +)-Cav-1构建成功并获得稳定表达Cav -1的6-10B细胞,为进一步检测C av -1在鼻咽癌转移过程的作用奠定基础.     

VCAM-1基因的克隆及VCAM-1-pcDNA3.1(+)真核表达载体的构建

目的克隆人血管细胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1) cDNA全长,并构建VCAM-1-pcDNA3.1( )真核表达载体.方法采用半巢式RT-PCR从人脐静脉内皮细胞系HUV-EC-C中分三段扩增得到VCAM-1cDNA片段,采用重叠延伸剪切技术(SOE)并经SacⅠ酶切、T4连接酶连接获得VCAM-1完整片段,克隆至pcDNA3.1( )真核表达载体,得到VCAM-1-pcDNA3.1( )真核表达载体.结果酶切及测序结果证明VCAM-1-pcDNA3.1( )真核表达载体构建成功.结论成功扩增人VCAM-1基因,构建VCAM-1-pcDNA3.1( )真核表达载体,为探索VCAM-1修饰人脐血基质细胞(human umbilical cord blood stromal cell,hUCBSC)重建造血微环境奠定了实验基础.     

ZAK-β蛋白激酶基因真核表达载体的构建

目的 将人源ZAK-β基因定向克隆入MSCV-IRES-GFP质粒,构建真核表达载体pMSCV-IRES-GFP-ZAK-β.方法 以肺癌A549细胞的cDNA为模板,通过PCR得到ZAK-β特异性基因产物,克隆入真核表达载体pMSCV-IRES-GFP中,获得重组真核表达载体pMSCV-IRES-GFP-ZAK-β,测序验证.结果 扩增了ZAK-β基因,经双酶切、测序鉴定证实目的基因克隆到真核表达载体pMSCV-IRES-GFP中,测序结果与预测完全一致.结论 成功构建了ZAK-β逆转录病毒表达载体,为进一步研究ZAK蛋白激酶的功能奠定了基础.     

pcDNA3.1-hTERT真核表达载体的构建及其抗肿瘤效应

目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)真核表达载体pcDNA3.1-hTERT,并观察其对荷瘤小鼠的抗肿瘤效应.方法:用RT-PCR方法扩增出带有Hind Ⅲ, BamHⅠ酶切位点的hTERT基因片段,与pGEM-T Easy克隆载体连接,筛选出阳性克隆,酶切获得目的片段,与pcDNA3.1载体连接,构建pcDNA3.1-hTERT表达载体.将真核表达载体pcDNA3.1-hTERT注射移植性H22肝癌模型C57BL/6小鼠,并设PBS组及转染空质粒pcDNA3.1组,观察3组的抗肿瘤效应.结果与结论:成功构建pcDNA3.1-hTERT真核表达载体.该载体中的hTERT基因片段全长为951 bp,可编码相对分子量为37 000、由317个氨基酸构成的多肽.该基因片段与GenBank公布的相应基因进行同源性比较,核苷酸序列的同源性为98.73%,编码产物的氨基酸序列的同源性为99.68%.该真核表达载体免疫荷瘤小鼠后,pcDNA3.1-hTERT组肿瘤生长受到抑制,且该组生存期分别长于PBS组及pcDNA3.1组 (P<0.05);pcDNA3.1- hTERT组的IL-2、IFN-γ细胞因子水平也均高于PBS组与pcDNA3.1组(P<0.05).提示该真核表达载体在受试动物体内可有效地诱导特异性抗肿瘤免疫应答.