VEGF shRNA表达质粒的构建及对血管内皮细胞VEGF表达的抑制

目的：构建大鼠血管内皮生长因子（VEGF）短发夹RNA（shor thairpin RNA,shRNA）真核表达质粒,观察其对大鼠主动脉血管内皮细胞（ECs）中VEGF表达的影响.方法：采用DNA重组技术根据大鼠VEGF mRNA序列设计并合成3条shRNA寡核苷酸片段,构建表达质粒并通过脂质体介导转染ECs,采用RT-PCR,Western Blot方法分别检测VEGF mR-NA及蛋白质的表达.结果：经酶切和测序证实VEGF shRNA重组质粒构建成功.3条VEGF shRNA质粒均可下调VEGF mRNA和蛋白的表达,其中VEGF shRNA3质粒的抑制作用较强,转染72h时VEGF mRNA和蛋白的抑制率可分别达到71.91%和67.86%.结论：成功构建VEGF靶向RNA干扰重组体,并能有效抑制ECs中VEGF mRNA和蛋白的表达,为利用RNA干扰技术从转录后水平抑制角膜新生血管的研究提供依据.     

HDAC2基因RNA干扰载体的构建

目的:构建组蛋白去乙酰化酶2 (HDAC2)基因RNA慢病毒干扰质粒载体.方法:对比HDAC2基因序列,设计并合成短发夹RNA(shRNA)干扰靶点序列,克隆入经AgeI与EcoRI双酶切后的RNA干扰载体pLKO.1-puro,构建pLKO.1-HDAC2-shRNA重组质粒,采用酶切法和测序法验证重组质粒.结果:成功退火合成3对短发夹RNA序列并将其克隆入pLKO.1-puro载体中,构建重组质粒pLKO.1-HDAC2-shRNA1、pLKO.1-HDAC2-shRNA2及pLKO.1-HDAC2-shRNA3,经酶切鉴定和测序验证重组质粒载体与预期靶序列相同.结论:成功构建HDAC2-shRNA慢病毒干扰载体,为进一步研究HDAC2的功能及应用提供有效工具.     

干扰AFP蛋白表达的shRNA表达载体的构建及活性鉴定

目的:利用含报告基因EGFP的pGenesil-1质粒构建干扰AFP蛋白表达的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达的载体,并进行活性鉴定.方法:设计表达短发夹RNA的互补DNA序列,经退火成双链,克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析.构建正确的重组质粒经脂质体转染HepG2细胞,检测转染率和培养细胞上清的AFP含量变化,确定重组质粒的活性.结果:构建了靶向AFP蛋白的2个shRNA重组质粒载体pGenesil-1-siAFP1和pGenesil-1-siAFP2.酶切鉴定和测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功.重组质粒有效转染HepG2细胞并显著抑制AFP表达.结论:成功构建具有活性的、能够表达shRNA靶向干扰AFP蛋白的2个重组质粒载体.     

靶向bcl-2基因转录shRNA重组质粒的构建和筛选

目的 构建能高效抑制肝星状细胞(HSCs)bcl-2表达的小发夹RNA(shRNA)重组质粒.方法 利用RNA干扰技术,设计有小发夹结构的3条DNA序列,经退火形成互补双链,克隆至转录载体psiRNA-hHlneo上构建重组质粒,予以酶切和测序鉴定.重组质粒转染HSC-T6细胞株,运用实时荧光定量PCR和Western blotting进行筛选鉴定.结果 酶切及测序鉴定表明,成功构建重组质粒shRNA1、shRNA2和shRNA3.实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,shRNA1和shRNA2转染后显著抑制HSC-T6中bcl-2 mRNA和蛋白表达(P＜0.05),其中siRNA1的bcl-2表达抑制效率＞80%.结论 构建的重组质粒shRNA1能有效抑制HSCs中bcl-2的表达.实验为进一步探索肝纤维化基因治疗的新途径奠定了基础.     

Skp2 shRNA表达质粒的构建及其对肺癌细胞生长的影响

目的 构建Skp2基因的RNAi真核表达质粒,观察其对SIC-A-1肺癌细胞内Skp2基因表达及细胞生长的影响.方法 根据GenBank中Skp2cDNA序列设计针对Skp2基因的shRNA序列,合成序列并克隆人pGenSil-1质粒中,构建skp2 pshRNA重组质粒.脂质体介导重组质粒转染SPC-A-1肺癌细胞.RT-PCR检测肺癌细胞Skp2 mRNA的表达,Western blot检测Skp2蛋白表达.MTT检测各纽细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞周期改变.结果 重组质粒经酶切鉴定和测序,证实表达干扰质粒构建成功.转染重组质粒的肺癌细胞Skp2 mRNA和蛋白的表达明显下降(P<0.05),细胞生长增殖受到抑制,阻滞在G0/G1期的细胞比例增加,而进入S期的细胞比例明显下降(P<0.05).结论 构建的Skp2 shRNA表达质粒能有效下调Skp2基因的mRNA及蛋白的表达、抑制细胞的生长增殖.     

靶向bcl-2基因转录shRNA重组质粒的构建和筛选

目的构建能高效抑制肝星状细胞(HSCs)bcl-2表达的小发夹RNA(shRNA)重组质粒。方法利用RNA干扰技术,设计有小发夹结构的3条DNA序列,经退火形成互补双链,克隆至转录载体psiRNA-hH1neo上构建重组质粒,予以酶切和测序鉴定。重组质粒转染HSC-T6细胞株,运用实时荧光定量PCR和Western blotting进行筛选鉴定。结果酶切及测序鉴定表明,成功构建重组质粒shRNA1、shRNA2和shRNA3。实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,shRNA1和shRNA2转染后显著抑制HSC-T6中bcl-2mRNA和蛋白表达(P<0.05),其中siRNA1的bcl-2表达抑制效率>80%。结论构建的重组质粒shRNA1能有效抑制HSCs中bcl-2的表达。实验为进一步探索肝纤维化基因治疗的新途径奠定了基础。     

一种方便酶切鉴定的shRNA表达载体改建方法

目的 建立一种用单限制性内切酶酶切来快速筛选重组小发夹RNA(shRNA)表达载体的方法.方法 制备包含单一限制性内切酶Cta Ⅰ识别序列的双链DNA插入片段(Cla Ⅰ位点两侧碱基序列不互补).与BamH Ⅰ和Hind Ⅲ线性化的shRNA表达载体pSilencer-4.1(不含Cla Ⅰ识别序列)构建载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ.用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,将酶切产物与表达绿色荧光蛋白(GFP)shRNA的DNA模板(不含Cla Ⅰ识别序列)做连接反应.构建GFP shRNA表达质粒.提取阳性克隆质粒DNA,行Cla Ⅰ单酶切鉴定,对未被Cla Ⅰ线性化的质粒行DNA测序鉴定.结果 DNA测序表明正确构建了shRNA表达载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,以pSilencer-4.1-Cla Ⅰ为载体构建的GFPshRNA候选重组子中,不能被Cla Ⅰ线性化的均为GFP shRNA表达质粒.结论 构建了可用于制备shRNA表达质粒的通用载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,所引入的单一的Cla Ⅰ识别位点可以用来快速地筛选重组shRNA表达质粒.     

Y-盒结合蛋白1短发夹环RNA真核表达载体的构建

目的:构建Y-盒结合蛋白1(Y-box binding protein-1,YB-1)特异性短发夹环RNA(shRNA)真核表达载体.方法:采用人U6SnRNA启动子,分别把被9 bp序列间隔的19 bp长短的YB-1靶序列的反向重复序列,置于pGensil-1质粒载体中,构建成YB-1短发夹环RNA,产生重组质粒pGensil-1/U6/YBX11,pGensil-1/U6/YBX12及pGensil-1/U6/YBX13.分别用Pst Ⅰ和Sal Ⅰ酶切鉴定;并将经酶切鉴定正确后的重组质粒作测序分析.结果:YB-1的特异性shRNA片段被成功克隆进pGensil-1质粒中,Sal Ⅰ酶切鉴定可切出400 bp大小的片段,DNA测序分析显示,重组质粒shRNA编码序列与设计片断的序列完全一致.结论:成功构建了针对YB-1的特异性shRNA真核表达载体pGensil-1/U6/YBX11,pGensil-1/U6/YBX12及pGensil-1/U6/YBX13,为进一步研究其基因功能打下了基础.     

靶向Id-1基因的RNA干扰对人矽肺癌细胞增殖的影响

目的探讨RNA干扰技术沉默Id-1基因表达后对矽肺癌细胞株增殖能力的影响。方法针对Id-1基因mRNA靶向设计合成短发夹RNA,构建重组pGFU6/neo质粒,重组质粒转染矽肺癌YTLMC-90细胞株。反转录-聚合酶链式反应检测转染后Id-1基因的转录;免疫印迹法检测Id-1,核转录因子NF-κB/p50、NF-κB/p65,Bcl-2,Bax,环氧合酶-2,c-Myc基因,血管内皮细胞生长因子,增殖细胞核抗原,β-actin基因的表达;流式细胞术检测细胞周期的变化;~3H-胸腺嘧啶核苷掺入法、四氮唑蓝法和克隆形成实验检测细胞的增殖活力。结果重组质粒经酶切和测序鉴定,证明靶基因序列正确,质粒构建成功;反转录-聚合酶链式反应和免疫印迹法检测结果表明,矽肺癌细胞转染重组质粒后Id-1基因mRNA转录和蛋白合成都明显下降,Bcl-2、环氧合酶-2、c-Myc、增殖细胞核抗原、血管内皮细胞生长因子等与增殖相关基因表达量下降;细胞周期被阻滞在G_0/G_1期,S期细胞明显减少;细胞活力降低,增殖受到抑制。结论构建的重组质粒能靶向沉默Id-1基因,并抑制YTLMC-90细胞株的增殖能力,因此Id-1基因可以作为人矽沉着病并发肺癌基因治疗的候选靶点。     

大鼠血管内皮生长因子shRNA表达质粒的构建及鉴定

目的:构建大鼠血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)短发夹RNA(Short hairpin RNA,shRNA)真核表达质粒,为利用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)从转录后水平抑制角膜新生血管的研究做准备.方法:用DNA重组技术根据大鼠VEGF mRNA序列设计并合成3条shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pSihncer2.0 U6中,进行酶切鉴定和测序.结果:酶切证明构建的shRNA序列已插入载体,经测序证明与设计的相同,获得大鼠VEGF shRNA表达质粒.结论:成功构建了3条大鼠VEGF shRNA真核表达质粒,为靶向VEGF的RNAi抑制角膜新生血管奠定了基础.     

抗精子抗体和抗子宫内膜抗体与不孕及流产的关系

目的　探讨抗精子抗体（ＡｓＡｂ）与抗子宫内膜抗体（ＥＭＡｂ）在不孕、流产中的作用及二者关系,进一步 揭示不孕、流产的病因。方法　采用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）同时检测３４５例不孕、流产妇女血清中的ＡｓＡｂ与 ＥＭＡｂ,按ＡｓＡｂ检测结果分阳性组和阴性组,比较两组ＥＭＡｂ阳性率的差异。结果　原发不孕及自然流产妇女中, ＡｓＡｂ（－）组ＥＭＡｂ阳性率高达１６．６７％和１９．５１％,而ＡｓＡｂ（＋）组ＥＭＡｂ阳性率高达４３．６４％和４２．８６％,显著高于 ＡｓＡｂ（－）组（Ｐ＜０．０１,Ｐ＜０．０５）。继发不孕妇女中ＡｓＡｂ（－）组ＥＭＡｂ阳性率为１８．１８％,ＡｓＡｂ（＋）组ＥＭＡｂ阳性率 为３２．２％,二者无显著性差异（０．０１＞Ｐ＞０．０５）。结论原发不孕及自然流产妇女中因个体免疫反应差异使某些 人易对体内、外物质发生免疫反应而产生抗体,从而导致不孕或流产。     

亚硝基脲类和亚硝基硫脲类的理化性质及致突变能力

本题选择N,N′-二甲基亚硝基脲(DMNU),N,N′-二乙基亚硝基脲(DENU),及其类似物N,N′-二甲基亚硝基硫脲(DMNTU)、N,N′-二乙基亚硝基硫脲(DENTU)为代表,测定了这些化合物的水解反应速度、脂溶性(HPLC的logk′值)、水解产物和致突变能力。证明了硫脲的脂溶性大于脲的脂溶性。DMNTU对TA100菌株的致突变能力最强,其它较弱。     

水疗联合抚触对新生儿的生长发育、黄疸及睡眠的影响

目的探讨新生儿游泳联合抚触对新生儿的生长发育、黄疸及睡眠的影响。方法将经阴道顺产分娩的正常新生儿100例随机分为两组，观察组（水疗联合抚触组）50例，对照组（单纯沫浴组）50例。①测定两组10日、28日的体重、身长、上臂围；②观察记录胎便转黄时间，测定皿清胆红素；③记录24h睡眠时间。结果两组新生儿10日、28日体重、身长、上臂同增长有显著差异（P〈0．05），两组新生儿5日时，胎便转黄时间及黄疸指数比较均有显著性差异（P〈0．01），两组睡眠时间比较有统计学意义（P〈0．05），两组并发症比较无统计学意义（P〉0．05）。结论新生儿水疗联合抚触可促进新生儿的生长发育，能加速胎粪的早排出，减轻生理性黄疸程度，有效地降低新生儿高胆红素血症的发病率，提高睡眠质量。     

气血与足月妊娠分娩关系的探讨

论述足月妊娠分娩的发动和维持依靠气的推动、温煦、气化、固摄功能和血的营养、濡润功能。顺利分娩既要气血充足，还要气顺血和。临床研究结果表明调补气血，是促进产程，预防难产的重要手段。实验研究结果阐明调补气血中药加强产力、促进产程主要是从改善产妇全身情况，提高机体抗应激、抗疲劳、耐缺氧能力，即所谓使产妇气血充足调和，充分发挥气血在分娩过程中的生理作用。