大鼠耳蜗大上皮嵴的分离和鉴定

目的：探讨利用酶消化和机械解剖相结合分离大鼠耳蜗大上皮嵴(GER)的方法。方法：取出生后0～3d的SD大鼠耳蜗基底膜后,将其放人含有嗜热菌蛋白酶和少许DNA酶的D-Hank溶液中,37℃孵箱孵育25min进行酶消化,然后在高倍显微镜下进行显微机械分离;对分离的GER细胞用免疫组织化学和RT-PCR扩增GER细胞特异性表达基因Hesl的方法进行鉴定,并进行GER的原代培养以验证其活性。结果：免疫组织化学染色表明分离的GER细胞是单一的上皮组织;对Hesl基因进行RT-PCR分析表明,分离的GER细胞表达该基因;分离的GER具有活性并可以进行原代培养。结论：利用酶消化和机械解剖相结合的方法可以分离出纯粹的有活性的GER,为进一步建立GER细胞系,进行各种基因转染试验以及耳蜗内的各种基础实验建立细胞模型提供有效的实验手段。     

大鼠耳蜗大上皮嵴的形态学演变

目的 观察不同胚胎期的大鼠和新生大鼠耳蜗大上皮嵴形态上的变化。方法选取胚胎期14、16、18、20天和出生后当天、2、5、7、10、14天等10个时间段的大鼠耳蜗，分别进行冰冻切片和HE染色。结果毛细胞的分化成熟是从底回向顶回进行，顶回较底回有1～2天的延迟。大上皮嵴结构重排、细胞减少从腔侧开始，出生后2周左右当毛细胞分化成熟时消失。结论胚胎期14天前后是大上皮嵴形态演变的关键时期。大上皮嵴是耳蜗形态不成熟的标志之一。     

p27Kip1在不同时期大鼠耳蜗大上皮嵴的表达

目的观察p27Kip1在不同时期大鼠耳蜗的大上皮嵴中的表达情况,探讨p27Kip1在毛细胞分化和再生过程中的作用.方法对胚胎期12天、13天、14天、16天、18天、20天和出生后当天、2天、5天、7天、10天、14天等12个年龄段的大鼠耳蜗进行冰冻切片,然后以1:100抗p27Kip1小鼠单克隆抗体为一抗,1:200异硫氰酸荧光素标记山羊抗小鼠IgG为二抗,进行免疫荧光组织化学检查.结果①胚胎期14天时,p27Kip1开始在蜗管表达,其表达限于原始柯蒂氏器.原始柯蒂氏器中全部细胞均着色.②胚胎期20天左右时,p27Kip1开始在大上皮嵴细胞表达,而在毛细胞中停止表达,但在支持细胞中仍有表达.③出生后7天时,p27Kip1在大上皮嵴的表达达到最强,之后其表达减弱,直至出生后2周时大上皮嵴结构消失.④p27Kip1在耳蜗发育成熟后仍在支持细胞中表达.结论p27Kip1可以作为听感觉上皮的一个标记物.p27Kip1在大上皮嵴细胞中表达,对正常数目毛细胞的产生和耳蜗嵌合体的形成有重要作用.p27Kip1在支持细胞中长期表达是哺乳类毛细胞不能再生的原因之一.     

大鼠耳蜗大上皮嵴及小上皮嵴细胞永生细胞系的建立

目的：建立大鼠耳蜗大、小上皮嵴细胞永生细胞系。方法：取P1大鼠耳蜗,分离出耳蜗上皮薄片组织,并与含SV40-LT抗原的逆转录病毒共培养,从而实现细胞的永生化。利用单克隆法纯化细胞系,并通过形态学、免疫组织化学等方法对细胞系进行鉴定。结果：大鼠耳蜗大、小上皮嵴细胞永生细胞系基本保持了细胞原代的表型特征：呈现上皮细胞样的多角形外观;不同世代的细胞均表达Isletl及SV40-LT抗原。该系目前已培养3个月,超过20代,传代时间为3～4d,传代比例为1：5。结论：本实验成功建立了大鼠耳蜗大、小上皮嵴细胞的永生细胞系,这为大、小上皮嵴细胞生物学特性及相关功能,特别是毛细胞再生及前体细胞移植治疗感音神经性聋方面的研究奠定了坚实的实验基础。     

转基因诱导新生大鼠耳蜗大、小上皮嵴细胞分化为毛细胞样细胞实验

目的通过转染Hathl基因诱导大鼠耳蜗大上皮嵴细胞（greater epithelial ridge,GER）和小上皮嵴细胞（1esser epithelial ridge,LER）分化为毛细胞样细胞。方法取出生后第l天的大鼠耳蜗,利用机械分离和酶消化相结合的方法分别分离出纯的GER和LER细胞,并转染Hathl基因,培养后做免疫组化染色观察。结果GER和LER体外培养并转染Hathl基因后,免疫组化检测显示肌球蛋白（myosinVIIa）染色阳性,表达毛细胞的特异标记物。提示GER和LER已分化为毛细胞样细胞。结论GER和LER细胞作为毛细胞前体细胞可以实现体外培养,转染Hathl后．可分化为毛细胞样细胞。     

N型乙酰胆碱受体α10亚基在大鼠内耳耳蜗及前庭中的表达

目的研究N型乙酰胆碱受体α10亚基在大鼠前庭终器、Scarpa’s神经节、基底膜、螺旋神经节中的表达。方法运用RT-PCR技术分别检测大鼠前庭终器、Scarpa’s神经节、基底膜、螺旋神经节编码N型乙酰胆碱受体α10亚基的基因表达。以大鼠脑组织RNA为阳性对照。结果N型乙酰胆碱受体α10亚基在大鼠前庭终器、基底膜上有表达,在Scarpa’s神经节、螺旋神经节中无表达。结论在前庭终器和基底膜上扩增出标志N型乙酰胆碱受体α10亚基基因表达的PCR产物,为乙酰胆碱是内耳重要的神经递质之一提供了支持,并为N型乙酰胆碱受体在内耳中的传入-传出调节中的作用提供了依据。     

重组腺相关病毒rAAV—NT4-ADNF-9转染大鼠耳蜗组织的体外研究

目的：包装携载神经营养素（NT4）与活性依赖性神经营养因子-9（ADNF-9）融合基因的重组腺相关病毒rAAV-NT4-ADN-9，并观察该重组病毒对体外培养的耳蜗组织的转染。方法：使用pSSHG-CMV-NT4-ADN-9、pFG140和pAAV／Ad三种质粒共转染293包装细胞，制备ADN-9重组腺相关病毒（AAV），应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度；体外分离培养新生SD大鼠的耳蜗毛细胞；将重组病毒感染体外培养的新生SD大鼠耳蜗毛细胞，于24h后提取组织行RT-PCR以检测rAAV—NT4-ADNF-9对耳蜗的转染。结果：应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度为2×10^14cfu／L，表明成功构建了重组AAV载体。成功分离培养新生SD大鼠的耳蜗毛细胞后，经RT—PCR反应，琼脂糖凝胶电泳检测结果显示NT4-ADNF-9在耳蜗组织中得到表达。结论：构建的重组病毒rAAV-NT4ADNF-9在体外可成功转染耳蜗组织，用于基因治疗的研究。     

诱导新生大鼠耳蜗大上皮嵴细胞分化为毛细胞样细胞

目的大鼠耳蜗大上皮嵴细胞（greater epithelial ridge,GER）转染Hath1基因,与耳蜗间质细胞共培养诱导分化为毛细胞样细胞。方法取出生后第1天的大鼠耳蜗,利用机械分离和酶消化相结合的方法分离出纯的GER细胞,与耳蜗间质细胞共培养或转染Hath1基因培养,做免疫组化和扫描电镜观察。结果GER体外培养具有增殖能力,GER与耳蜗间质细胞共培养或转染Hath1基因后,免疫组化MyosinVIIa阳性,扫描电镜部分细胞的表面可见不成熟的纤毛样结构,提示GER已分化为毛细胞样细胞。结论GER细胞作为毛细胞前体细胞可以实现体外培养,与耳蜗间质细胞共培养或转染Hath1后,可分化为毛细胞样细胞。     

经完整圆窗膜途径EGFP基因在大鼠耳蜗中的表达

目的 研究经完整圆窗膜途径进行耳蜗基因转导的可行性及安全性，为内耳基因治疗提供实验基础和理论依据。方法 24只SD大鼠术前及术后分别行听性脑干反应(ABR)检查。实验组(18只)用阳离子脂质体携带的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluoresent protein，EGFP)基因，对照组(6只)用生理盐水，注入置于圆窗龛处的明胶海绵内。分别于术后3、7、14天取双侧耳蜗标本做基底膜铺片观察。结果 于圆窗龛处放置明胶海绵的转导方法对听力无明显影响。转染耳蜗呈明显的绿色荧光。3天组表达产物最高，7天组逐渐降低，14天组更弱。对侧及对照组耳蜗均未见荧光表达。结论 于圆窗龛处放置明胶海绵进行基因转导的方法对听力没有影响，且能够成功转染耳蜗组织，是一种行之有效的方法。     

胸腺素beta4在快速老化鼠耳蜗的过度表达

目的　通过比较年轻与年老的快速老化鼠 (senescence acceleratedmouse ,SAM)耳蜗中基因表达水平 ,筛选并分析可能的与老年聋相关的基因。方法　将分别从 2个月和 12个月的SAM耳蜗中提取的总RNA合成cDNA ,并与载有 110 1鼠基因的基因芯片进行杂交 ,杂交信号通过蓝色素 3荧光显色 ,并使用微机对其图像进行分析。通过实时定量逆转录聚合酶链式反应技术对其结果进行验证。用免疫荧光染色的方法 ,确定候选基因所编码的蛋白在耳蜗中的表达部位。结果　多数基因在老年耳蜗中的表达并没有明显的变化 ,本研究发现有 3个基因的表达较年轻耳蜗中有明显的增加 ,通过定量逆转录聚合酶链式反应技术证实其中的胸腺素beta4mRNA过度表达。免疫荧光染色显示胸腺素beta4主要在耳蜗的盖膜及外毛细胞的支持细胞中表达。结论　通过生物芯片技术 ,显示老年鼠耳蜗中基因表达的情况 ,并发现胸腺素beta4有可能与老年聋相关。这一研究为探讨老年聋的分子生物学机制提供了参考。     

大鼠耳蜗大上皮嵴细胞体外培养的实验观察

目的建立大鼠耳蜗大上皮嵴（greater epithelial ridge，GER）细胞体外培养体系，探讨其在离体培养条件下的生物学特性、生长模式及超微结构。方法取生后1d大鼠耳蜗，利用机械分离和酶消化相结合的方法分离出纯GER细胞，分别于无血清和含10％胎牛血清的DMEM培基中进行培养，观察细胞生长特性，并对培养物进行溴脱氧尿苷（BrdU）、鬼笔环肽（phalloidin）、Z01、钙视网膜蛋白（calretinin）及肌球蛋白VIIa（myosin VIIa）免疫组化鉴定及扫描电镜观察。结果GER体外培养细胞呈现典型的上皮样多角形外观，细胞间连接紧密，具有明显的增殖能力，在含血清培养基中易形成贴壁细胞岛，而在无血清培养条件下则易形成悬浮细胞球。GER细胞呈现BrdU、phalloidin以及Z01染色的阳性反应，而calretinin及myosinVIIa则表现为阴性。扫描电镜显示GER细胞表面可见微绒毛和中心体，但未见毛细胞特异性结构纤毛束。结论GER体外培养细胞具有增殖能力，在不同培养条件下可分别呈现贴壁细胞岛及悬浮细胞球生长特性，GER细胞表达上皮细胞来源标记物，但不表达毛细胞特异性标记物。     

蛋白激酶CK2α特异性小干扰RNA对喉癌细胞生长的抑制作用

目的探讨蛋白激酶CK2α特异性小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）对人喉癌细胞系Hep-2增殖和凋亡的影响。方法构建蛋白激酶CK2α特异性siRNA表达质粒psiRNA-hHlneo-CK2及非特异性表达质粒psiRNA-hH1 neo-cont，分别用脂质体转染法转染Hep-2细胞。采用逆转录聚合酶链反应、Western Blot技术检测转染后蛋白激酶CK2αmRNA和蛋白表达，采用四甲基偶氮唑蓝法检测转染后Hep-2细胞的增殖情况，流式细胞术检测转染后对Hep-2细胞凋亡的影响。结果转染psiRNA-hH1 neo-CK2载体后，Hep-2细胞蛋白激酶CK2α mRNA和蛋白表达均较非特异干扰组和空白组明显下降（P〈0．05），Hep-2细胞生长缓慢（P〈0．05），其细胞周期出现明显亚二倍体峰（P〈0．05）。结论蛋白激酶CK2α特异性siRNA表达载体可以下调Hep-2细胞蛋白激酶CK2α的表达，抑制细胞增殖并诱导其凋亡。     

凋亡及其相关基因在实验性自身免疫性内耳病小鼠内耳组织中的表达

目的探讨凋亡及其相关基因在自身免疫性内耳病形成和发展中的作用。方法选用近交系C57BL／6小鼠随机数字表法分为正常对照组和免疫7、14、21、28d组，每组16只。提取豚鼠内耳膜迷路组织为抗原，与等量完令弗氏佐剂，百日咳杆菌一次免疫实验组动物，制备自身免疫性内耳病动物模型，应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术（terminal deoxynucleotidyl transferase—mediated d-UTP nick end—labing，TUNEL）检测内耳中的细胞凋亡，应用免疫组化和逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术检测Fas、FasL及bcl-2在内耳的表达。结果正常小鼠内耳组织中，TUNEL染色阳性细胞极为少见，偶尔在Corti器或球囊斑的支持细胞发现。免疫7d后，内毛细胞和少量的血管纹边缘细胞TUNEL染色阳性，14d后TUNEL染色阳性的细胞数量及种类显著增加，但外毛细胞、螺旋神经节细胞与前庭神经节细胞免疫前后均未见凋亡表达。免疫组化染色显示，正常小鼠内耳中Fas表达广泛，FasL存部分螺旋神经节细胞与前庭神经节细胞表达，bcl-2仅在螺旋神经节细胞、前庭神经节细胞有较强表达。免疫后FasL在各种组织均有较强表达，bcl一2在外毛细胞出现表达，在耳蜗神经无细胞的表达增加。RT—PCR检测正常小鼠内耳组织的Fas mRNA、FasL mRNA、bcl-2mRNA均为阳性，FasL mRNA低水平表达，免疫后升高，在2周达到高峰后逐渐下降；bcl-2 mRNA在免疫后进行性升高。结论Fas／FasL信号系统介导的凋亡与自身免疫性内耳病的发生、发展过程关系密切，bcl-2对内耳中Fas／FasL介导的凋亡有重要的调节作用。