蛋白激酶C在人绒毛膜癌JAR细胞中作用的研究

研究蛋白激酶C对人绒毛膜癌JAR细胞分泌人绒毛膜促性腺激素 (hCG)的影响 ,探讨PKC在调控JAR细胞hCG分泌中的作用。不同浓度的PKC激动剂 phorbol 12 -myristrate 13 -acetate(PMA )急性和慢性刺激、PKC抑制剂chelerythrinechlorine(CHEL)分别作用JAR细胞 ,测定hCG分泌量变化和细胞内磷酸化丝裂原激活的蛋白激酶 (mitogen -activatedproteinkinase ,MAPK)的改变。结果显示不同浓度PMA急性刺激时 ,抑制JAR细胞hCG分泌 ,在 2 0 0nmol/L时 ,其抑制作用最强 ;PMA慢性刺激时 ,JAR细胞hCG分泌量增加 ,在 2 0 0nmol/L时 ,其作用最强。CHEL作用JAR细胞时 ,hCG分泌量升高 ,在 60 0nmol/L时 ,其作用最强。对照组及各实验组都有活性的MAPK的表达 ,与对照组相比 ,PMA慢性刺激组、CHEL组MAPK磷酸化水平升高 ;PMA急性刺激组MAPK磷酸化水平降低。PKC参与调节JAR细胞hCG的分泌 ,活性升高时 ,下调MAPK磷酸化 ,使JAR细胞hCG分泌减少 ,而活性降低时 ,增强MAPK磷酸化 ,JAR细胞hCG分泌量增加     

丝裂原活化蛋白激酶对佛波酯诱导滋养细胞MMP-9基因表达的影响

目的 探讨佛波酯(PMA)诱导细胞滋养层细胞(CTB)MMP-9基因表达的调控机制。方法 用细胞ELISA法测定CTB细胞的蛋白激酶活性变化；用反转录聚合酶链反应检测CTB中MMP-9的基因表达。结果 100nmol／L PMA能迅速激活CTB中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、c-jun氨基末端激酶(JNK)以及p38 MAPK激酶的活性。100nmol／L PMA刺激CTB引起MMP-9 mRNA表达显著增加，能被ERK或p38 MAPK的特异性抑制剂所抑制。结论 ERK和p38 MAPK可能是PMA诱导CTB中MMP-9基因表达增加的重要调节物质。     

丝裂原活化蛋白激酶对佛波酯诱导滋养细胞MMP-9基因表达的影响

目的 探讨佛波酯(PMA)诱导细胞滋养层细胞(CTB)MMP-9基因表达的调控机制。方法 用细胞ELISA法测定CTB细胞的蛋白激酶活性变化;用反转录聚合酶链反应检测CTB中MMP-9的基因表达。结果 100 nmol/L PMA能迅速激活CTB中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、c-jun氨基末端激酶(JNK)以及p38 MAPK激酶的活性。100 nmol/L PMA刺激CTB引起MMP-9 mRNA表达显著增加,能被ERK或p38 MAPK的特异性抑制剂所抑制。结论 ERK和p38 MAPK可能是PMA诱导CTB中MMP-9基因表达增加的重要调节物质。     

KBV200细胞多药耐药与蛋白激酶C表达上调的关系

目的 研究KBV200多药耐药细胞蛋白激酶C（PKC）的表达，探讨PKC的表达上调与肿瘤多药耐药的关系。方法KBV200细胞分对照组和佛波酯（PMA）组，PMA组应用200nmol/L的PMA预孵育细胞．而对照组不用。^32P掺入法测定多药耐药KBV200细胞株的PKC活性，通过Western blotting检测PKC各亚型表达和亚细胞分布。用MTT法检测细胞耐药性。结果PMA预孵育可提高KBV200细胞的PKC总活性和膜组分PKC活性，降低浆组分PKC活性（P〈0．01）。PMA预孵育使膜组分PKCa表达增加，浆组分PKCa表达降低，膜组分PKCβ无明显变化，浆组分PKCB的表达稍增强。PMA可升高长春新碱、阿霉素对KBV200细胞的IC50值（P〈0．01）。结论PMA使KBV200细胞耐药性增加，可能与PKC表达上调有关。     

哮喘气道重塑中钙调神经磷酸酶与蛋白激酶活性的相互调节

目的:研究钙调神经磷酸酶(CaN)信号途径与蛋白激酶C(PKC)、丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)和蛋白激酶A(PKA)的相互调节在哮喘气道重塑发病中的作用.方法:建立卵蛋白诱导的哮喘豚鼠模型,实验分为:哮喘组、CaN抑制剂环孢霉素A(CsA)组和对照组,采用磷酸化和去磷酸化方法测定肺组织CaN活性、MAPK活性、PKC活性、PKA活性.在离体培养的大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)中,以尾加压素Ⅱ(UⅡ)为刺激因素,测定CaN,PKC和MAPK活性以及它们之间的相互调节.结果:(1)哮喘组CaN活性、MAPK活性和PKC活性分别较对照组高19%(P<0.01)、28%(P<0.01)和35%(P<0.05),PKA活性较对照组低53%(P<0.01).CsA组CaN活性、MAPK活性和PKC活性分别较哮喘组低52%(P<0.01)、18%(P<0.05)和52%(P<0.01),PKA活性较哮喘组高2.65倍(P<0.01).(2)UⅡ 10-7 mol/L孵育20 min引起ASMC PKC和MAPK活性分别较对照组增加44%和24%(P<0.01),并呈时间依赖性引起ASMC中CaN活性增加,24 h为对照组的1.67倍(P<0.01).(3)与单用UⅡ 10-7 mol/L组比,CaN抑制剂CsA 10-6 mol/L使CaN活性降低了45%(P<0.01),MAPK抑制剂PD98059 50 μmol/L对CaN活性无明显影响(P>0.05),PKC抑制剂H7 50 μmol/L使CaN活性下降21%(P<0.05).(4)CsA 10-6 mol/L 作用使UⅡ 10-7 mol/L刺激的ASMC PKC活性下降了14%(P<0.05),对MAPK活性无明显影响(P>0.05).结论:在哮喘气道重塑的发生过程中,CaN与MAPK、PKC和PKA之间存在相互调节.     

KBV200细胞多药耐药与蛋白激酶C表达上调的关系

目的 研究KBV200多药耐药细胞蛋白激酶C(PKC)的表达,探讨PKC的表达上调与肿瘤多药耐药的关系。方法 KBV200细胞分对照组和佛波酯(PMA)组,PMA组应用200nmol/L的PMA预孵育细胞,而对照组不用。³²P掺入法测定多药耐药KBV200细胞株的PKC活性,通过Westernblotting检测PKC各亚型表达和亚细胞分布。用MTT法检测细胞耐药性。结果 PMA预孵育可提高KBV200细胞的PKC总活性和膜组分PKC活性,降低浆组分PKC活性(P<0.01)。PMA预孵育使膜组分PKCα表达增加,浆组分PKCα表达降低,膜组分PKCβ无明显变化,浆组分PKCβ的表达稍增强。PMA可升高长春新碱、阿霉素对KBV200细胞的IC₅₀值(P<0.01)。结论 PMA使KBV200细胞耐药性增加,可能与PKC表达上调有关。     

甲硫氨酸脑啡肽和抗δ阿片受体抗体对小鼠骨髓瘤细胞信号转导系统的影响

目的探讨甲硫氨酸脑啡肽对小鼠骨髓瘤细胞信号转导系统的作用及其机制.方法用不同浓度甲硫氨酸脑啡肽(methionine enkep-halin,MENK)及抗δ阿片受体单克隆抗体处理小鼠的骨髓瘤细胞(NS-1),采用组蛋白磷酸化法测定NS-1细胞蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)的活性,并采用放射免疫分析法测定其三磷酸肌醇(IP3)的含量.结果MENK可升高细胞胞浆及胞膜PKA的活性,且这一作用可被抗δ阿片受体抗体所拮抗.MENK对PKC影响呈双向反应,0.1μmol/L MENK可以升高胞浆PKC活性,但却明显降低胞膜PKC活性;MENK浓度为10μmol/L时PKC活性的改变则与此相反;1μmol/L的MENK可明显降低胞浆及胞膜PKC活性,抗体可拮抗这种下调作用.MENK可降低细胞内IP3的含量,且这一作用可被抗δ阿片受体抗体所拮抗.结论MENK在与δ阿片受体结合后,可以通过多种信号转导系统来调节细胞功能,从而产生不同的生物效应.     

p38MAPK通路在佛波酯诱导人绒癌JAR细胞体外侵袭中的作用

目的 研究细胞内p38MAPK信号传导通路在人绒癌JAR细胞体外侵袭中的作用。方法 用ELISA法测定JAR细胞中p38MAPK的活性变化；用Tramwell细胞侵入系统检测细胞的侵袭作用；用MTT法评价细胞生长状况。结果 佛波酯(PMA)呈浓度依赖性地激活JAR细胞中p38MAPK。PMA能促进人绒癌JAR细胞的体外侵袭作用，而p38特异性抑制剂SB203580抑制了JAR细胞的侵袭能力。结论 p38MAPK通路在人滋养细胞的侵袭行为以及人绒癌的形成中具有重要作用。p38MAPK抑制剂可能会为人绒癌的防治提供新的途径。     

纳洛酮在细胞信号转导系统中对甲硫氨酸脑啡肽的拮抗作用

目的:探讨甲硫氨酸脑啡肽对细胞信号转导系统的影响及其机制.方法:用甲硫氨酸脑啡肽及不同浓度的纳洛酮处理小鼠的骨髓瘤细胞(NS-1),采用组蛋白磷酸化法测定NS-1细胞蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)的活性.结果:1×10-6 mol/L的甲硫氨酸脑啡肽可以升高NS-1细胞胞浆PKA活性,却降低胞浆PKC活性,而且这2种作用均能被不同浓度的纳洛酮所拮抗.结论:甲硫氨酸脑啡肽通过传统的阿片受体机制参与了2条(cAMP-PKA途径及DG-PKC途径)胞外信号传递系统的信号传递.     

水通道蛋白5对PMA诱导的原代小鼠气道上皮细胞MUC5AC合成的影响

 目的 探讨水通道蛋白5(aquaporin 5,AQP5)对卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯(phorbol myristate acetate,PMA)诱导的原代培养小鼠气道上皮细胞MUC5AC合成的影响及可能机制。方法 原代培养两种小鼠(AQP5基因敲除鼠和野生鼠)气道上皮细胞,Transwell建立气液平面,2周后扫描电镜及角蛋白免疫组化鉴定气道上皮细胞。蛋白激酶(protein kinase C,PKC)特异性激动剂PMA刺激原代小鼠气道上皮细胞及PKC通路特异性阻断剂Calphostinc阻断该通路,ELISA检测两组小鼠MUC5AC蛋白水平的变化,用Western blot检测小鼠气道上皮细胞PMA刺激后PKC、p-PKC、p-p38、p38、ERK、p-ERK的表达差异。结果 气液平面培养后,扫描电镜显示培养的细胞上皮有微绒毛和纤毛覆盖,细胞角蛋白14免疫组化染色为阳性。PMA 20ng/mL 刺激24h后,两组小鼠气道上皮细胞分泌的MUC5AC明显升高,AQP5基因敲除鼠增加更显著(P<0.05),两者差异有统计学意义。PKC特异性阻断剂Calphostinc能阻断PMA引起的两组小鼠MUC5AC分泌。原代小鼠气道上皮细胞经PMA刺激后,Western blot检测显示PKC、p38磷酸化激活,ERK通路无变化。结论 AQP5通过PKC-p38信号通路影响黏蛋白MUC5AC的合成和分泌。     

p38 MAPK通路在佛波酯诱导人绒癌JAR细胞体外侵袭中的作用

目的研究细胞内p38 MAPK信号传导通路在人绒癌JAR细胞体外侵袭中的作用。方法用ELISA法测定JAR细胞中p38 MAPK的活性变化;用Transwell细胞侵入系统检测细胞的侵袭作用;用MTT法评价细胞生长状况。结果佛波酯(PMA)呈浓度依赖性地激活JAR细胞中p38 MAPK。PMA能促进人绒癌JAR细胞的体外侵袭作用,而p38特异性抑制剂SB203580抑制了JAR细胞的侵袭能力。结论p38 MAPK通路在人滋养细胞的侵袭行为以及人绒癌的形成中具有重要作用。p38 MAPK抑制剂可能会为人绒癌的防治提供新的途径。     

Parathyroid hormone-mitogen-activated protein kinase axis exerts fibrogenic effect of connective tissue growth factor on human renal proximal tubular cells

Background Enhanced and prolonged expression of connective tissue growth factor （CTGF） is associated with kidney fibrosis. Parathyroid hormone （PTH） is involved in the genesis of disturbed calcium/phosphate metabolism and ostitis fibrosa in renal failure. PTH activated mitogen-activated protein kinase （MAPK） signaling pathway is present in renal tubular cells. The aim of this study was to identify the mechanism how the signal is transduced to result in extracellular signal-regulated protein kinase （ERK） activation, leading to upregulation of CTGF.Methods The levels of CTGF mRNA and protein in human kidney proximal tubular cells （HK-2） treated with PTH in the presence or absence of the MAPK inhibitor PD98059 were analyzed by quantitative real-time polymerase chain reaction （RT-PCR） and immunoblotting assay. The activation of the CTGF promoter in HK-2 cells was determined by the dual-luciferase assay. The effects of the protein kinase A （PKA） activator 8-Br-cAMP and protein kinase C （PKC） activator phorbol 12-myristate 13-acetate （PMA） on MAPK phosphorylation, and the effects of the PKA inhibitor H89 and PKC inhibitor calphostin C on MAPK phosphorylation and CTGF expression were detected by immunoblotting assay.Results PD98059 inhibited the PTH stimulated expression of CTGF, which strongly suggested that the MAPK signaling pathway plays an important role in the PTH-induced CTGF upregulation in renal tubular cells. A PKA activator as well as PKC activators induced MAPK phosphorylation, and both PKA and PKC inhibitors antagonized PTH-induced MAPK phosphorylation and CTGF expression.Conclusion CTGF expression is upregulated by PTH through a PKC/PKA-ERK-dependent pathway.     

PKC介导P38MAPK通路调控结直肠癌细胞MMP-9表达及侵袭的研究

目的 研究MAPK信号通路对结直肠癌SW480细胞MMP-9表达及细胞侵袭作用的影响。方法 观察蛋白激酶C激活剂TPA诱导下SW480细胞形态学的改变;蛋白免疫印迹法检测MMP-9、P38MAPK蛋白的表达,zymography法检测MMP-9蛋白的分泌,利用Transwell实验观察细胞侵袭能力。结果 显微镜下观察,随着TPA浓度的升高,细胞形态逐渐改变成针尖样;蛋白免疫印迹法显示,TPA处理下P38磷酸化增加,MMP-9蛋白表达和分泌增加,呈时间依赖性;并且肿瘤细胞侵袭能力随之增强;而通过预处理PKC抑制剂和P38抑制剂,可明显抑制TPA诱导的MMP-9表达和细胞侵袭能力。结论 在结直肠癌SW480细胞中PKC激动剂TPA通过激活P38MAPK信号通路调控MMP-9表达及细胞侵袭,为阻止结直肠癌侵袭转移研究提出多方位的作用靶点和新思路。     

PKC和TPK在血小板激活中的作用

目的为了研究蛋白激酶（PKC）和酪氨酸蛋白激酶（TPK）在血小板激活中的作用。方法用卟啉酸肉豆蔻乙酸酯（PMA）,凝血酶,前列腺素E1（PGE1）和环磷酸腺苷（db－cAMP）,在含二磷酸腺苷（ADP）清除剂的缓冲剂中去激发经阿司匹林切断,32P－NaH2PO4标记冲洗后的牛血小板。40KD（PKC的底物）的磷酸化程度随PMA或凝血酶的浓度而增加。同样26KD、38KD的磷酸也是如此。由于PMA诱导的血小板聚集的同时伴随PKC活化。PGE（腺苷环化酶激活物）不能抑制由50nmol/1PMA诱导的血小板聚集,db-cAMP,腺苷不能抑制PKC引起的蛋白磷酸化。结果在碱处理的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEgel）中发现40KD和57KD多肽比其他多肽更有抗碱力。40KD和57KD多肽的磷酸氨基酸分析指出含有磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸。结论在PMA、凝血酶激活的血小板中,PKC、TPK都发生激活作用,40KD废物是PKC的底物又是TPK的底物,PKC和TPK在血小板聚集中起着重要调节作用。     

蛋白激酶C对大肠癌耐药株LoVo/Adr细胞多药耐药性的影响

目的　探讨蛋白激酶C（PKC）活性对大肠癌多药耐药性的影响以及可能涉及的调控机制。方法　（1）以放射性32P,掺入法检测了在十字孢碱（SP）和佛波脂（PMA）作用下大肠癌耐药细胞LoVo/Adr中PKC活性的变化;（2）以流式细胞术检测了PKC活性对LoVo/Adr细胞摄入阿霉素的影响;（3）以RT-PCR法检测了PKC活性对LoVo/Adr细胞mdr1基因表达的影响。结果（1）PMA可双向调节LoVo/Adr细胞的PKC活性,SP对LoVo/Adr细胞胞浆和胞膜中的PKC活性均有显著的抑制效果;（2）在PMA作用30min时,LoVo/Adr细胞中阿霉素的摄入量显著减少,作用24h时,阿霉素摄入量显著增加;（3）PMA和SP均不影响mdr1基因的表达。结论　PKC可调控细胞的多药耐药性,但并非通过调节mdr1基因的mRNA水平而实现。     

The signal transduction pathway in the proliferation of airway smooth muscle cells induced by urotensin Ⅱ

Background Human urotensin Ⅱ (UⅡ) is the most potent mammalian vasoconstrictor identified so far. Our previous study showed that UⅡ is a potent mitogen of airway smooth muscle cells (ASMC) inducing ASMC proliferation in a dose-dependent manner. The signal transduction pathway of UⅡ mitogenic effect remains to be clarified. This study was conducted to investigate the signal transduction pathway in the proliferation of ASMC induced by UⅡ. Methods In primary cultures of rat ASMCs, activities of protein kinase C (PKC), mitogen-activated protein kinase (MAPK) and calcineurin (CaN) induced by UⅡ were measured. The effect of CaN on PKC and MAPK was studied by adding cyclosporin A (CsA), a specific inhibitor of CaN. Using H7 and PD98059, inhibitors of PKC and MAPK, respectively, to study the effect of PKC and MAPK on CaN. The cytosolic free calcium concentration induced by UⅡ was measured using Fura-2/AM. Results UⅡ 10-7 mol/L stimulated ASMC PKC and MAPK activities by 44% and 24% (P&lt;0.01), respectively, after incubating for 20 minutes. It increased CaN activity in a time-dependent manner, being 1.68 times as that of control for 24 hours (P&lt;0.01). It promoted the cytosolic free calcium concentration increase of 18% (P&lt;0.01). CsA 10-6 mol/L and H7 50 μmol/L inhibited UⅡ-stimulated CaN activity by 45% (P&lt;0.01) and 21% (P&lt;0.05), respectively, while PD98059 50 μmol/L had no effect on CaN activity (P&gt;0.05). CsA 10-6 mol/L inhibited UⅡ-stimulated PKC activity by 14% (P&lt;0.05), while having no effect on MAPK activity (P&gt;0.05). Conclusions UⅡ increases cytosolic free calcium concentration and activates PKC, MAPK and CaN. The signal transduction pathway between PKC and CaN has cross-talk.     

蛋白激酶C和丝裂原活化的蛋白酶家族对缺血预处理肝脏的保护作用及其机制

目的 研究在肝脏缺血预处理保护效应中蛋白激酶C（PKC）活性改变及细胞内信号转导机制。方法 建立大鼠肝脏缺血预处理模型,应用PKC抑制剂、激动剂和丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）抑制剂,通过检测PKC和P44／42MAPKs磷酸化水平、HSP70表达量等的变化,同时观察光镜下细胞形态学损害。对相关数据进行统计学处理。结果 与缺血再灌注组比较．预处理组和PKC激动剂组的PKC磷酸化水平显著增高（P〈0.01）,P44／42MAPKs磷酸化水平、HSP70表达量明显增加．肝细胞结构改变较小。与缺血预处理组相比,PKC抑制剂组相应的观察指标呈相反变化,PKC磷酸化水平显著降低（P〈0.01）;MEK抑制剂组的P44／42MAPKs磷酸化激活显著减少,HSP70表达量降低,肝组织细胞结构出现较明显的改变。结论 体内缺血预处理保护作用中,PKC激活对P44／42MAPKs通路激活起到至关重要的作用,PKC对P44／42MAPKs起正性调控作用．HSP70表达受P44／42MAPKs调控。