人BLyS基因真核细胞表达载体的构建和鉴定

目的构建人BLyS基因真核细胞表达载体.方法采用RT-PCR方法,从激活的人外周血淋巴细胞的总cDNA中扩增得到876bp的人BLyS cDNA片段,再用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒.结果人BLyS cDNA已经正确克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中.结论本实验结果为研制抗人BLyS单克隆抗体来研究BLyS与B淋巴细胞功能的关系以及进一步探索自身免疫性疾病的治疗新途径奠定了基础.     

KIR2DL4-IgFc融合蛋白基因真核细胞表达载体的克隆及鉴定分析

目的：构建人KIR2DL4－IgFc段融合蛋白基因真核细胞表达载体。方法：用RT－PCR从孕妇蜕膜组织单个核细胞的总mRNA中逆转录扩增KIR2DL4细胞外段cDNA，经Nhe I和BamH I双酶切后，定向插入真核细胞表达载体CD5lnegl中，然后经酶切和测序鉴定。结果：限制性内切酶切酶 切和序列分析表面已成功构建CD5lnegl-KIR2DL4载体，结论：本研究成功构建KIR2DL4－IgFc融合蛋白真核细胞表达载体，为研究KIR2DL4与其配体之间的关系奠定了基础。     

人白细胞分化抗原CD59基因克隆及序列分析

为了获得人ＣＤ５９ｃＤＮＡ完整序列,以建立表达人ＣＤ５９分子的小鼠Ｔ细胞模型,更深入地探补体ＭＡＣ及ＣＤ５９分子与Ｔ细胞活化的关系。方法通过设计和合成成引物,提取细胞总ＲＡＮ进行逆转录反应,经ＰＣＲ扩增目的片段,并将基克隆于ＰＵＣ１８及ＰＵＣ１９质粒上,测定其ＤＮＡ序列。     

人β2m基因的克隆及表达

β2m是含有99个氨基酸的血清蛋白,也是构成MHC-I类分子的亚单位。最初从肾脏患者的尿液中分离得到[1],其表达异常与多种肿瘤及肝、肾疾病有密切关系。HLA-A2的晶体结构已证实,α3和β2m折叠起来形成Ig样功能区[2],并表明β2m对维持I类分子的天然构型的稳定性及其表达起关键作用[3,4]。MHC-I类分子在免疫系统中占有极其重要的地位,目前已趋向利用基因工程技术构建MHC-I类分子复合物以克服从体内获得的困难[5,6]。本研究成功地构建了其轻链β2m的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达。1 材料和方法1.1 材料E.coli C600…     

正反义人cyclin A基因真核细胞表达载体的构建与鉴定

恶性肿瘤无限制增殖的主要原因是,细胞增殖周期的失控,目前已发现细胞周期蛋白(ｃｙｃｌｉｎ)在细胞周期调节中具有重要的作用。其中ｃｙｃｌｉｎＡ存在于细胞核内,出现在ＤＮＡ开始合成之前,具有有丝分裂的作用,在Ｇ1→Ｍ期转换中与ｃｙｃｌｉｎＢ起协同作用[1]。当细胞...     

人生长激素基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建人生长激素的真核细胞表达载体,测定并分析目的 基因序列.方法 用PCR方法扩增出人生长激素基因,连接至T克隆载体,然后分别亚克隆至真核细胞表达载体pCDNA3.1、pCEP4中.使用DNA ssist软件分析序列.结果 所构建真核表达载体的酶切鉴定、PCR鉴定、测序鉴定均正确.结论 成功构建出多个人生长激素基因真核细胞表达载体,验证了基因序列的正确性,为下一步基因治疗研究打下基础.     

人淋巴细胞抑制素基因克隆与表达的研究

目的：获人SPN基因，构建SPN的原核表达载体。方法：采用RT－PCR的方法从激活的人外周血淋巴细胞的总cDNA中得到1493bp的人SPN基因，NdeI,BamH I双酶切后定向克隆到原核表达载体pET-11-c中，全自动测序仪测序，转化宿主菌BL21后，IPTG诱导，SDS－PAGE电泳分析。结果：成功克隆到人SPN基因，并构建表达质粒，SDS－PAGE电泳证实目的蛋白表达。结论：为进一步研究SPN的免疫抑制机理和作用以及探讨SPN作为新型生理性免疫抑制剂的可能性打下了坚实的基础。     

人LIGHT基因的克隆及其重组腺病毒载体的构建

目的 克隆人LIGHT基因，构建其重组腺病毒载体，以研究LIGHT过表达与腺病毒感染对细胞生长的影响。方法 用RT-PCR法从人外周血单个核细胞（PBMC）中克隆人的LIGHT全长基因。将LIGHT cDNA克隆到穿棱载体pAdTrack-CMV-LIGHT重组质粒中，经酶切线性化后，将重组质粒pAdTrack-CMV-LIGHT和骨架质粒pAdEasy-1，以电穿孔法共转染大肠杆菌BJ5183，获得重组腺病毒质粒。最后，将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒，用荧光显微镜、PCR及Western blot分析LIGHT基因的表达。结果 用RT－PCR法从人的PBMC中，扩增出723bp的cDNA，测序证实为人LIGHT基因。荧光显微镜、PCR及Western blot证实，LIGHT重组腺病毒可感染293细胞，并在293细胞内进行有效的复制。结论 成功地克隆了人LIGHT基因，并构建了其重组腺病毒载体，为进一步研究LIGHT基因的功能提供了条件。     

人外周血单个核细胞CD14基因的扩增及序列测定

目的 介绍一种获取人ＣＤ１４基因的简易方法,方法 利用ＣＤ１４基因组成的特点,采用聚合酶链反应技术以人外周血单个核细胞基因组ＤＮＡ为模板扩增获取人ＣＤ１４基因。结果 从人外周血单个核细胞基因组ＤＮＡ中成功扩增出大小约１．１ｋｂ的人ＣＤ１４基因,并且经基因序列测定表明,克隆的人ＣＤ１４基因序列与文献报道完全相同。     

人CD154-GST融合蛋白基因在大肠杆菌中的表达

目的:为制备重组人CD154-谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白(hCD154-GST),用于人CD154单克隆抗体研制。方法:根据人CD154基因序列设计合成特异性引物,RT-PCR扩增人CD154基因,并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-1中,得到重组表达质粒pGEX-4T-1/CD154;用此重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞,转化菌落经BamHⅠ、EcoRⅠ酶切鉴定。IPTG诱导大肠杆菌表达人CD154蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果:从人外周血淋巴细胞扩增出820bp的hCD154cDNA;将其克隆至pGEX-4T-1质粒中,经双酶切鉴定及DNA序列分析证实含有目的基因;IPTG诱导后的大肠杆菌经SDS-PAGE电泳鉴定出现明显的55kD蛋白带。结论:成功构建了人CD154-GST原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达出人CD154-GST融合蛋白,为人CD154单克隆抗体的研制及进一步抗排斥反应的研究打下了基础。     

人CD38抗原胞外段基因克隆及表达

目的 克隆并表达人CD38抗原分子的胞外估基因。方法 采用RT－PCR法，从高表达CD38抗原的Daudi细胞系中，扩增CD38全长cDNA，并将其插入pGEM-T载体中。重新设计引物，从重组pGEMT载体中，扩增CD38抗体分子的胞外段基因，再亚克隆到表达载体pET28a( )，转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导表达。结果 经酶切鉴定及序列分析表明，克隆的CD38外段基因的序列与文献^[1,2]的报道完全一致。将该片段亚克隆到表达载体pET28a( ) ,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21中获得表达。结论 获得了人CD38抗原分子胞外段基因及其原核表达产物，对进一步制备单克隆抗体，研究CD38分子的功能具有重要的意义。     

抗人CD134单抗对植物血凝素诱导的外周血单个核细胞穿孔素表达的影响

目的 观察不同浓度抗人CD134单抗对外周血单个核细胞（PBMC）穿孔素表达的影响及时间效应，旨在探讨抗人CD134单抗治疗自身免疫性疾病的可能机制。方法 在植物血凝素诱导下，分别以1μg／ml、5μg／ml和10μg／ml的抗人CD134单抗作用于人PBMC，于6h、12h、24h、48h用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测穿孔素mRNA表达，流式细胞仪检测穿孔素蛋白表达。结果 不同浓度的CD134单抗作用不同时间后，健康成人PBMC穿孔素mRNA和蛋白的表达均有不同程度的下调，且在24h达最低值。当CD134单抗≤5μg／ml时，随着单抗浓度的增加，穿孔素mRNA明显下调，其差异有统计学意义，当CD134单抗浓度〉5μg／ml时，穿孔素mRNA不再下调（P〉0．05）；穿孔素蛋白表达也有类似的变化。结论 抗人CD134单抗可以在转录水平和翻译水平上抑制穿孔素的表达，这种作用在24h达到高峰且会饱和，这可能被用于治疗某些自身免疫性疾病。     

CD154 cDNA克隆、单克隆抗体制备及特异性鉴定

本研究目的是获得特异性抗人CD15 4单克隆抗体。利用特异引物 ,通过RT PCR从人外周血淋巴细胞中扩增出编码CD15 4分子的cDNA全长 ,将其克隆在谷胱甘肽巯基转移酶 (GST )融合蛋白表达载体pGEX4T 3中 ,转染大肠杆菌Jm10 9经诱导获得GST CD15 4表达。融合蛋白经分离纯化后 ,免疫Balb/c小鼠 ,应用杂交瘤技术 ,通过ELISA双筛 ,得到 2株抗CD15 4单抗 (1D3和 5H4)。其亚型分别是IgG2a和IgG1。又将CD15 4cDNA全长构建真核表达载体pcDNA3 CD15 4,并转染COS细胞 ,以G418筛选后 ,经RT PCR结果证实pcDNA3 CD15 4已成功转染COS细胞。所获单抗对转染CD15 4的COS细胞和刺激活化的人淋巴细胞有特异性结合反应 ,为进一步研究单抗功能奠定了实验基础。