TRAIL联合环氧合酶抑制剂体外诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

目的 探讨塞莱昔布增加TRAIL诱导肝癌细胞HepG2、Hep3B凋亡的分子机制.方法 应用流式细胞仪分析塞莱昔布联合应用TRAIL对肝癌细胞HepG2和Hep3B细胞周期的影响;Western blot检测HepG2和Hep3B细胞在塞莱昔布作用前后凋亡信号传导蛋白caspase-8,caspase-3,caspase-9,DR4,DR5,DcR1,c-FLIP,RIP,Cytc,Smac和Bid的表达变化.结果 联合用药组中HepG2及Hep3B细胞生存率分别为29.37%±2.68%和22.75%±2.77%,显著低于塞莱昔布单独用药组的73.04%±4.03%和66.90%±3.47%(t=9.975,P＜0.01).塞莱昔布预先处理能够下调c-FLIP及RIP的表达及增加Cytc、Smac、Bid的表达,但对DR4、DR5、DcR1的表达无明显影响.结论 TRAIL联合塞莱昔布通过下调c-FLIP及RIP的表达,活化死亡受体通路及上调Bid的表达,激活线粒体通路诱导肝癌细胞凋亡.     

受体作用蛋白在肝癌细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导凋亡耐受中的作用

目的 观察受体作用蛋白(RIP)基因的表达变化在肝癌细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导凋亡耐受中的作用.方法 以肝癌细胞HepG2、Hep3B为研究对象,制备RIP siRNA的细胞模型,应用流式细胞仪分析两种细胞模型对TRAIL作用后细胞周期的变化,Western blot检测其在RIP基因沉默前后凋亡信号传导蛋白Caspase-8、Caspase-3、DFF-45的表达变化.结果 转染RIP siRNA后,细胞恢复了对TRAIL诱导凋亡的敏感性,当TRAIL浓度为100 μg/L时,HepG2及Hep3B转染组的细胞生存率为(60.02±5.23)％和(50.78±3.76)％,显著低于对照组的(96.44±5.43)％和(101.85±6.41)％(P＜0.01);细胞生存周期SubG1期为(76.89±6.68)％和(72.45±7.31)％,显著高于对照组的(0.78±0.07)％和(3.62±0.38)％(P＜0.01).转染组TRAIL单独作用,可以引起HepG2 siRNA及Hep3B siRNA凋亡传导通路上传导蛋白Caspase-8、Caspase-3的裂解.结论 肝癌细胞对TRAI诱导凋亡的耐受可能与其传导通路上RIP蛋白的表达相关,抑制其表达可以导致凋亡传导蛋白Caspase-8、Caspase-3的裂解,促使凋亡的发生,恢复肝癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性.     

TRAIL联合顺铂诱导肝癌细胞HepG2凋亡的研究

目的 探讨顺铂增加TRAIL诱导肝癌细胞HepG2凋亡的分子机制，提供TRAIL应用肝癌临床治疗的一种新的用药模式。方法 以肝癌细胞HepG2为研究对象，应用流式细胞仪分析顺铂联合应用TRAIL对细胞周期的影响，Western blot检测顺铂作用前后HepG2细胞在TRAIL诱导凋亡过程中Caspase-8、Caspase-3、DR4、DR、DcR，c—FLIP及RIP的表达变化。结果 顺铂能够增强TRAIL诱导HepG2细胞凋亡的能力，两者联合应用具有明显的协同作用，顺铂预先处理能够下调c-FLIP及RIP的表达及增加DR的表达。结论 TRAIL联合顺铂可以诱导肝癌细胞HepG2凋亡，其机制是通过下调c-FLIP及RIP的表达，解除Caspase-8受抑，恢复凋亡信号的传导来实现的。死亡受体D＆的表达上调也可能参与了这一变化过程。     

肿瘤坏死因子凋亡诱导配体诱导膀胱癌EJ细胞凋亡的研究

目的 探讨肿瘤坏死因子凋亡诱导配体(TRAIL)诱导膀胱癌细胞凋亡的效应。方法 10～100μg／L梯度浓度的TRAIL与培养的EJ细胞共孵育4～24h。采用Annexin V染色，DNA云梯实验和流式细胞技术检测诱导后EJ细胞凋亡发生的时期和程度。结果 TRAIL诱导4h即后可观察到早期细胞凋亡发生，8h后即可检测DNA片段化，24h后凋亡细胞最多达到66．29％。结论 TRAIL能够迅速诱导EJ细胞凋亡，可能成为膀胱癌治疗的新方法。     

TRAIL联合IFN-γ诱导骨肉瘤细胞凋亡实验研究

目的 观察干扰素(IFN)-γ协同肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导骨肉瘤细胞(MG-63)凋亡的作用,初步探讨协同作用机制,并观察联合用药时对成纤维细胞的毒性作用.方法 应用相差显微镜和电镜观察MG-63细胞经TRAIL、IFN-γ及TRAIL联合IFN-γ作用后细胞形态学变化;进行四唑盐比色试验观察不同实验组MG-63细胞和成纤维细胞抑制率;流式细胞仪观察细胞凋亡情况;逆转录-聚合酶链反应法观察IFN-γ作用后TRAIL膜受体表达情况.结果 TRAIL联合IFN-γ应用时,随着IFN-γ作用时间的延长,细胞悬浮、空泡化等现象逐渐明显,且在作用24小时最为显著,电镜显示细胞凋亡的特征性变化;联合用药组细胞抑制率较单独TRAIL组增加,两者有显著性差异(P<0.01);联合用药组细胞凋亡率显著增加(P<0.01);应用IFN-γ前后,TRAIL死亡受体(DR)4的相对表达量增加,IFN-γ作用24小时表达量最大,两者有显著性差异(P<0.01);联合用药组对成纤维细胞的毒性,与单独TRAIL组相比没有显著增加(P>0.05).结论 IFN-γ可协同TRAIL诱导MG-63细胞凋亡,DR4表达量增加可能是协同作用的缘故,联合用药不会增加对成纤维细胞的毒副反应.     

槐耳清膏联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对肝癌细胞生长的影响

目的探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）联合中药槐耳清膏对肝癌细胞株HepG2及肝癌耐阿霉素（ADM）细胞株（HepG,．ADM）的作用。方法通过培养液中ADM的浓度梯度递增法筛选培养,建立肝癌细胞HepG2-ADM耐药细胞株;TRAIL,TRAIL＋ADM,TRAIL＋槐耳清膏分别处理肝癌细胞株HepG2、HepG,-ADM及正常肝细胞株L02,噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖,采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果联合用TRAIL（100ng／L）和槐耳清膏（1．0g／L）处理肝癌细胞株HepG2-ADM及肝细胞株L02,MTT显示对前者增殖有明显抑制作用,而对后者无明显作用;流式细胞仪检测TRAIL联合槐耳清膏处理HepG2、HepG2-ADM,可诱导细胞凋亡,与其他组相比,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论槐耳清膏可显著增强TRAIL对HepG2及HepG2-ADM的杀伤作用,而对正常胎肝细胞株L02杀伤作用轻微,TRAIL和槐耳清膏联合应用可望克服肿瘤细胞中存在的化学治疗药物耐药和TRAIL耐受问题。     

TRAIL的抗肝细胞癌作用研究

目的 探讨TRAIL对HCC的治疗作用。方法 用不同浓度TRAIL处理肝癌细胞株HepG2、SMMC7721，观察经药物处理前后肿瘤细胞的凋亡发生率。采用分子克隆技术构建了真核表达质粒pIRES-EGFP-TRAIL，转染肝癌细胞株HepG2、SMMC7721细胞，观察其疗效。体内实验建立裸鼠肝癌模型，观察TRAn。的抑癌作用。结果TRAR，(100ng／m1)处理24h，肝癌细胞凋亡发生率约10％，而Jurkat细胞凋亡率达70％以上，胆管癌细胞QBC939凋亡发生率约50％。真核表达质粒TRAIL体外转染肝癌细胞后对肝癌细胞的生长无显著性的抑制作用。体内直接瘤体注射pIRES-EGFP-TRAIL可有效的导入TRAIL基因并获得高表达，但对裸鼠肝癌无明显抑制作用。结论 肝细胞癌对TRAIL诱导的凋亡有耐药现象，提示HCC中存在抑制TRAIL诱导凋亡的因素，单一的TRAIL疗HCC疗效有限。     

TRAIL及其受体与HCC治疗的研究进展

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是肿瘤坏死因子家族的新型凋亡分子,能够与其受体(TRAILR)作用选择性的诱导细胞凋亡,成为肝细胞肝癌(HCC)治疗研究的热点。但是近几年来研究发现TRAIL治疗对正常肝细胞有一定的毒副作用且存在耐药性。如果能够克服这些难题,TRAIL有望成为治疗HCC的一线药物。研究发现TRAIL联合化学药物、蛋白激酶抑制剂,或构建含TRAIL基因的载体等方法能够避免TRAIL对正常肝脏的毒副作用及逆转耐受。本文就上述治疗方法的研究进展做一综述。     

蛋白酶体抑制剂和肿瘤相关坏死因子凋亡诱导配体协同诱导肝癌细胞凋亡的机制

肿瘤相关坏死因子凋亡诱导配体（TRAIL）是高选择性的化疗药物，然而并非所有肿瘤细胞对TRAIL均表现出显著敏感性。本研究旨在探讨TRAIL诱导肝癌细胞凋亡中存在的抵抗机制，及其与蛋白酶体抑制剂的协同作用。     

靶向survivin的siRNA联合凋亡相关配体对肝癌细胞的影响

目的探讨靶向survivin的siRNA联合肿瘤坏死因子诱导凋亡相关配体(tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)对肝癌细胞增殖与凋亡的影响。方法构建靶向survivin基因的siRNA真核表达载体,观察可溶性TRAIL对肝癌细胞增殖与凋亡的影响。结果采用RT-PCR检测显示,siRNA在mRNA水平抑制survivin基因表达为73％。MTT法检测到可溶性TRAIL对HepG2、HepG2／Silence(-)细胞增殖无明显的抑制作用(P>0．05),通过抑制survivin表达,可使HepG2／Silence(+)细胞的12 h存活率明显降低,48 h降至最低[HepG2／Silence(+)0．518±0．017,对照组0．741±0．005,P<0．01]。荧光显微镜检测HepG2／Silence(+)细胞12 h、24 h、48 h的细胞凋亡率分别为:11．85％±0．72％、28．97％±0．43％、41．80％±0．90％,与对照组相比差异有统计学意义(F=22．37,P<0．05)。结论靶向survivin的siRNA在抑制肝癌细胞中survivin表达的同时可增强TRAIL作用的敏感性。     

高转移潜能肝癌细胞株中凋亡相关蛋白的表达及意义

目的 探讨肝癌细胞转移潜能与凋亡敏感性之间的关系.方法 观察不同转移潜能的肝癌细胞株在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及依托泊苷(Etoposide)的作用下的凋亡发生率及Caspase3的活化,Western blot检测bcl-2及IAP家族蛋白在不同转移潜能肝癌细胞株中的表达.结果 TNF-α(10μg/L)作用后48 h,高转移潜能肝癌细胞株HCCLM3及转移能力最弱的肝癌细胞株SMMC-7721的凋亡率分别为(91.3±6.5)%及(58.8±2.3)%,MHCC97L细胞的凋亡率则位于两者之间(P≤0.01).Etoposide(250 μmol/L)作用后48 h,HCCLM3、MHCC97L及SMMC-772的凋亡发生率分别为(27.0±4.0)%、(34.6±3.8)%及(84.5±1.1)%(P≤0.01).3种细胞株中Caspase3的活性也有明显差异.bcl-2及IAP家族蛋白表达研究中发现XIAP的表达与肝癌细胞的转移潜能成梯度相关.结论 高转移潜能肝癌细胞株耐受多种凋亡刺激,可能与XIAP的过度表达相关.     

TRAIL联合喜树碱体外诱导肝癌细胞凋亡的研究

目的探讨喜树碱增加TRAIL诱导肝癌细胞HepG2和Hep3B凋亡能力的分子机制。方法应用流式细胞仪分析TRAIL单独或联合应用喜树碱对肝癌细胞系HepG2和Hep3B细胞凋亡的影响；Western blot检测HepG2和Hep3B细胞在处理前后凋亡信号传导蛋白caspase-8，caspase-3，caspase-9，DR4，DR5，DcRl，c—FLIP，RIP，cytc，Smac和Bid表达的变化。结果喜树碱能增强TRAIL诱导肝癌细胞凋亡的能力，两者联用具有明显的协同作用。喜树碱预先处理能下调c—FLIP及RIP的表达及增加cytc，Smac，Bid的表达，但对DR4，DR5，DcRl的表达无明显影响。结论TRAIL联合喜树碱可以诱导肝癌细胞凋亡；其机制是下调c—FLIP及RIP的表达，活化凋亡发生的死亡受体通路，上调Bid的表达激活线粒体通路。死亡受体的表达不参与这一变化过程。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体在人肝细胞肝癌的原发灶及其门脉癌栓中的表达及意义

目的 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)受体DR4、DR5、DcR1、DcR2在人肝细胞肝癌的原发灶及其门脉癌栓中的表达及意义.方法 采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法,检测20例人肝细胞肝癌的原发灶及其门脉癌栓和20例未发生转移的原发性肝癌组织中TRAIL受体mRNA的表达水平.结果 死亡受体DR4、DB5在无转移的肝癌组织分别为(3.59±0.87)、(1.98±0.54),伴有门脉癌栓的肝癌原发灶组织(分别设定为1)及其门脉癌栓组织中的表达量分别为(0.62±0.28)、(0.31±0.12),呈递减趋势(P<0.05).诱捕受体DcR1、DcR2在伴有门脉癌栓的肝癌组织中的表达量分别为(0.29±0.04)、(0.54±0.08),显著低于无转移的肝癌组织(分别设定为1)(P<0.05).而在伴发PVTT的HCC中,门脉癌栓组织与其肝癌原发灶组织中DcR的表达量差异无统计学意义(P>0.05).DR的表达水平与肿瘤的分化程度(r=0.461,P<0.05)及门静脉浸润情况(r=0.587,P<0.05)呈显著正相关.DR的表达水平与肿瘤的大小及血清甲胎蛋白(AFP)浓度无明显相关(P>0.05).结论 TRAIL死亡受体DR的表达下调可能与肝癌的恶性进展密切相关.TRAIL 途径诱导凋亡在肝癌转移过程中可能起到重要的作用.     

Genistein调节肝癌细胞PTEN和survivin蛋白表达的实验研究

目的探讨genistein对肝癌HepG2细胞株PTEN和survivin蛋白表达的影响及在诱导凋亡中的作用。方法以肝癌HepG2细胞培养72 h为对照组,实验各组以60μmol／L的genistein作用于HepG2细胞不同时间后,应用同位素试剂盒检测细胞IP3含量,Western-blotting分析细胞PTEN和survivin蛋白表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果对照组IP3含量为(29．2±0．6)pmol／106 cells,PTEN蛋白与内参Actin蛋白灰度和面积之积的比值V-PTEN／V-actin为0．12±0．001, survivin蛋白与内参actin蛋白灰度和面积之积的比值V-survivin／V-actin为0．63±0．06,细胞凋亡率为2．6％±0．1％。Genistein作用于肝癌Hep G2细胞12 h、24 h、48 h、72 h后IP3分别为(12．0±1．4) pmol／106cells、(7．5±0．8)pmol／106cells、(5．6±0．5)pmol／106cells、(3．3±0．6)pmol／106cells; V-PTEN／V-actin分别为13．13±0．20、19．17±1．09、28．51±2．18、41．12±3．80;V-survivin／V-actin分别为0．36±0．13、0．33±0．03、0．23±0．04、0．18±0．04;细胞凋亡率分别为2．7％±0．2％、7．4％±0．5％、20．5％±2．0％、30．7％±1．6％。与对照组相比,genistein作用于肝癌Hep G2细胞12 h后各时相IP3和survivin蛋白显著降低,24 h后各时相细胞凋亡率显著增高。结论Genistein能减少IP3生成,上调PTEN基因表达,下调survivin基因表达,诱导肝癌细胞凋亡。     

DHA对人肝癌细胞增殖与凋亡的影响及其机制的研究

目的：探讨二十二碳六烯酸（DHA）对人肝癌细胞株Bel-7402增殖和凋亡的影响及其机制。方法：用不同浓度的DHA（0,25,50,100,200 μmol/L）分别作用人肝癌Bel-7402细胞24,48,72 h后,用MTT法检测细胞的增殖情况、Western blot检测Bcl-2和Bax蛋白的表达,并分别用流式细胞仪、real-time PCR和caspase-3活性检测试剂盒检测上述梯度浓度的DHA作用 Bel-7402细胞48 h后的凋亡情况、Bim基因表达和caspase-3活性。结果：不同浓度、不同时间DHA作用后,Bel-7402细胞增殖明显抑制,呈浓度和时间依赖性（均P<0.05）;细胞Bax蛋白表达增加、Bcl-2蛋白表达降低,呈明显浓度依赖性（均P<0.05）,但无明显时间依赖性（均P>0.05）。不同浓度DHA作用48 h后,Bel-7402细胞凋亡率、Bim基因表达和caspase-3的活性均明显增加,且均呈浓度依赖性（均P<0.05）。结论：DHA可抑制人肝癌Bel-7402细胞的增殖并诱导细胞凋亡,其机制可能与激活线粒体凋亡通路有关。     

AG1024对肝癌细胞系增殖与凋亡的影响

目的 探讨胰岛素样生长因子Ⅰ型受体(IGF-IR)酪氨酸激酶阻断剂AG1024(3-溴-5-叔丁基-4-羟基苯叉苹果酸腈)对人肝癌癌细胞的增殖抑制作用和凋亡诱导作用.方法 采用MTY、流式细胞术、细胞侵袭实验、RT-PCR和Western blot等方法检测在不同浓度(0～40 μmol/L)的AG1024作用下,人肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721的细胞形态学及分子生物学特性的改变.结果 MTT检测显示,AG1024剂量依赖性地抑制肝癌细胞的增殖.流式细胞术提示,AG1024明显促进肝癌细胞的凋亡.Transwell小室侵袭实验显示,AG1024能明显抑制肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721的侵袭能力,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).RT-PCR结果显示,肝癌细胞中IGF-IR呈高表达,不同浓度AG1024作用后,剂量依赖性地增加细胞色素C的表达.Western blotting结果显示,AG1024降低胞外途径信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)的磷酸化水平,下调procaspase-3的表达,而总ERK保持不变.结论 AG1024阻断胰岛素样生长因子1型受体,从而阻断其下游的信号传导途径,抑制肝癌细胞的增生,诱导凋亡.     

黑色素瘤分化相关基因-7和白介素-24选择性杀伤肝癌细胞和诱导增殖阻滞的体外研究

目的探讨黑色素瘤分化相关基因-7／白介素-24基因（mda-7／IL-24）对不同种类肝癌细胞的选择性杀伤作用。方法将携带人mda-7／IL-24基因的复制缺陷型腺病毒（Ad．mda-7）感染人正常肝细胞和各种肝癌细胞,通过逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和酶联免疫吸附（ELISA）实验观察mda-7／IL-24基因的表达,MTT法观察肝癌细胞的生长抑制,Hoeehst染色及Annexin—V和PI双染后流式细胞仪检测细胞的凋亡情况及用流式细胞仪检测细胞周期。结果RT—PCR和ELISA提示Ad．mda-7能介导外源基因mda-7／IL-24在各种肝癌细胞株和正常肝细胞中高效表达。MTT实验结果提示mda-7／IL-24能明显抑制各种肝癌细胞的生长,Hoeehst染色和流式细胞仪检测提示mda-7／IL-24能选择性杀伤肝癌细胞,细胞周期分析提示mda-7／IL-24阻滞肝癌细胞在G2／M期,同时对正常的肝细胞没有促凋亡和增殖阻滞作用。结论mda-7／IL-24基因能选择性杀伤各种肝癌细胞,促进细胞增殖阻滞及诱导细胞凋亡。     

诱骗受体3在肝细胞癌组织中的表达及其与凋亡的关系

目的 探讨原发性肝细胞癌(HCC)中诱骗受体3(DcR3)表达和意义及与细胞凋亡的关系.方法 应用免疫组织化学Envision二步法和TUNEL技术对62例HCC组织和配对癌旁组织、15例正常肝组织进行DcR3和细胞凋亡检测.结果 44例HCC中DcR3表达、阳性表达率为70.97%,配对癌旁组织为20.96%,正常肝组织无阳性表达,HCC中DcR3表达明显高于其他组(P<0.01),门静脉癌栓形成组中DcR3表达高于阴性组(P<0.01).HCC、癌旁和正常肝组织凋亡指数(AI)分别为3.52±1.65、6.08±1.71和6.87±1.78,HCC与后两者比较差异有统计学意义(P<0.01).DcR3阳性表达组中AI明显低于阴性组(P<0.01).结论 DcR3在HCC呈稳定高表达,与癌细胞凋亡相关,可能参与HCC的发生和影响肿瘤的预后.