造血干细胞基因治疗甲状旁腺功能低下症的实验研究

目的　探讨造血干细胞基因治疗甲状旁腺功能低下症 (HPT)的实验效果。方法　构建重组甲状旁腺素 (PTH)基因的小鼠干细胞病毒 (MSCV)重组质粒 ,转染PA31 7包装细胞 ,G41 8筛选阳性克隆 ,获得的重组病毒液感染造血干细胞 ,静脉注入HPT小鼠血中 ,检测各组小鼠症状改善情况、血PTH及血钙变化情况。结果　获得滴度为 2× 1 0 7CFU(集落形成单位 ) /ml的分泌人PTH的浓缩病毒悬液 ,1× 1 0 6 个细胞培养 48h时PTH的分泌量为 1 5ng。经聚合酶链反应 (PCR)扩增未检测到有野生型病毒存在 ,可以安全应用。感染造血干细胞输注后 ,实验组动物未再出现HPT临床表现 ,而且血钙及血PTH均可长期保持在接近正常值范围内 ,较单纯注射浓缩病毒悬液具有更好的疗效。结论　获得MSCV PTH重组质粒及高滴度的分泌人PTH的浓缩病毒悬液。整合有PTH基因的造血干细胞输注后达到较长期治愈小鼠HPT ,为进一步HPT的临床基因治疗提供了可靠依据。     

转基因造血干细胞移植治疗小鼠甲状旁腺功能低下症的研究

目的　探讨输注整合有甲状旁腺素(PTH)基因的造血干细胞对甲状旁腺功能低下症的治疗效果。方法　将以pcDNA 3.1 PTH 为模板扩增出的PTH 基因插入到逆转录病毒载体MSCV中,得到含PTH基因的重组质粒,并转染PA317 包装细胞,以抗生素Geneticin筛选阳性克隆,获得重组有PTH基因的浓缩病毒悬液,以其感染人脐血造血干细胞,然后注入甲状旁腺功能低下症模型小鼠血中,术后观察小鼠症状的改善情况、血PTH及血钙浓度变化情况。结果　所获得的重组有PTH基因的浓缩病毒悬液,其病毒滴度为2×107 CFU/ml,PTH的分泌量为15 ng/48 h(106个细胞),未检测到有野生型病毒存在。实验组小鼠接受转染有PTH基因的血干细胞后,症状改善,血PTH及血钙浓度逐渐上升,并维持于接近正常水平;仅接受重组有PTH基因的浓缩病毒悬液的小鼠,短期内血PTH及血钙浓度明显升高,以后则呈缓慢下降趋势,并逐渐出现甲状旁腺功能低下症的表现;只接受造血干细胞移植的小鼠术后20 d左右全部死亡。结论　甲状旁腺功能低下症小鼠接受整合有PTH基因的造血干细胞静脉输注可获得较长期的治疗效果。     

胚胎干细胞转基因治疗甲状旁腺功能低下症

目的　探讨小鼠胚胎干细胞 (TC 1)转基因治疗甲状旁腺功能低下症 (HPT)。方法包装出重组人甲状旁腺素 (PTH )基因的小鼠干细胞病毒 (MSCV) ,以lml重组病毒液加入 poly brene(终浓度 8mg/L)感染TC 1细胞 ,检测基因转导效率 ,PTH分泌情况 ;以及每 1× 10 5个 /mlTC 1细胞注入模型鼠体内各组小鼠血PTH和血钙变化情况。结果　获得滴度为 2× 10 7集落形成单位 (CFU) /ml的重组逆转录病毒 ,其感染TC 1的效率为 70 % ,每 10 6 未分化TC 1每 48h分泌PTH10ng。重组有PTH基因的TC 1细胞注入模型鼠体内后 ,在观察期间实验组动物血PTH和血钙均保持在接近正常值范围内。结论　MSCV介导外源PTH基因可高效转导TC 1并持续分泌PTH ;内环境并不是决定TC 1分化的唯一因素。经基因转导的TC 1可较好的改善模型鼠的症状 ,是未来细胞移植的一种潜在来源。     

甲状旁腺素通过磷脂酶C非依赖途径激活蛋白激酶C

目的利用基于荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术的检测PKC激活或PKC-delta激活的报告分子来确定PTH是否可以通过PLC非依赖途径激活PKC和PKC-delta。方法将表达PKC激活报告分子(CKAR)的质粒和表达PKC-delta激活报告分子的质粒转染HEK293细胞,培养72h后通过共聚焦显微镜检测FRET的改变,并以此判断佛波酯(TPA)是否激活PKC和PKC-delta。将表达甲状旁腺素1型受体(PTHR1)的质粒与CKAR质粒或PKC-delta质粒共转染HEK293细胞,培养72h后通过共聚焦显微镜检测FRET的改变,并判断PTH(1-34)、G1R19(1-34)和0.1%的三氟乙酸(TFA)对PKC和PKC-delta的作用。结果在转染CKAR质粒或PKC-delta质粒的HEK293细胞,TPA均使青色荧光与黄色荧光的强度之比(C/Y)增加。在共转染PTH1R质粒与CKAR质粒或PKC-delta质粒的HEK293细胞,PTH(1-34)和G1R19(1-34)均增加了C/Y的值,而0.1%TFA未引起C/Y的改变。结论 PTH与PTHR1结合后通过PLC非依赖途径激活PKC/PKC-delta。     

小鼠胚胎干细胞转基因治疗甲状旁腺功能低下症的实验研究

目的　探讨小鼠胚胎干细胞 (TC 1)转基因治疗甲状旁腺功能低下症 (HPT)。方法包装出重组人甲状旁腺素 (PTH )基因的小鼠干细胞病毒 (MSCV) ,以其感染小鼠ESCs ,检测基因转导效率 ,PTH分泌情况 ;观察体内外分化情况 ,以及注入模型鼠体内各组小鼠血PTH和血钙变化情况。结果　获得滴度为 2× 10 7集落形成单位 (CFU ) /ml的重组逆转录病毒 ,经聚合酶链反应(PCR)扩增未检测到有野生型病毒存在 ,可以安全应用。感染TC 1的效率为 70 % ,每 10 6未分化TC 1每 48h分泌PTH约 10ng。重组有PTH基因的TC 1在体内外均可分化出三胚层组织 ,注入模型鼠体内 ,在观察期间实验组动物未再出现甲旁低表现 ,而且血PTH和血钙均保持在接近正常值范围内。结论　MSCV介导外源PTH基因可高效转导TC 1并持续分泌PTH ;体内外分化实验证明TC 1具有全能性 ,而且内环境并不是决定TC 1分化的唯一因素。经基因转导的TC 1可较好的改善模型鼠的症状 ,是未来细胞移植的一种潜在来源。     

��״���ٹ��ܵ���֢������������������ϵpCKM-mPTH�����Ĺ�������

目的 研究构建重组表达体系pCKM-mPTH质粒，寻找甲状旁腺功能低下症的基因治疗途径。方法 采用重叠聚合酶链反应(PCR)法、巢式PCR法及粘端连接法构建pCKM-mPTH质粒，以脂质体转染骨骼肌细胞，用β-actin半定量和放免法分别测定其在细胞内外的表达。结果 嵌合基因pCKM-mPTH质粒测序完全符合已知核苷酸序列，并完成定点突变，转染骨骼肌细胞后，β-actin半定量法测得mPm在细胞内成功高效表达，放免法测得24h克隆细胞培养液中甲状旁腺激素蛋白的含量为26．37ng／L。结论 成功构建了SD(Sprague Dew-ley)大鼠重组基因表达体系pCKM-mPTH质粒，并证实其在骨骼肌细胞中有高效表达。     

原位保留甲状旁腺血供及甲状旁腺自体移植术

目的 介绍甲状腺肿瘤手术中保护甲状旁腺血供及甲状旁腺自体移植的方法及疗效.方法 46例全甲状腺切除或近全切除手术中,血管化甲状旁腺保留24例,单纯自体甲状旁腺移植5例,1～2枚甲状旁腺血管化保留同时其余甲状旁腺Ⅰ期自体移植17例.结果 应用此法行全甲状腺切除或近全切除患者中,有2例原位血管化保留甲状旁腺及3例血管化保留+自体甲状旁腺移植患者术后48～72 h内出现一过性低血钙,予以补钙后3 d左右恢复正常.2例单纯甲状旁腺自体移植患者术后出现低血钙,服用钙尔奇D/罗盖全4周～8周后复查血钙维持在正常水平.术后出现永久性甲状旁腺功能低下的仅1例(2.2%).结论 血管化甲状旁腺保留及自体甲状旁腺移植可大大降低全甲状腺切除或近全切除手术导致甲状旁腺功能低下的发生率.     

45例甲状旁腺肿瘤临床分析

目的:探讨甲状旁腺肿瘤的诊断、术前定位、外科治疗及预后.方法:对2001年-2012年间收治的45例甲状旁腺肿瘤病例的临床资料进行回顾性分析.结果:全组45例甲状旁腺肿瘤术前均通过B超和或CT、99mTc-MIBI检查得以定位,阳性率分别为86.7％,93.8％,100％.45例均行手术治疗,均为单发肿瘤,其中左上7例,左下23例,右上4例,右下11例.术后病理证实39例为腺瘤,1例腺癌和5例囊肿.囊肿均为非功能性,腺瘤、腺癌均伴原发性甲状旁腺功能亢进(PHPT).术前PHPT患者均有不同程度的血钙升高和血磷降低,其中24例甲状旁腺激素(PTH)升高;术后血钙明显下降,血磷明显上升(均P＜0.05),1周至3个月恢复正常,PTH明显降低(P＜0.05),22例术后1～5 d即正常,2例1年后正常.术中PTH(IOTPH)判断腺瘤成功切除率100％.40例获随访3个月至10年,均无复发和病灶遗漏.结论:甲状旁腺肿瘤起病缓慢,临床表现复杂多样.血钙、血磷以及血PTH的检测有助于PHPT的诊断;B超可作为甲状旁腺肿瘤的术前定位的首选检查,联合CT和99mTc-MIBI核素扫描能提高定位率;手术治疗为甲状旁腺肿瘤的首选治疗方法,效果良好.     

甲状腺全切除术后甲状旁腺功能减退的相关危险因素分析

目的探讨甲状腺全切除术后永久性甲状旁腺功能减退的相关危险因素, 分析术后24 h甲状旁腺素(PTH)值与永久性甲状旁腺功能减退的关系。方法回顾性分析2017年1月1日至2019年12月31日在北京大学肿瘤医院行甲状腺全切除术889例患者的临床资料, 用ROC曲线分析术后24 h PTH值提示可能发生永久性甲状旁腺功能减退的临界值, 并以此值为分界进行分组分析, 探讨术后24 h PTH值与永久性甲状旁腺功能减退的关系。用χ2检验及Logistic回归模型进行单因素及多因素分析。结果本组患者术后暂时性和永久性甲状旁腺功能减退的发生率分别为33.3%和4.0%。ROC曲线分析发现, 以5.84 pg/ml为临界值, 术后24 h PTH值提示永久性甲状旁腺功能减退的敏感性为100%, 特异性为72%, 阳性预测值为22.5%。多因素分析显示甲状旁腺意外切除、甲状旁腺自体移植及术后24 h PTH≤5.84 pg/ml是永久性甲状旁腺功能减退的独立危险因素(χ2=10.900P=0.001;χ2=4.415P=0.044;χ2=13.576P=0.000)。术后24 h PTH值越低, 永久...     

甲状旁腺激素对人近曲小管上皮细胞转分化及分泌结缔组织生长因子的影响

目的 探讨甲状旁腺激素（PTH）对人近曲小管上皮细胞系HK-2细胞分泌结缔组织生长因子（CTGF）及细胞转分化的影响。 方法 应用实时定量PCR和Western印迹观察PTH诱导HK-2细胞CTGF mRNA和蛋白表达情况，从转录水平探讨PTH对CTGF基因启动子活性的调控作用。应用免疫荧光技术检测PTH作用下HK-2细胞中α平滑肌肌动蛋白 （α-SMA）的表达。 结果 HK-2细胞有基础水平的CTGF mRNA和蛋白表达，PTH刺激后其表达量显著增加。PTH最佳刺激浓度是10－10 mol/L，最佳刺激时间是72 h。10－10 mol/L PTH干预HK-2细胞12 h后，荧光素酶活性较对照组显著升高（1.888±0.078比0.989±0.030，P ＜ 0.01）；光镜下可见细胞由立方形铺路石样转变为梭形，随作用时间延长转分化现象更显著。PTH刺激HK-2细胞12 h后，免疫荧光检测可见细胞质中有α-SMA表达；PTH刺激24 h后，α-SMA表达明显增多，与CTGF mRNA和蛋白表达的时间效应一致。 结论 PTH可上调HK-2细胞CTGF表达，并具有促进HK-2细胞转分化的作用。     

HyTK基因逆转录病毒重组质粒的构建及其在PA317细胞中的高表

目的:为开展逆转录病毒介导的HyTK基因治疗恶性肿瘤奠定实验基础。方法:利用逆转录病毒载体与潮霉素磷酸转移酶和单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶的融合基因(HyTK)连接构建重组质粒pL(HyTK)SN,应用新一代的非脂质体基因转导系统FuGENETM6将构建的pL(HyTK)SN导入Ψ2单嗜性包装细胞并获得瞬间表达,继而再转染PA317双嗜性细胞。结果:获得高滴度重组病毒,上清逆转录病毒滴度为5.4×106cfu/ml。结论:所构建的HyTK基因可用于治疗恶性肿瘤。     

肝细胞肝癌中p27KIP1基因的表达及意义

目的 探讨p27^KIP1与原发性肝细胞癌(HCC)发生、发展的关系。方法 应用SASC(链霉 素亲和康—生物康复合物)免疫组化染色和mRNA原位杂交方法，对52例肝细胞肝癌中p27^KIP1蛋白和mRNA的表达进行了检测。结果 p27^KIP1基因的表达主要位于肝或肝癌细胞的细胞核中，呈纫颗粒状分布。p27^KIP1蛋白在癌旁肝组织中的阳性细胞指数为(10．7士7．6)％，明显高于癌组织的(1．5士o．9)％，并且p27^KIP1蛋白表达的阳性细胞指数与HCC细胞的分化程度呈正相关。p27^KIP1mRNA杂交阳性物呈蓝色纫颗粒状，主要位于肝或肝癌细胞的细胞核和细胞浆中，mRNA阳性的细胞分布更广泛，但在癌旁肝组织和不同分化程度的HCC组织中，p27^KIP1mRNA的阳性细胞指数差异无显著性意义。结论p27^KIP1蛋白与HCC的发生及细胞分级有关。     

原发性肝癌PTEN和p27表达的相关研究

目的：研究PTEN和p27两种抑癌基因在原发性肝癌中的表达和两者间的关系。方法：应用免疫组化方法，对43例原发性肝癌患者、21例份肝硬化患者和16例正常对照的正常肝脏组织进行PTEN和p27的免疫组化研究。结果：原发性肝癌组PTEN的阳性表达率为41．9％（18／43），比肝硬化组和正常对照组明显下降：原发性肝癌组p27的阳性表达率为86．0％，比肝硬化组和正常对照组显著升高。PTEN的表达与肿瘤数目、分化高低、有无血管侵犯有关；p27的表达与原发性肝癌的大小、肿瘤数目、分化高低、有无血管侵犯有关。PTEN蛋白和p27蛋白在原发性肝癌中无相关关系。结论：PTEN作为抑癌基顺在原发性肝癌中发挥作用，p27有其组织特异性，PTEN和p27表达在原发性肝癌中无相关性。     

携带融合基因CTLA4-Ig重组腺病毒载体的构建及表达

目的　为进行基因转移阻断T细胞共刺激通路诱导移植免疫耐受的研究 ,构建携带融合基因CTLA4 Ig的重组腺病毒载体。方法　构建含人CTLA4 Ig的重组腺病毒载体质粒pShuttle Tracker CMV CTLA4 Ig ,与腺病毒骨架质粒 pAdEasy 1 △E1、△E3共转化大肠杆菌BJ5 183 ,经细菌内同源重组 ,获得重组腺病毒质粒pAd Tracker CTLA4 Ig ,转染 2 93细胞 ,制备携带CTLA4 Ig的重组腺病毒 ,体外感染L O2细胞 72h后ELISA检测其外分泌性表达。 结果　获得携带CTLA4 Ig的重组腺病毒 ,滴度为 6× 10 1 3 PFU L ;在其感染的L O2细胞培养上清中能检测到可溶性重组蛋白CTLA4 Ig的表达 (P N =4.6 ,阳性 )。结论　制备的重组腺病毒在体外能有效感染L O2细胞 ,受感染细胞能表达、分泌可溶性的融合蛋白CTLA4 Ig ;为进行体内移植免疫耐受的基因治疗研究奠定基础。     

人生长激素基因的克隆、高效表达及纯化

目的 研究人生长激素(hGH)基因在原核中的高效表达、纯化及鉴定。方法 设计带双酶切位点引物,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法获得hGH cDNA片段,并亚克隆入pUC19质粒中进行 DNA序列测定。将 hGH cDNA片段克隆入原核表达载体 pBV220中进行表达。表达产物经 7mol/L 盐酸胍裂解变性、复性、层析等一系列纯化研究,纯化产物经SDS-PAGE电泳,高压液相色谱法(HPLC)纯度分析及活性测定,并通过N末端氨基酸序列测定鉴定表达产物。结果 RT-PCR扩增所得片段大小与预期值一致。pBV220-hGH表达产物经SDS-PAGE电泳显示,分子量为 22×10~3与预计结果相符。rhGH表达量占菌体总蛋白量的 40％。表达产物纯化后,纯度达 97％以上,比活性大于 3.0 IU/mg。纯化产物经 N末端 15个氨基酸测定验证,为重组人生长激素。结论 成功构建了 pBV220-hGH原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达,表达产物经纯化得到纯度≥97％的 rhGH,比活性大于 3.0 IU/mg。该研究为 rhGH的中试生产奠定了基础。     

TRANSFER OF PLATELET-DERIVED GROWTH FACTOR-BB GENE BY GENE GUN INCREASES CONTRACTION OF COLLAGEN LATTICE BY FIBROBLASTS IN DIABETIC AND NON-DIABETIC HUMAN SKIN

We have used an in vitro model of wound contraction, the fibroblast-populated collagen lattice, to examine the effect of platelet-derived growth factor BB (PDGF-BB) and PDGF-BB gene transfer by gene gun on the contraction of lattices composed of either diabetic or non-diabetic human fibroblasts. The area of collagen lattice and DNA synthesis were measured in 12 specimens. There were significant increases in lattice contraction with increasing doses of PDGF-BB and fibroblasts transfected with the PDGF-BB gene compared with control (p < 0.01). DNA synthesis of the non-diabetic and diabetic fibroblast lattices showed significantly increased incorporation of tritiated thymidine with increasing doses of PDGF-BB and fibroblasts transfected with the PDGF-BB compared with controls (p < 0.05). The effect of PDGFBB gene transfer on diabetic and non-diabetic fibroblasts was similar to that of 20 ng/ml or less of PDGF-BB.     

CD基因联合GM-CSF基因对胰腺癌治疗作用的实验研究

目的：观察自杀基因CD联合GM—CSF基因的抗胰腺癌作用。方法：应用逆转录病毒方法转导CD和GM—CSF基因。皮下接种胰腺癌细胞TD2，肿瘤局部注射重组表达的pVITR02-CD-GM—CSF，然后连续10d给予5-氟胞嘧啶（5-Fc）300mg／kg治疗，观察肿瘤的生长情况。结果：CD／5-Fc联合GM—CSF治疗后，小鼠肿瘤体积显著缩小，存活期明显延长，与对照组以及GM—CSF组和CD／5-Fc组比较差异有统计学意义（P〈0．05，P〈0．01），且肿瘤瘤体内CD8^＋细胞浸润增加，MHC—Ⅰ和B7—1表达明显增加。结论：CD基因联合细胞因子基因GM—CSF可增强CD的抗肿瘤作用，其疗效要好于GM—CSF或CD基因单独治疗。     

肠粘连引起肠梗阻的基因水平研究

目的通过分析基因层面的差异表达,以探讨与肠梗阻相关的发病基因和治疗靶基因。方法在基因表达公共数据库（geneexpressionomnibus,GEO）中收集到10个样品的基因表达数据,其中小鼠粘连小肠组织术后1、3、7、和14d时间点的基因芯片数据共8个,小鼠正常小肠组织芯片数据2个,应用基因本体论（geneontology,GO）富集分析和微阵列显著性分析（significanceanalysisofmicroarray,SAM）方法,分析10个样品的基因表达情况,并对差异表达的基因进行功能注释和生物学分析。结果肠粘连的发生伴随着大量应答刺激的基因表达上调,且这些基因产物都分布在细胞膜上。分析术后不同时间点的基因表达情况发现,Hmgcs2基因的表达上调出现在术后3～14d,融助5基因的表达上调出现在术后14d。结论粘连的发生可能与应答刺激的基因及其分布于细胞膜上的基因产物有关,Hmgcs2和s抚幼5基因可能与因粘连而导致的其他并发疾病的发生有关。这为发现肠梗阻潜在的治疗靶点提供了依据。     

增生性瘢痕相关基因的筛选

目的　利用基因芯片技术寻找增生性瘢痕形成过程中的相关基因 ,并发现相关基因间的相互关系 ,探讨增生性瘢痕的机理。方法　选择 6例标本 ,3例增生性瘢痕与 3例正常皮肤 ,分成 3组 ,提取各个标本的总DNA ,制成荧光标记的cDNA探针 ,与含 4 0 0 0个人类靶基因的芯片 ( 15 0 0个为已知基因 ,2 5 0 0个为未报道或未知功能的基因 )杂交 ,经扫描、生物信息学分析比较两种组织间的差异表达。结果　增生性瘢痕与正常皮肤的差异表达基因在 3组间仅出现 1次的有 3 96个、重复 2次出现的有 186～ 2 4 2个、共同出现的有 116个 ,其中上调 10 8个、下调 8个 ,涉及 13大类基因 ,包括抑癌与原癌基因、细胞凋亡、细胞骨架与运动蛋白、细胞周期类蛋白等 ,有些为已知基因 ,有些仍未知其功能。结论　基因芯片扫描对研究增生性瘢痕有效可靠 ,发现多种基因参与了增生性瘢痕的形成过程