大鼠胰腺发育过程中胰岛素释放功能完善的研究

目的: 明确大鼠胰腺发育不同时期胰岛素合成及释放相关基因的表达差异,探讨胰岛素分泌功能完善的过程? 方法:分离并提取SD大鼠胚胎发育12.5天(E12.5)?E15.5?E18.5?新生?出生后21天及成年大鼠胰腺组织,利用Affymetrix公司的高密度寡核苷酸芯片检测大鼠发育各阶段胰腺组织基因表达谱并分析胰岛素合成及释放相关基因的特异及差异表达情况?分别进行正常新生鼠?成年鼠血糖水平及正常新生第1?3?7?10?12天大鼠腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)?采用ELISA法测定新生鼠和成年鼠血中胰岛素浓度?新生大鼠胰岛细胞原代培养观察新生鼠胰岛细胞的形态?结果:在胰岛素合成及释放相关基因中,胰岛素基因及其特异性转录因子如PDX-1在大鼠E12.5~E15.5时即开始有表达,以后胰岛素基因持续存在且表达增多;胰岛素胞吐过程中的关键基因Syntaxin-1a?Vamp-2?Rab-3a?Munc13-1等从E15.5开始出现,以后表达量亦增多;而葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)相关基因中,葡萄糖转运体-2(Glut2)在胚胎早期开始表达,葡萄糖激酶(GCK)在胚胎中晚期才表达?自E18.5即检测到大鼠血中胰岛素的存在,随着胚胎的发育,血胰岛素浓度逐渐升高?新生大鼠对葡萄糖负荷不能耐受,出现IPGTT异常,出生1周以后IPGTT才逐渐趋于正常?新生鼠的胰岛形态与成年鼠相似,但体积相对较小,透亮度稍差?结论:大鼠胚胎胰腺发育早中期即已具备胰岛素合成及分泌的能力,但新生鼠刚出生时,其胰岛功能仍尚未完善,出生以后才逐渐对葡萄糖负荷有良好的反应性?     

Paxillin在大鼠胰腺不同发育阶段的表达

目的:探讨与胰岛形成和功能完善相关的基因在大鼠胰腺发育不同阶段的表达趋势.方法:采用高密度寡核苷酸芯片对孕12.5 d(E12.5),E15.5,E18.5, 新生和成年大鼠胰腺进行基因转录水平分析,并用RT-PCR验证桩蛋白(pxn)和actopaxin在不同发育时期的表达情况.结果:与细胞迁移、聚集黏附相关的基因77.8%在胚胎18.5 d高表达,22.2%在新生期高表达;整合素和激酶(ILK)在胚胎18.5 d表达量最高,pxn和actopaxin在胚胎15.5 d表达量达到高峰;成熟胰腺特异性基因多从胚胎18.5 d开始出现明显高表达,调节胰腺细胞分化的相关转录因子表达量多从胚胎18.5 d开始下降.结论:Pxn在胚胎发育中后期的高表达可能与胰岛形成及功能完善有关.     

大鼠胰腺发育功能相关基因表达谱的分析

目的研究大鼠胰腺胚胎发育不同阶段的基因表达谱,对比其功能相关基因随大鼠胰腺发育的变化。方法采用显微分离及提取技术获得胚胎发育不同阶段胰腺组织并提取RNA,采用高密度寡核苷酸芯片(Affemetrix芯片)对胚胎发育至第12.5天、15.5天、18.5天胚胎胰腺和成年胰腺进行基因转录水平分析,用生物信息学方法分析具体基因的表达情况。结果胰腺的生物学功能尤其β细胞功能相关基因insulin RNA、amylopsin RNA、GLUT-2RNA等在胚胎第15.5及18.5天显著高表达。结论胚胎第15.5～18.5天直至出生是胰腺功能完善和成熟的阶段,这个时期以细胞功能成熟为主。     

钾通道KCNQ1在大鼠胰腺发育过程中的表达

目的分析钾通道KCNQ1在不同发育阶段大鼠胰腺以及成年大鼠胰岛中的表达情况,为探悉其在胰腺B细胞发育及功能中可能的作用提供实验依据。方法采用高密度寡核苷酸芯片对胚胎第12.5天(E12.5)、E15.5、E18.5、新生和成年大鼠胰腺进行基因转录水平分析,并用RT-PCR对KCNQ1通道亚基在上述5个时期大鼠胰腺以及成年大鼠胰岛中的表达进行验证和分析。结果与胰腺内分泌细胞分化、成熟有关的转录因子分别于E15.5、E18.5达到表达高峰;E18.5胰腺中B细胞功能成熟标志基因的表达显著增加,而KCNQ1钾离子通道的编码基因KCNQ1及KCNE1此时才出现表达。成年胰腺及胰岛中均具有多种KCNQ1通道亚基的表达。结论 KCNQ1通道的表达出现于胰腺发育后期内分泌细胞功能逐渐成熟阶段,在成年胰岛中亦具有较高表达水平,提示KCNQ1通道可能表达于成熟B细胞并参与其内分泌功能。     

大鼠胰腺发育中肝细胞因子受体编码基因的表达及蛋白定位

目的 研究肝细胞因子受体编码基因c-met在大鼠胰腺发育不同阶段的表达及其编码蛋白的细胞定位.方法 采用RT-PCR技术检测c-met基因在大鼠胰腺不同发育时期:孕15.5 d(E15.5)和孕18.5 d(E18.5)、生后14 d(P14)、生后21 d(P21)、新生及成年胰腺的表达;并用免疫组化技术检测该基因编码的蛋白c-MET在胰腺发育不同阶段的细胞定位.结果 c-met基因在E15.5、E18.5 d较成年特异性高表达,免疫组化结果显示该基因编码的蛋白c-MET在新生后的胰腺大量定位于胰岛细胞.结论 c-met可能在胰腺发育过程中起到调控作用,参与胰腺发育中新生后胰岛结构重塑过程.     

大鼠胰腺发育不同阶段肝细胞生长因子受体编码基因的表达

目的研究肝细胞生长因子受体编码基因c-met在大鼠胰腺发育不同阶段的表达。方法采用高密度寡核苷酸芯片对孕12.5 d（E12.5）、孕15.5 d和孕18.5 d、新生、成年胰腺进行基因转录水平分析,并用RT-PCR技术验证基因在大鼠胰腺不同发育时期的表达。结果c-met基因在E15.5、E18.5较成年特异性高表达。经RT-PCR验证,c-met基因表达趋势与芯片结果相符;与芯片c-met探针所用引物不同RT-PCR,结果却在各发育阶段呈现与芯片不同的表达趋势。结论提示c-met可能在胰腺发育过程中起到调控作用,参与胚胎胰腺发育中晚期细胞功能完善的信号传导过程。并且c-met在胰腺发育中发挥作用有可能存在不同转录本。     

大鼠胚胎发育后期胰腺中Mesothelin的表达

目的: 探讨大鼠胰腺胚胎发育后期胰岛形成及β细胞功能完善相关的基因表达调控. 方法:采用高密度寡核苷酸芯片(Affymetrix芯片)对孕15.5(E15.5)和E18.5胰腺进行基因转录水平分析并用RT-PCR验证基因在大鼠胰腺E12.5,E15.5,E18.5,初生和成年这五个不同发育时期的表达情况. 结果:在差异或特异表达的基因中与胰腺细胞分化相关的转录因子和信号分子表达均下调,而与胰岛结构形成及β细胞代谢功能完善相关的基因表达上调,其中细胞黏附分子Mesothelin是在E18.5特异表达的基因,RT-PCR亦显示Mesothelin在大鼠胰腺胚胎发育后期特异性高表达. 结论: Mesothelin可能对胰岛结构的形成和功能的完善及维持有重要作用.     

nesprin-1基因在小鼠心脏发育过程中的表达

目的检测小鼠心脏发育过程中nesprin-1基因mRNA和蛋白的表达及亚细胞定位。方法取小鼠胚胎12.5 d(embryo 12.5day,E12.5)、E14.5、E16.5、E18.5以及新生鼠、成年小鼠心脏,应用RT-PCR、Western blot、免疫荧光技术检测胚胎各时间点、新生鼠、成年鼠心脏nesprin-1基因mRNA和蛋白表达及细胞定位。结果在小鼠胚胎E12.5、E14.5、E16.5、E18.5以及新生鼠、成年小鼠心脏组织中,nesprin-1基因mRNA及蛋白均有表达,其表达量随着心脏的发育而逐渐增加,E16.5和E18.5表达最高,成年鼠表达最低。免疫荧光显示,nesprin-1的分布在各个时期均位于核被膜及核周间隙中。结论nesprin-1在小鼠心脏发育过程中表达呈动态变化,在心脏传导系统和心肌细胞发育成熟时期呈高表达,因此推测nesprin-1可能在心脏传导系统和心肌细胞的发育中有重要作用。     

Insulin/FoxO1/Pdx1/MafA基因在宫内发育迟缓大鼠胰腺发育中的表达

目的:探讨宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation,IUGR)大鼠在胚胎期和新生后Insulin/FoxO1/Pdx1/MafA基因的表达?方法:清洁级SD大鼠,雌雄鼠1∶3合笼交配,孕鼠按受孕顺序随机分为2组(IUGR组和对照组)?IUGR组自妊娠第1天至分娩给予正常对照组饲料进食量的半量;对照组妊娠全程任意摄取饲料;应用显微分离及提取技术取大鼠胚胎发育第14.5天?第19.5天及新生大鼠胰腺组织;采用HE染色,光镜观察胰腺不同发育时期形态学变化;使用RT-PCR技术检测胚胎发育第14.5天,第19.5天及新生大鼠胰腺Insulin/FoxO1/Pdx1/MafA基因的表达情况?结果:①与对照组大鼠相比,IUGR组胰腺在发育各期均有形态学上的改变,表现为组织松散,结构不清晰,胰岛数量及面积减少;②Insulin/FoxO1/Pdx1/MafA基因全程均有表达;③Insulin?MafA基因随胎龄的增长表达量增多,与对照组相比,IUGR组Insulin基因表达无明显差异(P > 0.05),而MafA基因表达较之减少(P < 0.05);④FoxO1?Pdx1基因均在胚胎早期表达较多,随胎龄的增长表达量下降,且与对照组相比,IUGR组Pdx1基因表达无明显差异(P > 0.05),FoxO1表达较对照组减少(P < 0.05)?结论:宫内发育迟缓对胰腺发育相关基因Insulin/FoxO1/Pdx1/MafA的表达有影响?     

AFP在不同发育时期大鼠胰腺的表达

目的:探讨甲胎蛋白(AFP)在大鼠胰腺发育不同阶段的表达情况.方法:采用免疫印迹和免疫组织化学方法检测AFP在不同发育时期大鼠胰腺中的表达.结果:免疫印迹结果显示在不同发育时期大鼠胰腺组织总蛋白中共检测到M,分别为72 000,60 000,48 000和37 000的4种AFP亚型,肘,72 000亚型是胚胎15.5d(E15.5)至新生(P0)各时期表达丰度最高者,其次是Mr 60 000亚型.在E15.5胰腺出现有3种大分子AFP亚型,E18.5胰腺4种亚型的丰度各自达到最高,出生后各有降低或消失,成年胰腺中只有Mr 60 000亚型的痕量表达.免疫组织化学检测结果显示可分泌蛋白AFP于E18.5至P0特异定位于胰腺间充质细胞.结论:AFP显著高表达于胰腺结构与功能趋于完善的关键发育时期,并特异表达于对胰腺发育具有重要调控作用的胰腺间充质细胞,提示AFP表达与胰腺发育可能具有内在联系.     

宫内发育迟缓胎鼠肝脏PGC-1和PEPCK基因的表达变化

目的宫内发育迟缓(IUGR)是胰岛素抵抗的独立危险因素,通过检测IUGR胎鼠肝脏糖代谢相关酶的表达,探讨IUGR个体发生胰岛素抵抗的分子机制。方法通过孕期蛋白质营养不良法建立大鼠IUGR模型,孕21天时剖宫产,测量胎鼠的体重和肝重,采用RT-PCR和蛋白印迹技术检测胎鼠肝脏PGC-1和PEPCK的mRNA及蛋白表达的变化。结果与正常对照相比,IUGR胎鼠肝脏PGC-1的mRNA和蛋白表达水平明显增高(P<0.01),肝中PEPCKmRNA的表达也明显增高(P<0.01)。结论IUGR胎鼠肝脏PGC-1表达增加诱导了糖异生关键酶PEPCK的表达,促进肝脏糖异生,这是IUGR鼠成年后发生胰岛素抵抗的原因之一。     

Munc13-1及RIM1在颞叶癫痫患者及戊四氮大鼠模型中的表达

目的 通过研究神经突触前膜胞内蛋白13-1(mammalian uncoordinated 13-1,Munc13-1)及神经元突触膜胞外分泌调节蛋白1(rab-interacting molecules 1,RIM1)在颞叶癫痫患者皮质和戊四氮点燃癫痫大鼠模型中的表达变化及两者的相关性,初步探讨Munc13-1及RIM1在癫痫发生中的作用及机制.方法 以颞叶癫痫患者病灶切除的皮质为癫痫组(n=18),以脑外伤患者切除的正常皮质为对照组(n=15);取40只SPF级雄性SD大鼠抽签均分成2组,其中一组连续腹腔注射戊四氮(3.5 mg/kg)21 d,出现至少连续3dⅣ级及以上癫痫发作的大鼠为癫痫组(n=15),另一组注射等量生理盐水为对照组(n=20);分别采用免疫组化及免疫荧光技术对Munc13-1进行定位和表达分析,Western blot检测Munc13-1和RIM1的表达变化,免疫共沉淀验证Munc13-1和RIM1的相互作用.结果 ①免疫荧光定位结果显示Munc13-1主要表达于神经元;②免疫组化及Western blot结果显示:在癫痫组中Munc13-1和RIM1的表达均升高,差异有统计学意义(P＜0.01);③免疫共沉淀示Munc13-1与RIM1之间存在相互作用的关系.结论 Munc13-1及RIM1在癫痫组中的表达均明显升高,且两者间存在相互作用的关系,提示Munc13-1可能通过结合RIM1参与癫痫的发生.     

Expression of GDF-5 during Limb Skeletal Development of Mice and the effect of GDF-5 on bone marrow mesenchymal stem cells in vitro

Objective： To investigate the expression of growth differentiation factor 5（GDF-5） during limb skeletal development of mice and the effect of GDF-5 on bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Methods ： The expression of GDF- 5 mRNA and protein in mouse fetal limb buds were detected in embryonic day 11.5-15.5 （E11.5-15.5） by RT-PCR and Western blotting respectively. Type Ⅱ collagen protein was examined with immunocytochemistry and the sulfate glycosaminoglycan was measured by Alcian blue. Results： During early stage of developmental skeletogenesis, the expression of GDF-5mRNA was constant and began with embryos E11.5, highlighted at embryos E12.5 and E13.5, subsequently dropped at embryos E14.5 and E15.5. There was very significant difference （P 〈 0.01） in average light density ratio of GDF-5/β-actin between E12.5-13.5 and the other three days. The expression of GDF-5 protein had a similar change with mRNA during limb skeletogenesis. Immunocytochemistry showed that GDF-5 could promote expression of Type Ⅱ collagen protein and histological staining of proteoglycan with Alcian blue revealed the deposition of typical cartilage extracellular matrix components. Conclusion： GDF-5 can enhance chondrogenic differentiation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells in vitro, which plays an important role in limb skeletal development and joint formation.     

宫内生长迟缓大鼠胰腺ghrelin和胰岛素表达变化

目的：探讨宫内生长迟缓大鼠胰岛ghrelin表达规律，阐明ghrelin是否参与宫内生长迟缓所致的胰岛素抵抗的进程。方法：建立宫内生长迟缓（Ⅰ组）和正常出生体重（N组）大鼠模型；测定血糖、血ghrelin、血胰岛素水平、胰腺ghrelin含量和高糖刺激后胰腺胰岛素分泌量；RTPCR检测胰腺ghrelin和胰岛素mRNA水平；免疫荧光和共聚焦技术检测胰岛ghrelin和胰岛素的阳性细胞数。结果：Ⅰ组1d、3d和7d的血浆胰岛素水平均低于N组（P〈0．05），胰岛素抵抗指数（HOMA—IR）也低于N组相应时间点（P〈0．05）。两组血糖、血浆胰岛素、HOMA—IR和血浆ghrelin水平有随时间变化的趋势（一’：4．12～125．97，P均〈0．001）。I组血浆ghrelin水平与HOMA—IR呈正相关（r=0．553，P=0．000）。两组胰腺ghrelin含量、ghrelinmRNA、insulin’细胞和ghrelin’细胞比例均随日龄增长呈下降趋势（F=-49．29～427．28，P均〈0．001），两组间ghrelin含量和mRNA变化差异显著（F=-69．98～169．22，P均〈0．05）；Ⅰ组和N组胰岛素分泌水平分别与其胰腺ghrelin含量呈负相关（r=-0．895，P=0．000；r=-0．458，P=0．002），胰岛ghrelin’细胞比例分别与其胰腺insulin’细胞比例呈负相关（r=-0．810，P=0．000；r=-0．714，P=0．000）。两组大鼠胰岛ghrelin’细胞分布不同。结论：宫内生长迟缓对血浆ghrelin水平、胰岛素分泌的影响在生后持续存在，ghrelin参与了宫内生长迟缓者发生胰岛素抵抗的进程。     

宫内发育迟缓对大鼠肝糖异生关键酶的影响

目的：通过检测宫内发育迟缓(IUGR)仔鼠肝组织中糖异生关键酶磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄
糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)的mRNA表达变化,探讨IUGR个体发生胰岛素抵抗的机制。方法：通过孕期全程给予孕鼠10%
低蛋白饲料建立IUGR仔鼠模型,对照组给予孕鼠21%正常蛋白饲料建立正常出生体质量仔鼠模型。每组仔鼠出生1
周、3周、8周时测定其体质量、空腹血糖、血清胰岛素水平及胰岛素抵抗指数,并采用反转录-聚合酶链反应(RTPCR)
法检测仔鼠肝组织中PEPCK和G-6-Pase的mRNA表达。结果：IUGR组仔鼠出生体质量明显低于对照组(P<0.001),
1周、3周、8周时亦低于对照组(P<0.05)。各时间点IUGR仔鼠空腹血糖、血清胰岛素水平及胰岛素抵抗指数与对照组
无明显差异(P>0.05)。IUGR仔鼠各时间点肝组织PEPCK和G-6-Pase mRNA的表达水平均高于对照组(P<0.01)。结论：
IUGR仔鼠肝糖异生关键酶PEPCK和G-6-Pase的表达明显增高,可能增加肝糖异生,是IUGR个体发生胰岛素抵抗和糖
尿病的重要机制之一。     

体外培养获得稳定高效胚胎干细胞滋养层的实验研究

目的筛选并优化获得稳定的胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）滋养层细胞的来源及其体外培养的最佳条件,为胚胎干细胞体外存活提供必要条件。方法分别取人工流产胎儿皮肤组织、昆明小鼠孕12.5、14.5、18.5d胚胎和新生鼠（P0）组织,分离培养原代胚胎成纤维细胞（embryonic fibroblasts,EFs）并传代制成滋养层。采用活细胞拒染法和免疫细胞化学染色等技术,观察并比较两种来源以及不同时相来源制备的滋养层细胞的功能状态差异。结果细胞活性状态：①人胚来源第1～5代成纤维细胞活性均好;但1～2代时杂细胞较多,此后可见深染色细胞逐渐增多。②E12.5d、E14.5d鼠胚来源的各代细胞均较同代E18.5d和P0来源的活性细胞数目高（P〈0.05）。以E14.5d第3～6代细胞最易培养存活。P0来源第6代与E14.5d来源同代细胞相比,深染变形细胞增多达30%。细胞分泌功能：①人胚来源第3～5代细胞I型胶原蛋白免疫阳性细胞数目少且染色较淡。②鼠胚来源的以E12.5d、E14.5d、E18.5d的第3～6代细胞免疫阳性细胞数目最多,且染色深;P0来源第6代细胞免疫阳性细胞染色深浅不一。结论采用人胚胎来源的成纤维细胞的活性尚可,但分泌功能稳定性欠佳。鼠胚E12.5～18.5d来源的第3～6代成纤维细胞,具有细胞活性强、分泌功能旺盛的特点,是作为胚胎干细胞赖以存活滋养层的最佳选择。