采用RNA干扰技术沉默survivin基因对口腔鳞状细胞癌细胞凋亡的影响

目的 应用RNA干扰（RNAi）技术抑制口腔鳞状细胞癌细胞株HSC-3细胞凋亡抑制因子survivin基因的表达,促进HSC-3细胞的凋亡。方法 合成针对survivin基因的小干扰RNA（siRNA）,转染对数生长期的HSC-3细胞。采用半定量逆转录聚合酶链反应检测HSC-3细胞中survivin mRNA的表达,MTT法测定细胞活性,tunnel分析和流式细胞术检测HSC-3细胞的凋亡,并设阴性对照组和空白对照组。结果 转染siRNA组survivin mRNA的表达明显低于阴性对照组和空白对照组;MTT法测定细胞活性,阴性对照组和空白对照组没有明显差别,但siRNA组的细胞活性明显下降;tunnel分析显示,转染siRNA组的凋亡细胞明显多于阴性对照组和空白对照组;流式细胞术分析,转染siRNA组的凋亡率（24.99％±1.33％）明显高于阴性对照组（1.24％±0.13％）和空白对照组（0.10％±0.02％）。结论 采用siRNA沉默survivin基因能促进口腔鳞状细胞癌细胞的凋亡,survivin siRNA基因治疗有可能成为口腔鳞状细胞癌治疗的新技术。     

表皮细胞生长因子受体和转化生长因子α与舌鳞状细胞癌增殖/转移关系的观察

目的：了解舌鳞状细胞癌表皮生长因子受体(EGFR)和转化生长因子α(TGF-α)的表达状况，以及EG-FR／TGF-α自分泌路径与肿瘤转移和增殖的关系。方法：收集90例舌鳞状细胞癌术后病理标本，应用免疫组织化学技术对EGFR、TGF-α和Ki-67进行检测，并对各因子间的表达状况及其相互关系进行统计分析。结果：在本组舌鳞状细胞癌标本中，EGFR，TGF-α的阳性表达率分别为93．3％(84／90)和95．56％，(86／90)。因EGFR和TGF-α同时在舌鳞状细胞癌的细胞中表达，由此可以确定舌鳞状细胞癌细胞存在EGFR／TGF-α自分泌调节途径。统计分析显示此分泌路径与肿瘤细胞的增殖和转移存在密切关系。结论：舌鳞状细胞癌存在EGFR／TF-α自分泌路径，此自分泌路径与肿瘤细胞的增殖以及转移存在密切关系。     

RNA干扰双泛素对舌鳞状细胞癌细胞生物学行为的影响

目的 应用RNA干扰技术抑制人舌鳞状细胞癌细胞株Tca8113中双泛素(diubiquitin)的表达,探讨双泛素表达下调对舌鳞状细胞癌细胞生物学行为的影响.方法 构建针对双泛素特异性小干扰RNA( small interfering RNA,siRNA)真核表达载体pU-双泛素-siRNA,将其转染至Tca8113细胞,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹法检测转染后的Tca8113细胞中双泛素的表达.通过流式细胞仪分析siRNA对舌鳞状细胞癌细胞周期的影响,并通过细胞侵袭能力实验观察siRNA对Tca8113细胞恶性生物学行为的变化.结果 siRNA干扰Tca8113细胞后,双泛素的表达无论是在mRNA水平还是在蛋白质水平均显著下降[mRNA:实验组(0.36±0.03)、空白对照组(0.92±0.07)、空载体组(0.95±0.05);蛋白:实验组(0.39±0.04)、空白对照组(0.64±0.05)、空载体组(0.69±0.05)](P＜0.05),细胞周期被阻滞在G1期,细胞生长缓慢,体外侵袭能力下降(P＜0.05).结论 通过RNAi技术阻断双泛素的表达,可抑制Tca8113细胞的生长、增殖、侵袭,提示双泛素在舌鳞状细胞癌的发生、发展过程中起重要作用.     

血管内皮生长因子小干扰RNA抑制人舌鳞状细胞癌细胞移植瘤生长及血管生成的实验

目的 观察小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达对人舌癌Tca8113细胞移植瘤的治疗作用.方法 构建Tea8113细胞裸鼠皮下移植瘤模型,随机分成4组,A组、B组为实验组,C组:以空载体注射为治疗对照组,D组:未治疗为空白对照组,每组5只.脂质体法将两对VEGF siRNA真核表达载体(PU-VEGF-siRNAl、PU-VEGF-siRNA2)作瘤体内及瘤周注射,1次/3 d,共10次后处死裸鼠;测量瘤体积及瘤重;反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blotting和免疫组化法分别检测瘤组织VEGF-mRNA及VEGF蛋白表达,并检测瘤内微血管密度;流式细胞仪检测肿瘤细胞悬液的细胞周期比例,Tunel法检测组织细胞凋亡.结果 B组瘤体积(0.402±0.158)cm3、瘤重量(2.12±0.58)g,均低于C、D组,细胞G1期比例为(40.26±1.42)%,较C、D组增加,B组瘤组织VEGF mRNA(0.752±0.048)和蛋白表达(1.12±0.15),组织切片VEGF阳性细胞表达率(12.56±1.30)%、平均灰度值(164.2±15.42)及微血管密度(3.50±1.58)个,均低于C、D组(P<0.05),凋亡细胞增加(P<0.01).结论 siRNA能在体内抑制舌癌VEGF表达,减少肿瘤血管生成,延缓肿瘤生长.不同的干扰片段体内作用效果存在差异.     

小分子RNA干扰沉默Tiam1基因对舌鳞状细胞癌细胞生物学特性的影响

目的:探讨小分子RNA干扰(siRNA)沉默Tiam1基因对舌鳞状细胞癌细胞生物学特性的影响。方法:培养人舌癌细胞SCC-4,随机分为siRNA-Tiam1组、siRNA-对照序列组和空白对照组,利用实时荧光定量PCR技术和Western blot法检测不同转染组细胞中Tiam1基因和蛋白表达,MTT法检测不同转染组细胞增殖情况,利用流式细胞术检测不同转染组细胞凋亡情况,Transwell法检测不同转染组细胞迁移和侵袭能力。结果:siRNA-Tiam1组细胞中Tiam1基因和蛋白相对表达量均低于siRNA-对照序列组和空白对照组(P<0.05);MTT实验结果显示,与siRNA-对照序列组和空白对照组相比,siRNA-Tiam1组细胞24 h、48 h、72 h和96 h时A值均降低(P<0.05);流式细胞检测结果显示,siRNA-Tiam1组细胞凋亡率显著高于siRNA-对照序列组和空白对照组(P<0.05);siRNA-Tiam1组迁移细胞数和侵袭细胞数均低于siRNA-对照序列组和空白对照组(P<0.05)。结论:特异性沉默Tiam1基因可有效抑制舌鳞状细胞癌细胞增殖能力,加速细胞凋亡,抑制细胞迁移和侵袭能力。     

过表达外源性Notch1对舌鳞癌细胞体外生长及表皮生长因子受体表达的影响

目的研究过表达外源性Notch1对人舌鳞癌细胞体外生长及表皮生长因子受体（EGFR）表达的影响。方法用脂质体将编码Notch1胞内域的表达质粒体外转染人舌鳞癌细胞系Tca8113细胞,用甲基噻唑基四唑法（MTT）和流式细胞仪分别检测细胞增殖活性和凋亡情况,用逆转录聚合酶链式反应和Western blot检测Notch1和EGFR的mRNA和蛋白的变化,用免疫细胞化学检测EGFR蛋白的表达。结果转染后Tca8113细胞的增殖活性降低（Р<0.05）,细胞凋亡率增高（Р<0.05）,Notch1表达上调（Р<0.05）,而EGFR表达下调（Р<0.05）。结论体外过表达外源性Notch1抑制人舌鳞癌细胞增殖,诱导其凋亡,并下调其表皮生长因子受体的表达。     

表皮生长因子受体在口腔鳞状细胞癌中的表达及临床意义

目的：探讨表皮生长因子受体在口腔鳞状细胞癌中的表达及其与临床的关系，材料和方法，手术切除４０例口腔鳞状细胞癌组织标志，经用表皮生长因子受体单克隆抗体和免疫组织化学方法进行观察，分析其表达特点及临床表现，结果：表皮生长因子受体表达与患者的性别，年龄，发病部位，ＴＮＭ分期和淋巴细胞结转移无关（Ｐ〉０．０５）。高分化鳞状细胞癌的表达低于低分化（Ｐ〈０．０１），结论：表皮生长因子肥体表达状况与口腔鳞状细胞     

表皮生长因子受体在颊粘膜鳞状细胞癌中的表达及其临床病理学意义

表皮生长因于受体（EGFR）是一单跨膜糖蛋白，与细胞的增殖、转化有关。本文采用免疫组化ABC法检测8例正常颊粘膜上皮及40例颊粘膜鳞癌中EGFR的表达状况，结果显示：EGFR在颊癌组织中呈异质性表达，其阳性率明显高于正常颊粘膜组织（P＜0．05）；EGFR表达状况与颈淋巴结转移及预后间存在相关关系（P＜0．05）。EGFR（＋）表达者多数伴有颈淋巴结转移，预后差。以上结果说明，EGFR在颊癌组织中的表达水平，可作为评估颊癌细胞增殖状态，颈淋巴结转移情况及患者预后的一项参考指标。     

表皮生长因子受体在口腔扁平苔藓、口腔乳头瘤及口腔鳞状细胞癌中的表达

目的:研究表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)在口腔扁平苔藓(OLP)、口腔鳞状细胞乳头瘤(SCP)及口腔鳞状细胞癌(SCC)中的表达,探讨其在口腔黏膜炎症、增生及癌发生过程中的意义.方法:用免疫组化方法检测EGFR在20例口腔黏膜扁平苔藓(单纯增生10例,伴糜烂10例)、20例口腔乳头瘤、20例口腔鳞状细胞癌及5例正常口腔黏膜中的表达.采用Fromowitz法计数阳性细胞.应用SPSS11.5软件包分析EGFR在不同病变中的表达差异.结果:EGFR在非糜烂型扁平苔藓组主要表现为弱阳性表达;糜烂型扁平苔藓组强阳性表达率为20％;乳头瘤组的强阳性表达率为25％;鳞状细胞癌的强阳性表达率为60％.扁平苔藓糜烂组和非糜烂组之间EGFR强阳性表达率有显著差异(P＜0.05);糜烂组OLP与乳头瘤组的强阳性表达率无显著差异;口腔鳞癌组的强阳性表达率显著高于扁平苔藓组及乳头瘤组.结论:EGFR可能成为口腔鳞癌化学预防作用的重要靶点.     

微小RNA对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖的影响

目的 探讨微小RNA(microRNA,miRNA)对体外培养的人舌鳞状细胞癌TeaS113细胞增殖的影响.方法 用脂质体把miRNA-31和miRNA-139的类似物或抑制物分别导人人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞,分别为实验组,脂质体试剂为对照组,然后用甲基噻唑基四唑(MTT)法检测细胞增殖情况.结果 对照组吸光度值(A值)在24、48和72 h时分别为(0.125±0.002)、(0.169±0.002)和(0.216 4±0.004);miRNA-31类似物可促进Tca8113细胞增殖,使其A值分别增至(0.136±0.001)(P<0.001)、(0.186±0.004)(P<0.001)和(0.249±0.012)(P<0.01);miRNA-139抑制物也使A值分别增加到(0.148±0.002)(P<0.001)、(0.214±0.002)(P<0.001)和(0.250±0.009)(P<0.01).与此相反,miRNA-31抑制物在48、72 h时抑制Tea8113细胞增殖,其A值分别降至(0.145±0.001)和(0.155±0.011)(P<0.001);mjRNA-139类似物在24、48 h也分别使A值降至(0.135±0.001)和(0.170±0.009)(P<0.001).结论 miRNA-31和miRNA-139在人舌鳞状细胞癌发生过程中起着重要作用,调整其活性有可能成为一种有效治疗口腔癌的新方法.     

短发夹RNA干扰血管内皮生长因子对舌癌耐药细胞移植瘤的影响

目的 研究短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达对人舌癌耐药细胞Tca-顺铂(Cisplatin,DDP)移植瘤的影响及可能机制.方法 以人舌癌Tca8113细胞系为亲本诱导建立耐药Tca-DDP细胞系,将其接种于裸鼠背侧皮下,建立移植瘤模型.模型动物分为4组,即空白对照组(非转染)、空载体组(转染空质粒载体)、无关片段组(转染无关对照质粒)、干扰质粒组(转染靶向VEGF的shRNA表达载体),每组6只,每3天以脂质体为载体作瘤体内及瘤周多点注射.观测移植瘤生长曲线,转染l0次后取瘤体称重,免疫组化法检测移植瘤微血管密度,原位杂交法检测移植瘤VEGFmRNA,免疫组化技术检测移植瘤VEGF、多药耐药蛋白P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、B细胞淋巴瘤-白血病因子2(B cell lymphoma/leukemia-2,bcl-2)及胞外信号调节激酶2蛋白(extracellular signal-regulated kinase 2,ERK-2).结果 干扰质粒组的瘤体生长明显受到抑制(P＜0.05),移植瘤重量(0.4781±0.0860)g及微血管密度(7.35±1.31)个/视野,低于其他3组(P＜0.05),且VEGF的mRNA及蛋白、P-gp、bcl-2及ERK-2的相对表达量分别为(0.0767±0.0234)、(0.1301±0.0433)、(0.1517±0.0184)、(0.1218±0.0251)及(0.1178±0.0291),表达均显著减少(P＜0.05).结论 RNA干扰抑制VEGF的表达,可抑制人舌癌Tca8113耐药细胞移植瘤的生长及血管生成,下调P-gp、bcl-2及ERK-2表达水平,提示靶向抑制VEGF可能是治疗耐药舌癌途径之一.

Abstract：

Objective To study the in vivo interference effects of vascular endothelial growth factor (VEGF) short hairpin RNA (shRNA) on xenografts of drug-resistant tongue cancer cells. Methods Drugresistant tongue caner cells Tca/Cisplatin(DDP) were injected subcutaneously into nude mice to establish xenograft models, which were randomly divided into non-transfected group, mock control group, control group transfected with scrambled sequence plasmid, interference group transfected with VEGF-shRNA expression plasmid. Liposome-mediated plasmid transfection was done in the latter three groups every three days. Xenografts were observed and tumor growth curve was measured. After the 10th transfection, tumors were anatomized and weigh. Microvessel density was detected by immunohistochemical staining. In situhybridization assay was used to test VEGF mRNA, and immunohistochemistry to test VEGF, P-glycoprotein ( P-gp), B cell lymphoma/leukemia-2 ( bcl-2 ) and extracellular signal-regultaed kinase 2 (ERK-2) protein. Results Tumor growth in VEGF-shRNA interference group was significantly slow. Tumor weight was (0.4781 ±0.0860) g, microvessel density (7.35 ± 1.31)/view, VEGF mRNA(0.0767 ±0.0234), VEGF protein (0.1301 ± 0.0433 ), P-gp (0.1517 ± 0.0184 ), bcl-2 ( 0.1218 ± 0.0251 ) and ERK-2 protein (0.1178 ±0.0291 ) in VEGF-shRNA interference group; all of them were less than those in the other three groups( P ＜ 0.05 ). Conclusions Inhibition targeting VEGF may become a potential therapy for drugresistant tongue cancer.     

Notch1和表皮生长因子受体在舌鳞癌及癌前病变中的表达

目的研究舌鳞癌（TSCC）及癌前病变中Notch1的表达,探讨其与表皮生长因子受体（EGFR）之间的潜在关系。方法免疫组化检测41例人TSCC、39例舌黏膜白斑（LP）和7例正常舌黏膜标本中Notch1和EGFR的表达。结果在正常舌黏膜和LP中,Notch1阳性表达主要位于角化层,部分颗粒层和棘层细胞也有表达,基底层无表达;而EGFR阳性表达主要位于基底层,棘层少见表达,颗粒层和角化层无表达。在TSCC中,Notch1阳性表达多见于癌巢中鳞状化生的角化细胞及类棘层细胞,周边细胞无表达;而EGFR阳性表达主要位于癌巢周边细胞,鳞状化生的角化细胞及类棘层细胞无表达。结论Notch1在舌黏膜上皮中促进细胞分化,在TSCC中起抑癌作用;而EGFR的表达可能抑制Notch1的表达,以维持细胞增殖,并促进TSCC发生发展。     

口腔扁平苔藓组织中表皮生长因子及其受体表达变化的研究

目的探讨表皮生长因子(EGF)、表皮生长因子受体(EGFR)及两种原癌基因c-fos、c-jun,在口腔扁平苔藓中的基因表达、蛋白含量变化及其生物学意义。方法选择新鲜组织标本31例,包括糜烂型扁平苔藓10例、网状型扁平苔藓12例和正常口腔黏膜9例,使用逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测EGF、EGFR、c-fos和c-jun基因在不同组织中的表达;同时使用免疫组化方法比较这4种蛋白在不同组织中的定位和表达量的变化。结果糜烂型扁平苔藓EGFR基因的mRNA和蛋白含量分别为(55.9±23.1)%、(71.1±10.1)%,均明显高于网状型扁平苔藓及正常口腔黏膜组织(P<0.05)。糜烂型扁平苔藓中的c-fos和c-jun基因表达呈相同的变化规律,两种基因的mRNA含量均显著高于正常口腔黏膜。糜烂型扁平苔藓的C-fos、C-jun蛋白的阳性细胞率分别是正常黏膜的1.3和1.5倍,蛋白含量明显高于正常口腔黏膜(P<0.01)。结论糜烂型扁平苔藓的癌变率可能大于网状型扁平苔藓,其中EGF及其受体引导的信号传导通路可能起着十分重要的作用。     

小干扰RNA沉默Dicer酶对人舌鳞癌细胞Tca-8113的增殖和细胞周期的影响

目的研究沉默Dicer酶的表达对人舌鳞癌细胞Tea-8113的增殖和细胞周期的影响。方法实验组转染靶向Dicer酶的siRNA序列;时照组转染尤义序列siRNA;空白组细胞未做转染？采用RNA于扰技术沉默Tea-8113中Dicer酶的表达,通过荧光定量聚合酶链反应、蛋白质印迹法及免疫组织化学技术,检测Tea-8113转染小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）后Dicer酶的mRNA和蛋白质水平的表达情况;应用噻唑蓝比色法及流式细胞术榆测细胞增殖及细胞周期的变化。结果Tea-8113细胞转染siRNA24h后,实验组Dicer酶mRNA表达量是空白组的0．39倍．表达水平下降,实验组与空白组或对照组比较,表达水平都有所下降,差异有统计学意义（P〈0．05）、转染48h后实验组蛋白质表达较空白组下调53．67％。Dicer酶表达下凋后,Tca-8113细胞增殖加速,G1期细胞百分率减少,S期和G2期细胞百分率增多。结论沉默Dicer酶的表达可加快细胞周期从G1期向S期和G2期进展．促进Tea-8113细胞的生长。     

人信号素基因semaphorin-3F瞬时转染对舌鳞癌细胞增殖作用的影响

目的探讨人信号素家族中最具代表性成员信号素3F（semaphorin-3F，SEMA-3F）基因瞬时转染对舌鳞状细胞癌细胞生长的影响。方法将Tea8113细胞分为4组，即转染组：转染pEGFP-N1-SEMA-3F-cDNA的Tca8113细胞；空载体组：转染pEGFP-N1质粒的Tca8113细胞；未转染组：无转染细胞；对照组：仅加转染试剂。构建和纯化SEMA-3F的真核表达载体pEGFP-N1-SEMA-3F，用阳离子脂质体转染试剂介导转染Tca8113细胞。观察外源目的基因在靶细胞中的表达及细胞的生长情况。结果基因转染后48h成功检测到高表达SEMA-3F基因。转染后24、48、72、96h，甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测转染组的各时期平均A值，均低于其余3组。转染后48h，流式细胞仪检测G1期细胞比例降低，S期比例增高。结论SEMA-3F基因瞬时转染可使其在Tca8113细胞中高表达，并使细胞增殖受到抑制。本实验结果将SEMA-3F作为目的基因，为治疗舌癌进一步提供了实验依据。