裂果薯皂苷单体Ⅰ通过TGF-β1调控上皮间质转化对人肝癌细胞SMMC-7721侵袭和转移的影响

目的探究裂果薯皂苷单体Ⅰ通过转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对人肝癌细胞SMMC-7721侵袭和转移的影响。方法MTT法检测SMMC-7721细胞的增殖活性;用TGF-β1刺激细胞24 h,以TGF-β1/Smad信号通路抑制剂SIS3作阴性对照。细胞划痕实验和Tran-swell小室侵袭实验分别检测细胞迁移和侵袭能力;Western blot检测Smad7、Smad2/3、p-Smad2/3、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达。结果SSPHⅠ能抑制SMMC-7721细胞的增殖,其24 h的IC50为1.72μmol·L^-1;与TGF-β1组相比,TGF-β1+SSPHⅠ组细胞迁移率和侵袭细胞数显著降低;Western blot实验结果显示,TGF-β1+SSPHⅠ组的Smad2/3,p-Smad2/3,N-cadherin和Vimentin蛋白的表达降低,Smad7和E-cadherin表达升高,结果与TGF-β1+SIS3组相同(P均<0.05)。结论SSPHⅠ能抑制SMMC-7721细胞侵袭和转移,其机制可能与抑制TGF-β1/Smad信号通路,阻断EMT发生有关。     

去甲斑蝥素对TGF—β1诱导的人近端肾小管细胞上皮细胞转分化及信号蛋白Smad2／3表达的影响

目的探讨去甲斑蝥素对体外人源性肾小管细胞株（HK－2）上皮细胞间质转分化（epithelial—mesenchymal transition,EMT）以及信号蛋白Smad2／3的影响。方法体外培养HK2细胞,分为对照组、TGF-β1组和去甲斑蝥素组（NCTD组）。对照组为无血清DMEM培养,TGG-β1组为TGF-β1 5ng·mL^-1诱导,NCTD组为不同浓度NCTD（0．5、1．0、2．5μg·mL^-1）与TGF-β1（5ng·mL^-1）共同作用,各组作用时间48h。使用半定量RT-PCR法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、上皮性钙黏附蛋白（Ecadherin）与Smad2、Smad3mRNA表达;采用Western blot检测α-SMA、E-cadherin、Smad2／3、p-Smad2／3蛋白质表达。结果与对照组相比,TGF-β1组α—SMAmRNA及其蛋白表达明显上调（Pd0．05）,E-cadherin mRNA及其蛋白表达显著下调（P〈0．05）;与TGF-β1组相比,NCTD干预组α—SMAmRNA及其蛋白表达明显下调（P〈0．05）,而E-cadherin mRNA及其蛋白表达显著上调（P〈0．05）,且均呈剂量依赖性。与对照组相比,TGF-β1组Smad2、Smad3rnRNA和Smad2／3、p-Smad2／3蛋白表达上调（P〈0．05）;与TGF-β1组比较,NCTD干预组Smad2、Smad3mRNA和Smad2／3、p-Smad2／3蛋白表达下调（P〈0．05）,具有剂量依赖关系。结论去甲斑蝥素具有抑制肾小管上皮细胞EMT的作用,该作用可能与其下调信号蛋白Smad2／3的表达有关。     

基于TGF-β/Smad2/3信号通路探讨鸢尾素对哮喘气道重塑的实验研究

目的 探究鸢尾素（Irisin）对TGF-β1诱导的肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的调控及机制。方法 体外培养人胚肺成纤维细胞HFL-1,用10 ng/mL TGF-β1诱导HFL-1细胞,同时用不同浓度(25、50、100、200) ng/mL的irisin干预细胞24 h、48 h和72 h。利用CCK8试剂盒检测细胞增殖率。随后,将细胞分为空白对照组（NC组）、TGF-β1组（10 ng/mL）、TGF-β1+irisin组（10 ng/mL TGF-β1和100 ng/mL irisin）。采用细胞划痕实验检测不同组细胞的迁移能力。通过免疫荧光法检测不同处理组细胞α-SMA蛋白的表达情况。Western blot法检测不同处理组细胞α-SMA、胶原蛋白I (collagen I)、Smad2、pSmad2、Smad3、p-Smad3的蛋白表达水平。结果 与NC组相比,TGF-β1能有效促进HFL-1细胞的增殖和迁移（P<0.05）;与TGF-β1组相比,加入irisin进行干预后能有效抑制TGF-β1诱导的HFL-1细胞的增殖和迁移（P<0.01）。与NC组相比,T...     

二甲双胍对高糖诱导的肾小管上皮细胞TGF-β/ERK/MMP-9通路及上皮间质转化的影响

目的探讨二甲双胍对高糖诱导的肾小管上皮HK-2细胞上皮间质转化(EMT)的影响及其机制。方法以0、7.5、15.0、30.0、60.0、120.0mmol/L二甲双胍作用48h后,采用噻唑蓝(MTT)法检测HK-2细胞活力以筛选合适的二甲双胍作用浓度;将体外培养的HK-2细胞分为对照组(5.5 mmol/L D-葡萄糖)、高渗组(24.5 mmol/L甘露醇和5.5 mmol/L D-葡萄糖)、高糖组(30 mmol/L D-葡萄糖)、高糖+7.5 mmol/L二甲双胍组(30 mmol/L D-葡萄糖+7.5 mmol/L二甲双胍)和高糖+15 mmol/L二甲双胍组(30 mmol/L D-葡萄糖+15 mmol/L二甲双胍),倒置显微镜观察各组HK-2细胞形态,免疫印迹法(Western blotting)检测各组HK-2细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏附蛋白(E-cadherin)、转化生长因子-β(TGF-β)、细胞外信号调节激酶(ERK)、磷酸化(p)-ERK、基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白表达水平,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测α-SMA、E-cadherin、TGF-β、ERK、MMP-9 mRNA表达水平。结果与对照组相比,30.0、60.0mmol/L二甲双胍作用后HK-2细胞活力明显升高,120.0mmol/L二甲双胍作用后HK-2细胞活力明显降低(P0.05),而7.5、15.0mmol/L二甲双胍作用后HK-2细胞活力差异无统计学意义(P0.05);与对照组比较,高渗组细胞形态无明显改变,且细胞中α-SMA、E-cadherin、TGF-β、MMP-9蛋白和mRNA表达水平以及p-ERK/ERK蛋白、ERK mRNA表达水平差异均无统计学意义(P0.05),但高糖组细胞失去原有形态变为长梭形,且细胞中α-SMA、TGF-β蛋白和mRNA表达水平以及p-ERK/ERK蛋白、ERK mRNA表达水平明显升高,而MMP-9、E-cadherin蛋白和mRNA表达水平明显降低(P0.05);与高糖组比较,高糖+7.5mmol/L二甲双胍组、高糖+15.0mmol/L二甲双胍组细胞形态由长梭形逐渐变成圆形或椭圆形,且α-SMA、TGF-β蛋白和mRNA表达水平以及p-ERK/ERK蛋白、ERK mRNA表达水平明显降低,而MMP-9、E-cadherin蛋白和mRNA表达水平明显升高(P0.05),且高糖+15.0 mmol/L二甲双胍组细胞上述指标变化幅度大于高糖+7.5 mmol/L二甲双胍组。结论二甲双胍可抑制高糖诱导的肾小管上皮HK-2细胞EMT,其作用机制可能与抑制TGF-β/ERK/MMP-9通路活化有关。     

蛇床子素通过抑制小鼠心肌成纤维细胞TGF-β1/Smad信号通路降低胶原表达的研究

目的 研究蛇床子素降低真核载体pcDNA3.1(+)-TGF-β1转染的小鼠心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFs)胶原的表达是否与抑制TGF-β1/Smad信号通路相关。方法 用真核表达载体pcDNA3.1(+)-TGF-β1转染小鼠CFs，然后在TGF-β1受体抑制剂SB431542预处理或不预处理的情况下，用不同浓度的蛇床子素处理CFs 24 h。ELISA检测上清TGF-β1水平，Western blotting检测细胞内α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、Smad2/3、p-Smad2/3、Smad4和Smad7的蛋白表达。结果 真核表达载体pcDNA3.1(+)-TGF-β1转染CFs后，TGF-β1释放量增加，提示建立了TGF-β1过表达的细胞模型。TGF-β1过表达的CFs经蛇床子素(5~20 μmol·L^-1)处理24 h后，TGF-β1、α-SMA、collagenⅠ、collagenⅢ、p-Smad2/3和Smad4蛋白表达降低，Smad7蛋白表达上升。TGF-β1受体抑制剂SB431542预处理2 h后，蛇床子素对α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、Smad2/3、p-Smad2/3和Smad4蛋白表达的抑制作用进一步增强。结论 蛇床子素可以通过直接抑制TGF-β1的产生和Smad通路下调α-SMA和胶原蛋白的表达，这可能是其抗纤维化的机制之一。     

小檗碱通过TGF-β/Smad通路抑制TGF-β1诱导的人肝癌HepG2细胞上皮间质转化的研究

目的探讨小檗碱(berberine)对转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导的人肝癌HepG2细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的作用及其机制。方法MTT法检测小檗碱对HepG2细胞增殖活性;采用10 ng·L-1 TGF-β1诱导HepG2细胞EMT模型形成,并加入小檗碱处理;克隆形成实验、细胞划痕和Transwell小室实验分别检测HepG2细胞的克隆形成能力、迁移和侵袭能力;免疫荧光法检测EMT间质标志物Vimentin的表达;Western blot法检测EMT标志物蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Snail)、基质金属蛋白酶(MMP-2)、TGF-β/Smad通路蛋白(Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3)的表达。结果小檗碱呈浓度时间依赖性抑制HepG2细胞活性;与TGF-β1组比较,小檗碱可以明显抑制HepG2细胞的克隆形成能力、迁移和侵袭能力;并且小檗碱可以抑制TGF-β1上调的E-cadherin蛋白表达,和TGF-β1下调的N-cadherin、Vimentin、Snail、MMP-2、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达。结论小檗碱可能通过抑制TGF-β/Smad信号通路,干预TGF-β1诱导HepG2细胞的EMT进程,抑制HepG2细胞的迁移和侵袭能力。     

贝那普利对糖尿病大鼠肾组织中TGF-β1和Smad4表达的影响

目的研究贝那普利对糖尿病大鼠肾组织中TGF-β1和Smad4表达的影响.方法用链脲佐菌素诱导的Wistar糖尿病大鼠为模型,随机分为N组、DM组和DM-B组3组,于给药8周后处死,检测各组大鼠的平均动脉压、血糖、肾功能指标及24小时尿蛋白.采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测TGF-β1及Smad4 mRNA表达水平.采用免疫组织化学方法检测TGF-β1及Smad4蛋白定位的表达,并用彩色病理图像分析系统进行定量分析.结果与对照组相比,糖尿病大鼠平均动脉压、血糖、肾功能指标及24小时尿蛋白排出均增加;肾小球细胞外基质(ECM)明显增多、系膜区扩大(PAS染色);TGF-β1及Smad4 mRNA表达上调;TGF-β1及Smad4蛋白的表达明显增加.贝那普利治疗后上述指标明显减轻(P＜0.01).结论TGF-β/Smad通路在糖尿病肾病时是激活的,贝那普利治疗可延缓肾脏损害.     

黄芩素对TGF-β_1体外诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响

目的观察黄芩素(黄芩苷元,baicalein,BAE)对TGF-β1体外诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响。方法体外培养人胚胎肺成纤维细胞(WI-38),TGF-β1诱导后,通过Western blot检测细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)相关蛋白表达的变化,同时采用免疫组化法观察细胞形态变化。TGF-β1体外诱导肺成纤维细胞WI-38成肌成纤维细胞模型,再给予不同剂量的黄芩素,检测转化过程中相关蛋白α-SMA、collagen 1、Smad 2、p-Smad 2的表达变化。结果与模型组相比,黄芩素2 000nmol.L-1～125 nmol.L-1对TGF-β1体外诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化有抑制作用。黄芩素组以剂量依赖性下调α-SMA(P<0.01)、collagen 1(P<0.01)、Smad 2(P<0.05)、p-Smad 2(P<0.05)蛋白的表达。结论黄芩素对TGF-β1体外诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化过程中有一定的抑制作用,该作用与下调α-SMA,抑制细胞内胶原合成及干预TGF-β/Smads信号通路有关。     

辛伐他汀下调LOX-1表达和ROS生成抑制ox-LDL诱导肾小管上皮细胞转分化

目的:探讨辛伐他汀对氧化低密度脂蛋白 (ox-LDL)诱导的NRK52E细胞转分化的作用及其机制.方法:体外培养NRK-52E,同步化后分为3组:①空白对照组(NRK52E细胞+0 μg·ml-1 ox-LDL)②ox-LDL组(NRK52E细胞+50 μg·ml-1 ox-LDL)③辛伐他汀组(10 μmol·L-1辛伐他汀+50 μg·ml-1 ox-LDL),用Western blotting测定Oxidized Low Density Lipoprotein Receptor-1(LOX-1)、E-cadherin和α-SMA蛋白表达,激光共聚焦检测ROS的表达.结果:①与正常组相比,50 μg·ml-1 ox-LDL可明显促进NRK-52E细胞LOX-1表达增高,ROS生成增多,分别为对照组的12.13倍(P<0.05)和4.83倍(P<0.05).②随着LOX-1和ROS的增多,α- SMA表达也增多,而E-cadherin的表达则下降,分别为对照组的5.6倍(P<0.05)和0.35倍(P<0.05),NRK-52E细胞发生转分化.③10 mol·L-1辛伐他汀治疗可明显抑制LOX-1表达,减少ROS生成,与50 μg·ml-1 ox-LDL组相比,分别下降61%(P<0.05)和60%(P<0.05),随之α-SMA和E-cadherin的变化也得到部分逆转,α-SMA蛋白下降68%(P<0.05),E- cadherin蛋白上升1.82倍(P<0.05),三组比较差异均有统计学意义.结论:辛伐他汀可通过下调LOX-1表达和ROS生成,抑制ox-LDL诱导的NRK52E细胞转分化从而保护肾脏.     

屋尘螨提取液对哮喘气道上皮细胞间质转化的影响

目的探究屋尘螨提取液(House dust mite extracets,HDM)对人支气管上皮16-HBE细胞间质转化(Epithelia-mesenchymal transition,EMT)的影响。方法以16-HBE细胞株为研究对象,分别加入HDM和转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1),应用MTT法和Western blot法,检测细胞增殖情况以及EMT过程中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达。结果 (1)HDM刺激后,16-HBE细胞形态改变不显著,同时对细胞增殖无显著影响;与TGF-β1联合作用后,细胞形态发生EMT变化,并且显著促进细胞增殖(P<0.05)。(2)HDM刺激对16-HBE细胞中E-cadherin、Vimentin和α-SMA蛋白表达均无显著影响;与TGF-β1联合作用后,E-cadherin蛋白表达显著降低(P<0.05),Vimentin和α-SMA蛋白表达升高(P<0.05),效果较TGF-β1单独应用更为明显。结论 HDM不能直接刺激上皮细胞发生EMT改变,但可通过促进TGF-β1诱导的上皮细胞EMT改变而发挥作用。     

贝那普利对糖尿病大鼠肾组织中TGF-β1和Smad4表达的影响

目的:研究贝那普利对糖尿病大鼠肾组织中TGF-β1和Smad4表达的影响.方法:用链脲佐菌素诱导的Wistar糖尿病大鼠为模型,随机分为N组、DM组和DM-B组3组,于给药8周后处死,检测各组大鼠的平均动脉压、血糖、肾功能指标及24小时尿蛋白.采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测TGF-β1及Smad4 mRNA表达水平.采用免疫组织化学方法检测TGF-β1及Smad4蛋白定位的表达,并用彩色病理图像分析系统进行定量分析.结果:与对照组相比,糖尿病大鼠平均动脉压、血糖、肾功能指标及24小时尿蛋白排出均增加;肾小球细胞外基质(ECM)明显增多、系膜区扩大(PAS染色);TGF-β1及Smad4 mRNA表达上调;TGF-β1及Smad4蛋白的表达明显增加.贝那普利治疗后上述指标明显减轻(P＜0.01).结论:TGF-β/Smad通路在糖尿病肾病时是激活的,贝那普利治疗可延缓肾脏损害.     

氧化苦参碱下调ZNF580以抑制LTC-14细胞分泌细胞外基质的分子机制研究

目的 探讨氧化苦参碱（OM）对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的大鼠胰腺星状细胞 LTC-14中细胞外 基质（ECM）分泌的影响及其分子机制。方法 取生长良好的 LTC-14细胞株,分为对照组（正常培养的 LTC-14细 胞）,TGF-β1组（10 μg/L TGF-β1刺激 12 h）,TGF-β1+OM组（1 g/L OM预处理 30 min,再加入 10 μg/L TGF-β1刺激 12 h）,TGF-β1 + SiZNF850组（LTC-14细胞中瞬时转染 ShRNA-ZNF580质粒,24 h后加入 10 μg/L TGF-β1刺激 12 h）。实时定量 PCR、Western blot 检测细胞内 Smad2、Smad3、ZNF580、α-肌动蛋白（α-SMA）、基质金属蛋白酶-2 （MMP-2）、基质金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP1）的mRNA和蛋白表达情况,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测ECM中 胶原蛋白-Ⅰ（Col-Ⅰ）、Col-Ⅲ、纤维连接蛋白（FN）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）的分泌情 况。结果 TGF-β1诱导的 LTC-14细胞中 Smad2、Smad3、ZNF580和 α-SMA的 mRNA和蛋白表达水平均升高（P＜ 0.05）,MMP-2/TIMP1比值下降（P＜0.05）,且 Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN、TNF-α和 IL-1β的分泌水平升高（P＜0.05）;而用 OM预处理或沉默 ZNF580基因后,LTC-14细胞中 TGF-β1/Smads通路 Smad2、Smad3、α-SMA和 ZNF580的 mRNA和 蛋白表达水平均下调（P＜0.05）,MMP-2/TIMP1表达比值升高（P＜0.05）,细胞外基质 Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN、TNF-α和 IL-1β分泌水平均降低（P＜0.05）。结论 OM通过抑制胰腺星状细胞LTC-14中TGF-β1/Smads通路激活,下调ZNF580, 阻滞胰腺星状细胞的活化,使ECM分泌减少、降解增多,减轻胰腺纤维化。ZNF580可能是OM作用的分子靶点。     

丹酚酸B对转化生长因子β1诱导人肺成纤维细胞增殖和分化的影响

目的：观察丹酚酸B（Sal B）对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的人肺成纤维细胞增殖及分化的影响。方法：将人胚肺成纤维细胞（MRC-5）随机分为6组：对照组（未加入TGF-β1或Sal B）;1μmol/L Sal B组;10μmol/L Sal B组;10ng/mL TGF-β1组;TGF-β1（10ng/mL）＋1μmol/L Sal B组;TGF-β1（10ng/mL）＋10μmol/L Sal B组。采用MTT法观察各组细胞增殖情况;RT-PCR和Western blot方法分别检测各组细胞α-SMA mRNA和蛋白的表达情况;免疫荧光方法检测细胞内纤维形肌动蛋白（Factin,Fibrous Actin）重组及观察细胞形态变化。结果：与对照组比较,TGF-β1组细胞增殖率、α-SMA mRNA和蛋白的表达水平均明显增加,细胞形态发生明显改变,胞内可见大量F-actin聚合形成的应力纤维（stress fiber）（P〈0.01）;与对照组比较,单纯加入Sal B对细胞增殖、α-SMA表达、细胞形态和F-actin重组均未产生影响（P〉0.05）;与单纯TGF-β1组比较,TGF-β1＋Sal B两组细胞增殖率、α-SMA mRNA和蛋白表达水平均下降,发生形态改变的细胞减少,胞内F-actin聚合形成的stress fibers减少（P〈0.05）,且10μmol/L Sal B对TGF-β1抑制效应优于1μmol/L Sal B,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论：Sal B体外能够抑制TGF-β1诱导的人肺成纤维细胞增殖和向肌纤维母细胞分化。     

miR-144通过TGF-β/Smad通路抑制前列腺癌细胞的增殖侵袭

摘要：目的:观察微小RNA（miR）-144对前列腺癌细胞增殖侵袭的影响及其对转化生长因子-β（TGF-β）/Smad信号通路的影响。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测LNCaP、PC-3、SW1990人前列腺癌细胞和RWPE-1人正常前列腺上皮细胞中miR-144的表达水平;以miR-144表达量最低的PC-3细胞和表达量最高的LNCaP细胞作为研究对象,转染miR-144 mimics-NC序列为NC组,转染miR-144 mimics序列为miR-144过表达（mimics）组,荧光显微镜观察转染情况; qRTPCR检测转染后miR-144的表达水平,细胞活力检测试剂盒（CCK-8）检测细胞增殖,Transwell实验检测细胞侵袭能力,生物信息学预测及荧光素酶报告基因检验miR-144的潜在靶基因,蛋白免疫吸附法（Western Blot）检测TGF-β/Smad通路蛋白表达水平。结果:与正常前列腺上皮细胞RWPE-1比较,LNCaP、PC-3、SW1990前列腺癌细胞中miR-144的表达水平均显著降低（P<0.05）,miR-144 mimics转染后细胞转染效率均达到90%以上。与NC组比较,mimics组细胞中miR-144的相对表达水平显著升高,细胞的增殖活性和侵袭能力显著降低（P<0.05或P<0.01）。与TGF-β-Wt+miR-144 mimics-NC共转染组比较,TGF-β-Wt+miR-144 mimics转染组荧光素酶活性显著降低（P<0.05）。TGF-β转录本3’UTR区域具有miR-144的潜在靶点,miR-144潜在靶基因为TGF-β,在24～120 h,与miR-144 mimics-NC组相比,miR-144 mimics、miR-144 mimics+TGF-β组细胞活性显著降低（P<0.05）;与miR-144 mimics组相比,miR-144 mimics+TGF-β组细胞活性显著升高（P<0.05）。与NC组比较,mimics组细胞中p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3水平及TGF-β、TGF-βR蛋白表达水平显著降低（P<0.01）。结论:miR-144可能通过TGF-β/Smad信号通路抑制前列腺癌细胞的增殖及侵袭。     

白花丹醌对大鼠肝星状细胞活性氧及TGF-β1/Smad信号通路的影响

目的研究白花丹醌对大鼠原代分离肝星状细胞(HSC)活性氧(ROS)水平、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Smad2/3、p-Smad2/3、Smad7蛋白表达的影响。方法分离原代大鼠HSC,接种活化期HSC,进行α-SMA免疫荧光鉴定,分为空白组、TGF-β1组、NADPH氧化酶抑制剂组(DPI)、白花丹醌低、中、高剂量(2、4、8μmol·L~(-1))组。MTT检测白花丹醌对HSC增殖的影响;显微镜下观察白花丹醌对HSC形态学的影响;荧光探针法测定HSC内ROS表达水平;Western blot检测HSC中Smad2/3、p-Smad2/3和Smad7蛋白表达。结果经α-SMA免疫组织荧光鉴定,阳性率达91%,表明获得高纯度的大鼠原代HSC。MTT测定白花丹醌最佳给药浓度为2、4、8μmol·L~(-1);DPI组和白花丹醌各浓度组可不同程度下调HSC内ROS的表达;Western blot结果显示,与模型组比较,DPI和白花丹醌给药组Smad2/3、p-Smad2/3的蛋白表达降低,Smad7蛋白表达增加。结论白花丹醌可能是通过下调ROS水平,进而降低Smad2/3和p-Smad2/3的表达,从而发挥抗HSC活化的作用。     

雷公藤内酯醇减少放射性肺纤维化中肌成纤维细胞活化与抑制TGF-β1/ERK/Smad3通路相关

目的通过体内外实验,观察雷公藤内酯醇(TPL)减少放射性肺纤维化中肌成纤维细胞(MFBs)活化与TGF-β1/ERK/Smad3通路的相关性。方法以TGF-β1刺激成纤维细胞建立体外MFBs活化模型,C57BL/6小鼠胸部照射形成体内MFBs活化、放射性肺纤维化模型。MFBs活化状态通过检测小鼠成纤维细胞中α-SMA(RT-PCR、Western blot方法)和ColⅠ(RT-PCR、ELISA方法)的表达,通路活性采用Western blot法检测p-ERK、p-Smad3(Ser208)、p-Smad3(Ser423)的水平。ERK siRNA及Smad3 siRNA观察ERK、Smad3在MFBs活化中的地位。结果 TGF-β1激活p-ERK/p-Smad3(Ser208)及p-Smad3(Ser423),诱导成纤维细胞表达α-SMA,活化为MFBs,合成Col I明显增多;使用ERK siRNA及Smad3 siRNA确定了ERK及Smad3均参与α-SMA、ColⅠ的表达,其中ERK可能通过磷酸化Smad3连接区(Ser208)起相关作用。小鼠胸部照射可致肺组织中p-ERK、p-Smad3(Ser208)、p-Smad3(Ser423)的水平上调,α-SMA表达增加,显示多量MFBs活化。TPL对体内和体外实验中ERK、Smad3(Ser208)、Smad3(Ser423)的磷酸化活化均有明显抑制作用,可明显下调α-SMA表达及ColⅠ合成,减少MFBs的活化。结论 TPL可通过抑制TGF-β1/ERK/Smad3通路,减少肺部照射后MFBs活化,从而抑制放射性肺纤维化进展。     

转化生长因子-β1对绒毛膜癌JEG-3细胞增殖及Smad3、Smad7表达的影响

目的:观察转化生长因子(TGF)-β1对绒毛膜癌JEG-3细胞增殖能力及其Smad3、Smad7蛋白表达的影响.方法:体外培养人绒毛膜癌JEG-3细胞,分别给予不同剂量及不同作用时间的TGF-β1进行诱导,四甲基氮唑比色法检测细胞增殖能力变化,蛋白印迹法检测Smad3、Smad7蛋白的表达变化.结果:JEG-3细胞对TGF-β1的诱导作用表现为良好的浓度效应和时间效应.100、200μg/L TGF-β1作用后,细胞增殖率显著增加(P＜0.01),Smad3蛋白的相对表达量增加(P＜0.05或P＜0.01),Smad7蛋白无明显改变(P＞0.05);同时100μg/L TGF-β1作用12 h后,细胞增殖率显著增加,Smad3蛋白相对表达量增加(P＜0.05或P＜0.01),Smad7蛋白表达无改变(P＞0.05).结论:外源性TGF-β1能够促进绒毛膜癌JEG-3细胞的增殖,具有良好的浓度效应和时间效应;绒毛膜癌JEG-3细胞逃逸TGF-β1介导的生长抑制作用,可能是由于TGF-β1/Smads信号通路中的Smad3、Smad7蛋白发生异常而致.     

微小 RNA-212调控 TOB2蛋白表达对转化因子 -β1干预 A549细胞诱导肺纤维化及上皮 -间质转化的影响

目的 探讨微小RNA-212(miR-212)对转化因子-β1(TGFβ1)干预A549细胞诱导肺纤维化及上皮-间质转化(EMT)的影响及可能的相关机制.方法 体外培养A549细胞,实验分组:PBS组(常规培养)、TGFβ1组(含有5 ng/mL TGFβ1培养液培养)、TGFβ1+anti-miR-con组(转染anti-miR-con后使用含有5 ng/mL TGFβ1培养液培养)、TGFβ1+anti-miR-212组(转染anti-miR-212后使用含有5 ng/mL TGFβ1培养液培养)、TGFβ1+anti-miR-212+si-con组(共转染anti-miR-212与si-con后使用含有5 ng/mL TGFβ1培养液培养)、TGFβ1+anti-miR-212+si-TOB2组(共转染anti-miR-212与si-TOB2后使用含有5 ng/mL TGFβ1培养液培养).实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)与蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中miR-212与TOB2的表达水平;甲基噻唑基四唑(MTT)检测干扰miR-212的表达对TGFβ1诱导A549细胞增殖的抑制作用,以及下调TOB2的表达对TGFβ1诱导A549细胞增殖的促进作用;双荧光素酶报告基因检测验证miR-212与TOB2的靶向关系;Western blot检测干扰miR-212的表达或下调TOB2的表达对细胞周期蛋白1(CyclinD1)、波形蛋白(Vimentin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I型胶原a1(COL1a1)、上皮钙黏附素(E-cadherin)表达的影响.结果 与PBS组比较,TGFβ1组细胞增殖率显著升高[(100.23±5.64)％比(218.34±16.38)％,P<0.05],miR-212[(1.00±0.14)比(6.07±0.86)]、CyclinD1[(0.54±0.06)比(0.89±0.07)]、Vimentin[(0.26±0.04)比(1.09±0.13)]、α-SMA[(0.43±0.05)比(0.86±0.07)]、COL1a1[(0.57±0.06)比(1.17±0.13)]的表达水平显著升高(P<0.05),而TOB2[(1.02±0.12)比(0.44±0.14)]、E-cadherin[(0.93±0.09)比(0.47±0.06)]的表达水平显著降低(P<0.05);干扰miR-212的表达可显著抑制TGFβ1诱导A549细胞增殖(P<0.05),抑制CyclinD1、Vimentin、α-SMA、COL1a1表达(P<0.05),促进E-cadherin表达(P<0.05);共转染WT-TOB2的miR-212组荧光素酶活性显著低于miR-con组(P<0.05),共转染MUT-TOB2的miR-212组与miR-con组荧光素酶活性比较差异无统计学意义;相较于TGFβ1+anti-miR-212+si-con组,TGFβ1+anti-miR-212+si-TOB2组A549细胞增殖率显著升高[(69.29±8.04)％比(88.27±9.26)％,P<0.05],CyclinD1[(0.59±0.08)比(0.75±0.11)]、Vi-mentin[(0.42±0.05)比(0.56±0.07)]、α-SMA[(0.38±0.06)比(0.53±0.06)]、COL1a1蛋白[(0.41±0.05)比(0.55±0.04)]表达水平显著升高(P<0.05),E-cadherin蛋白表达水平显著降低[(0.82±0.08)比(0.45±0.06),P<0.05].结论 干扰miR-212的表达可通过上调TOB2的表达而抑制TGFβ1诱导的A549细胞增殖及EMT进而发挥抗肺纤维化作用.     

抑制血清应答因子表达影响转化生长因子β1介导的食管癌上皮细胞-间质转化的作用研究

目的研究血清应答因子( serum response factor,SRF)小干扰 RNA(small interference RNA,siRNA)影响转化生长因子 β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)介导的 Eca-109食管癌细胞发生上皮间质转化( epithelial-mesenchymal transition,EMT)的作用机制。方法体外培养 Eca-109食管癌细胞,实验分组为阴性对照 siRNA组、 TGF-β1+阴性对照 siRNA组、 TGF-β1+SRF- siRNA组。划痕实验检测细胞迁移能力;免疫细胞化学染色法检测 E-钙黏蛋白( E-cadherin)的表达;蛋白质印迹法检测 E-钙黏蛋白、 SRF、N-钙黏蛋白( N-cadherin)、 α-平滑肌肌动蛋白( α-smooth muscle actin,α-SMA)蛋白的表达。结果与阴性对照 siR- NA组细胞迁移百分比( 10.00±2.00)%相比较, TGF-β1+阴性对照 siRNA组细胞迁移百分比为( 50.67±4.73)%,迁移能力增强;与 TGF-β1+阴性对照 siRNA组相比较, TGF-β1+SRF-siRNA组细胞迁移百分比为(29.00±3.00)%,迁移能力下降,均差异有统计学意义( P＜0.001)。与阴性对照 siRNA组的 E-钙黏蛋白( 1.07±0.12)、 N-钙黏蛋白( 0.28±0.25)、 SRF(0.25±0.06)、 α-SMA(1.19±0.37)蛋白相比较, TGF-β1+阴性对照 siRNA组 E-钙黏蛋白( 0.45±0.06)表达下调,而 N-钙黏蛋白( 3.27±0.67)、 SRF(2.48±0.05)、 α-SMA(4.23±0.53)蛋白表达上调(均 P＜0.001);与 TGF-β1+阴性对照 siRNA组相比较, TGF-β1+SRF-siRNA组 E-钙黏蛋白(0.82±0.05)表达上调, N-钙黏蛋白( 1.31±0.13)、 SRF(1.46±0.16)、 α-SMA(2.60±0.28)蛋白表达下调(均 P＜0.001)。结论基因沉默 SRF能够抑制 TGF-β1介导的食管癌细胞发生 EMT。     

转化生长因子β_2对人视网膜色素上皮细胞间质转化的影响

目的研究转化生长因子(TGF)-β_2对人视网膜色素上皮细胞间质转化的影响。方法体外培养的ARPE-19细胞,经不同浓度的TGF-β_2(0、1、5、10ng/mL)处理24h后,免疫荧光染色观察细胞形态学改变;Transwell小室观察细胞迁移能力的变化;实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白质印迹法(Western blotting)方法检测上皮细胞标记物E-cad及间质细胞标记物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)及Ⅰ型胶原蛋白(Col-Ⅰ)的基因及蛋白表达量。结果随着TGF-β_2浓度的增加,鬼笔环肽免疫荧光染色发现细胞的丝状伪足增多,并且细胞内的应力纤维也变得粗壮而且排列有序;Transwell小室结果显示:跨膜细胞数随TGF-β_2浓度增加而逐渐增加,组间差异有统计学意义(F=37.45,P<0.05);E-cad mRNA和蛋白的表达随TGF-β_2的浓度增加逐渐下降,组间差异有统计学意义(P均<0.05);α-SMA、FN及Col-Ⅰ的mRNA和蛋白的表达随TGF-β_2浓度的增加而逐渐增高,组间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论TGF-β_2可能通过促进RPE细胞发生EMT,导致Ⅰ型胶原蛋白和纤维连接蛋白等细胞外基质大量沉积,从而在增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的发病过程中发挥重要作用。