基于PCR技术可视化鉴别金钱白花蛇方法的建立

目的 基于聚合酶链式反应(PCR)技术,利用核酸扩增产物,建立一种可以快速鉴定金钱白花蛇中药材真伪的可视化试纸条检测方法。方法 提取金钱白花蛇、赤链蛇及市售样本的基因;根据mtDNA Cytb序列进行对比分析,设计1对特异性鉴别引物,进行修饰物标记;建立鉴别PCR反应体系,使用核酸扩增产物,利用可视化试纸条对市售样本进行真伪鉴定。结果 鉴别引物可将正品金钱白花蛇中药材扩增出500~600 bp之间的特异性条带,而伪混品则不出现相应的特异性条带;可视化试纸条对市售样本进行检测,鉴别效果良好,灵敏度高,可准确鉴定中药材真伪。结论 可视化试纸条可以快速鉴别金钱白花蛇中药材真伪,稳定性高、特异性强,可应用于市场出售金钱白花蛇中药材的鉴定。     

基于特异性PCR的梅花鹿茸和马鹿茸区分

目的:开发及验证梅花鹿和马鹿茸的特异性聚合酶链式反应(PCR)筛选方法。方法:采集梅花鹿茸、马鹿茸、鹿茸混淆品、香港市场流通的鹿类产品、非鹿科动物、植物和真菌类样品。对鹿类线粒体基因组进行排序,设计及筛选特异性引物,采用特异性PCR对样品进行区分,并进行条件优化和方法学验证。结果:共收集77份样品,对87份线粒体基因组DNA排序并设计9个特异性引物组合。经验证后,CNIP-f/CNIP-r和CELA-f/CELA-r分别选作梅花鹿和马鹿的特异性引物组合,通过PCR可获得223 bp的梅花鹿和248 bp的马鹿特异性条带,作为区分梅花鹿茸和马鹿茸的依据。结论:该方法能作为中药鉴别的补充方案,用于质量控制中涉及动物制品的种属,进一步完善鹿茸饮片鉴别体系。     

鹿茸线粒体DNA的指纹鉴定研究

 目的 通过鹿茸特异性引物鉴别和随机扩增多态DNA(RAPD)鉴别的比较,选择一种更简便的方法用于鉴别鹿茸。 方法 采用盐析法从梅花鹿茸、马鹿茸、驯鹿茸、市售鹿茸等样品中抽提线粒体DNA,并应用试剂盒进行纯化。进行特异性引物扩增和序列测定,同时进行随机扩增多态DNA扩增。结果 梅花鹿茸,马鹿茸,驯鹿茸以及部分市售鹿茸经特异性引物扩增后均可在琼脂糖凝胶中显示313 bp片段,只是条带亮度不同。而其余市售鹿茸无扩增条带; 随机扩增多态DNA不仅有效显示阳性与阴性的DNA扩增结果,而且对梅花鹿茸,马鹿茸,驯鹿茸的聚合酶链反应产物的差异,以不同的条带数目和条带亮度得以验证。结论 随机扩增多态DNA鉴别鹿茸真伪的方法更准确快捷,通过随机扩增多态DNA扩增后主条带与梅花鹿茸或马鹿茸扩增的条带大小和亮度一致,则为正品;如不一致,则为《中国药典》规定外的鹿茸或其他混淆品。这种方法对于筛选、甄别市售动物中药材,特别是名贵中药具有广阔的应用前景。     

应用多重PCR技术鉴别3种肾源性中药的实验研究

目的 建立一种应用多重聚合酶链式反应(PCR)技术鉴别3种肾源性药品的方法。方法 提取梅花鹿、驴、犬3个物种肾组织的基因组DNA,通过多重PCR对梅花鹿、驴、犬的特异性片段进行扩增,鉴别样品中是否含有梅花鹿、驴、犬3种动物源性成分。结果 通过对特异性片段的PCR扩增,可同时将梅花鹿、驴、狗的肾与其他物种进行区分。结论 本研究建立了一种基于多重PCR技术的快速、准确的同时鉴别梅花鹿、驴、犬3个物种肾源性药品方法,为解决药用性产品易混、难以鉴定的问题提供了又一个新方法。     

分子鉴定技术在中药中的应用

对近些年来兴起的分子鉴定技术进行了分析总结,主要包括随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增性简单序列重复(ISSR)、限制性内切酶切片段长度多态性(RFLP)、扩增限制性内切酶片段长度多态性(AFLP)、单核苷酸多态性(SNP)、DNA条形码序列分析等技术。从中药材真伪鉴定、中药材正品与替代品鉴定、中药材多基原鉴定和遗传多样性、中药材产地鉴别、中药材年限鉴别5个方面对分子鉴定技术在中药中的应用进展进行了归纳总结,阐述了分子鉴定技术存在的一些问题及其未来的发展方向。     

中药材鉴定运用分子标记技术的实践探寻

中药鉴定方法可分为现代鉴定和传统鉴定,其中现代鉴定中分子标记技术得到长足发展,分子标记技术主要包括:扩增性简单序列重复、随机扩增多态性、限制性内切酶且片段长度多态性等技术分类。分子鉴定技术在中药材真伪、正品与替代品、遗传多样性和基原鉴定、产地鉴别、年限鉴别等方面可进行鉴别。此文对分子标记技术在中药鉴别中应用进行总结,阐述分子鉴定技术存在的问题及发展趋势。     

基于PCR-核酸试纸条快速鉴定鹿茸及其伪品的实验研究

目的 通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)与核酸试纸条相结合的方法,实现鹿茸真伪的可视化检测。方法 采用十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate, SDS)碱变性法提取正品及伪品鹿茸样品基因组DNA,通过查找细胞色素C氧化酶亚基I(COI)特异性位点,应用Primer 3.0软件设计鹿茸特异引物,摸索PCR最佳反应体系及条件,建立PCR-核酸试纸条及琼脂糖凝胶电泳鉴定鹿茸真伪的最优条件。同时,通过克隆测序,验证鹿茸真伪鉴定的准确性。结果 本实验中正品鹿茸在PCR-核酸试纸条上均出现两条带,阴性对照及伪品出现一条带,与琼脂糖凝胶电泳结果吻合,且试纸条检测的灵敏度可达1 ng·μL^-1。对9个市售鹿茸样品检测,正品鹿茸5个,合格率为45%。结论 自主构建的PCR-核酸试纸条检测方法简单、快速、特异性较好,可在较短时间内实现鹿茸真伪的可视化检测,检测结果稳定,为中药材鉴定提供又一新的方法。     

中药材鹿茸的分子分类学鉴定研究

目的 建立中药材鹿茸的分子分类学鉴定试剂盒。方法 根据对不同产地的梅花鹿、马鹿线粒体DAN进行PCR扩增和序列测定，并与亲缘关系较近的伪充药材来源动物线粒体DNA同位置序列比较，找到鹿的特征片段，经过实际经验，筛选出适合片段作为鹿的种属特异性PCR引物。结果 该引物与相关试剂组成试剂盒后，可用于中药材鹿茸与伪充药材的鉴别。结论 用分子分类学方法鉴别中药材鹿茸，具有科学、稳定、准确、简便等特点，值得推广。     

基于细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ序列位点特异性聚合酶链反应鉴别鹿茸及其伪品

目的:基于细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)序列建立一种新的PCR鉴定方法,以快速鉴别出梅花鹿、马鹿茸片与驯鹿茸片。方法:采集不同来源的鹿茸片共60批。通过比较梅花鹿、马鹿与驯鹿等其他伪品的COⅠ基因序列差异,根据SNP鉴别位点设计梅花鹿茸、马鹿茸同驯鹿茸的鉴别引物Cne-F、Rt-F、Co-R,并对影响聚合酶链反应(PCR)结果的主要因素变性时间、退火温度、退火时间、延伸时间等进行方法学考察和优化。结果:该实验构建的双位点特异PCR鉴别体系,基于COⅠ的鉴别位点,可通过PCR扩增获得294 bp的梅花鹿、马鹿特异片段,而产生514 bp的驯鹿特异片段,伪品及阴性对照无条带。结论:该实验建立对梅花鹿、马鹿及驯鹿等其他伪品鹿茸的PCR鉴别方法简便、可靠。     

位点特异性PCR方法的建立及对近源种鹿茸药材的鉴别研究

目的:针对正品鹿茸与近源种鹿茸药材饮片鉴别的难点,建立一种简便、快速、准确的近源种鹿茸药材分子鉴别方法.方法:根据鹿科鹿属种动物cytb全序列比对分析,设计1对能准确鉴别正品鹿茸(包括梅花鹿和马鹿)和其他近源种鹿茸的引物,在此基础上建立鹿茸药材位点特异性PCR鉴别方法,并对影响PCR结果的主要因素退火温度、Taq用量、循环次数以及模板用量和重复性等进行方法学考察和优化.结果:在方法学考察的基础上,在μL PCR反应体系,退火温度为65℃的条件下,能准确扩增出约323 bp大小的阳性DNA条带,经测序验证结果表明,系正品鹿茸原动物的Cytb基因序列片段,而伪品鹿茸未扩增出条带.结论:所建立的位点特异性PCR方法,能将正品鹿茸与其他近源种鹿茸药材鉴别开来,具有较高的特异性、重复性,可广泛应用于鹿类药材的鉴别.     

鹿血的PCR-RFLP鉴定研究

目的建立鹿血聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)种间及种内鉴定方法并确定检测限度。方法根据梅花鹿、马鹿、猪、牛、羊、鸭的细胞色素b(cytb)基因序列的差异,设计并选取DNA限制性内切酶Eco RV和Mse I分别作为区分鹿和非鹿,梅花鹿和马鹿的工具。采用试剂盒法提取样品基因组DNA,经PCR扩增cytb片段后,分别进行RFLP分析;在梅花鹿血基因组DNA中分别加入不同比例非鹿类动物血基因组DNA或马鹿血基因组DNA,PCR产物用限制性内切酶Eco RV和Mse I进行切割,确定检测限。结果经PCR-RFLP分析,Eco RV切割鹿和非鹿cytb片段,前者得到2个片段(287、185 bp),后者未被切割;Mse I切割梅花鹿与马鹿cytb片段,前者被切成2个片段(281、191 bp),后者被切成3个片段(281、126、65 bp),191 bp的片段作为梅花鹿血的特征片段,126 bp的片段作为马鹿血的特征片段。梅花鹿血中加入非鹿类动物血基因组DNA的检测限为3%,加入马鹿血基因组DNA的检测限为6%。结论建立的PCR-RFLP方法可以快速鉴定鹿血及相关伪品或掺伪品,也可区分鉴定梅花鹿源的鹿血或马鹿源的鹿血,为鹿血相关产品的质量控制提供了新的技术手段。     

鹿鞭的微量DNA提取及序列鉴定

采用微量DNA提取技术,从梅花鹿血、毛、鹿鞭、鹿茸、牛鞭、驴鞭中提取DNA,以线粒体DNA细胞色素b通用引物L14841和H15149扩增约307bpDNA片段,扩增产物纯化后采用双脱氧链终止法测定其序列。结果证明:梅花鹿毛、血和鹿鞭的DNA序列完全一致;而所谓的“鹿茸”则与其有较大的差异。用所测序列以简约法PAUP3.1.1程序构建的分子系统树与传统分类系统相吻合。说明此方法鉴定鹿鞭是科学而准确的。     

六种鹿茸茸毛的显微特征比较鉴别

目的:观察6种鹿茸茸毛的显微特征,对不同品种的鹿茸进行比较鉴别。方法:利用光学显微镜对6种鹿茸茸毛的显微特征进行了观察与测量,实验数据用SPSS 13.0软件统计分析。结果:6种鹿茸茸毛的颜色、毛体形态、毛尖顶端形状、髓质形态、毛长、毛尖无髓质长、毛干直径、髓质直径、髓质指数之间存在显著性差异(P<0.05)。结论:鹿茸茸毛的显微特征可为鹿茸的鉴别提供一种简便、快速的新方法,为鹿茸的质量评价提供参考依据。     

基于化学指纹图谱和多指标成分含量测定的梅花鹿鹿茸质量评价

目的采用高效液相色谱法建立鹿茸中核苷类成分指纹图谱,进行聚类分析与主成分分析,并比较梅花鹿鹿茸药材中6种核苷成分的差异。方法采用高效液相色谱法对15批不同产地梅花鹿鹿茸进行测定,以甲醇-0.07%冰醋酸为流动相梯度洗脱,流速1 mL·min^-1,检测波长为254 nm。运用国家药典委员会"中药色谱指纹图谱相似度评价软件"2012版进行评价,并对6种核苷类成分进行含量测定。结果建立了鹿茸核苷类成分HPLC指纹图谱,确定了6个共有峰构成鹿茸药材的特征峰,且方法学考察达到标准。结论该法所建立的鹿茸核苷类指纹图谱特征性强、方法简便,结合6种核苷类成分含量测定可更好控制其质量,对梅花鹿鹿茸的鉴定及质量控制具有指导意义和参考价值。     

鹿角与鹿角脱盘显微鉴定研究

目的:利用显微特征参数,分析比较鹿角与鹿角脱盘显微结构差异,为鹿角粉与鹿角脱盘粉鉴别,以及两者质地差异性提供显微结构基础。方法:采用光学显微镜观察鹿角脱盘、鹿角及鹿骨粉末显微特征,并测定和比较三者的骨陷窝长/短径比值和骨陷窝面积占比显微特征数。结果:鹿角脱盘骨陷窝长/短径比值为2.04~2.38、骨陷窝面积比为35.04%~45.82%;鹿角的骨陷窝长/短径比值为1.69~2、骨陷窝面积比为40.60%~61.77%;鹿骨骨陷窝长/短径比值为1.54、骨陷窝面积比为71.8%。结论:鹿角、鹿角脱盘及鹿骨中三者显微鉴定参数均具有明显的差异性;表明骨陷窝长/短径比与骨陷窝面积比,不仅可作为鹿角与鹿角脱盘显微鉴定参数;也阐释了鹿角脱盘角质地比鹿角更为坚硬的组织结构基础,即随着骨陷窝形态由圆变长、骨陷窝面积比降低,其骨化程度增加、质地更加坚硬。     

΢�������С��ѧϰ�����Ӱ�켰¹�׶��ĵĸ�Ԥ�о�

??OBJECTIVE To investigate the effects of microwave radiation on learning and memory abilities in mice,and to study pilose antler peptide??s intervention. METHODS Fifty mice were divided into five groups randomly, designated as control group, radiation group, pilose antler peptide (25, 50, and 100 mg??kg^-1) groups. Learning and memory impairment model in mice was established by microwave radiation of 2 450 MHz average surface power, 10.0 mW??cm^-2 for 90 min every day for 28 d .The radiation rats were treated with low-, mid-, and high-dose (25, 50, and 100 mg??kg^-1) pilose antler peptide by sc injection for 28 d. The learning and memory ability of mice was determined by avoiding darkness experiment and Y maze experiment.The contents of S100B, tumor necrosis factor-??(TNF-??), interleukin-10(IL-10), malondialdehyde (MDA), and nitric oxide(NO) in the brain of mice were determined respectively after the behavioral experiments. RESULTS Compared with control group, radiation group could shorten the latency of avoiding darkness experiments, increase the numbers of errors both in avoiding darkness experiment and in Y maze experiment. Radiation group could rise the contents of S100B ,TNF-??, IL-10, MDA and NO in the brain of mice (P<0.05 or P<0.01). Compared with radiation group, pilose antler peptide (50, 100 mg??kg^-1) groups could lengthen the latency of avoiding darkness experiments, significantly shorten the numbers of errors both in avoiding darkness experiment and in Y maze experiment, and reduce the contents of S100B ,TNF-??, MDA and NO, increase the content of IL-10 in the brain of mice (P<0.05 or P<0.01). CONCLUSION Pilose antler peptide could significantly perfect the learning and memory ability of mice exposed to microwave radiation. The mechanism may be related to its anti-oxidative actions by anti-inflammatory action , further lowering neurotoxic effects of NO.     

鹿源类中药材DNA序列分析及马鹿和梅花鹿的PCR鉴定

目的采用特异引物PCR扩增鉴定马鹿和梅花鹿源中药材。方法从马鹿、梅花鹿等国内11种鹿的鹿血和鹿茸中提取DNA,用通用引物L1091和H1478调取细胞线粒体12SrRNA基因片段,在该片段核苷酸序列比对的基础上,设计马鹿和梅花鹿高特异性PCR鉴定引物对,并进行PCR特异性鉴定。结果12SrRNA基因片段能较好地在种的水平上将不同的种区分开来;特异引物对(EP-1/H1478和EP-2/H1478)PCR可准确地鉴定出马鹿和梅花鹿等。结论特异引物PCR适宜马鹿、梅花鹿等珍贵中药材的鉴定。