Eaf2基因调控microRNA抑制白内障发生的机制研究

目的探讨Eaf2基因敲除小鼠中micro RNA的表达情况,以及Eaf2基因对人晶状体上皮细胞凋亡及晶状体内micro RNA表达的影响。方法利用Lipofectamine 2000瞬时转染p EGFP-C1-Eaf2质粒过表达Eaf2基因,利用流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化,利用Real time q-PCR方法检测人晶状体上皮细胞中micro RNA的表达情况;利用Real time q-PCR方法检测Eaf2基因敲除小鼠micro RNA的表达情况。结果 p EGFP-C1-Eaf2质粒转染组细胞凋亡率显著低于对照组,mi R-125b、let-7a的表达显著高于对照组,而mi R-204的表达显著低于对照组;Eaf2基因敲除小鼠mi R-125b、let-7a的表达显著低于对照组,而mi R-204的表达显著高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 Eaf2基因可能通过调控micro RNA的表达抑制人晶状体上皮细胞凋亡,从而在白内障发生中发挥晶状体保护作用。     

组成型αB晶体蛋白在热休克蛋白核转录因子1敲除小鼠心肌中的表达(英)

目的:了解热休克蛋白核转录因子1(HSF1)对小鼠心肌组成型αB晶体蛋白(αB-Crystallin,αBC)表达的影响。方法:用western blot和免疫组织化学的方法,测定组成型αBC在HSF1基因野生型(hsf1+/+)和HSF1基因敲除型(hsf1-/-)小鼠心肌中的表达。结果:αBC在hsf1-/-和hsf1+/+小鼠心肌表达量分别为68.42±4.16和100.00±7.58(心肌可溶性组分,P<0.05),20.35±1.01和37.55±1.91(心肌不可溶性组分,P<0.05);免疫组化显示αBC在hsf1-/-心肌细胞内的表达信号较hsf1+/+明显减弱。结论:HSF1基因是介导组成型αBC基因表达重要的、但不是惟一的因子。     

从基因敲除小鼠心肌组织中筛选热休克反应中受HSF1调控的靶基因

目的：用cDNA芯片从热休克转录因子1（HSF1）基因敲除小鼠心肌组织中筛选热休克反应受HSF1调控的靶基因。方法：用cDNA芯片检测热休克反应（42℃ 15 min,恢复3 h）中HSF1 / 小鼠心肌组织基因表达谱的改变(以HSF1+/+小鼠为对照);用RT PCR对cDNA芯片筛选结果进行验证;对差异表达的已命名基因进行启动子区转录因子结合位点的分析。结果：共筛选到差异表达基因1 142个;其中在HSF1 / 小鼠心肌中表达下调的基因为398个,已命名基因为173个;在HSF1 / 小鼠心肌中表达上调的基因为641个,已命名基因为235个。在HSF1 / 小鼠心肌中表达下调2.5倍的已命名基因中,有5个基因启动子区含有热休克元件（HSE）;在HSF1 / 小鼠心肌中表达上调2.5倍的已命名基因中,有6个基因启动子区含有HSE。结论：在热休克反应中,HSF1可对多个基因的表达进行直接或间接的调控。     

Vimentin基因敲除HIV-1 gp120转基因小鼠模型的构建

目的 构建波形蛋白（VIM）基因敲除和gp120转基因（gp120 Tg）小鼠模型。方法 将VIM基因敲除小鼠（VIM-/-）和gp120 Tg小鼠杂交（F0代）,然后在产生的子代（F1）中,取分组为VIM+/-/gp120Tg的小鼠一公一母杂交,得到基因型分别为VIM+/+、 VIM+/-、VIM-/-和VIM+/+/gp120 Tg、VIM+/-/gp120 Tg、VIM-/-/gp120 Tg的6组小鼠。其中VIM+/+、VIM-/-、VIM+/+/gp120Tg和VIM-/-/ gp120这4组小鼠互为对照。用PCR法鉴定这上述6组小鼠的基因型,免疫印迹法检测小鼠脑组织中VIM和gp120的表达情况。结果 4组基因型VIM+/+、VIM-/-、VIM+/+/gp120Tg和VIM-/-/gp120Tg小鼠的PCR结果符合预期,免疫印迹结果显示VIM-/-/ gp120Tg小鼠VIM无表达,gp120过表达（P<0.001）,符合预期结果。结论 成功构建了VIM基因敲除gp120转基因小鼠模型,为深入研究波形蛋白在gp120神经毒性作用中的作用机制提供了坚实的研究基础。     

组成型αB晶体蛋白在热休克蛋白核转录因子1敲除小鼠心肌中的表达

目的:了解热休克蛋白核转录因子1(HSF1)对小鼠心肌组成型αB晶体蛋白(αB-Crystallin,αBC)表达的影响.方法:用western blot和免疫组织化学的方法,测定组成型αBC在HSF1基因野生型(hsf1+/+)和HSF1基因敲除型(hsf1-/-)小鼠心肌中的表达.结果:αBC在hsf1-/-和hsf1+/+小鼠心肌表达量分别为68.42±4.16和100.00±7.58(心肌可溶性组分,P＜0.05),20.35±1.01和37.55±1.91(心肌不可溶性组分,P＜0.05);免疫组化显示αBC在hsf1-/-心肌细胞内的表达信号较hsf1+/+明显减弱.结论:HSF1基因是介导组成型αBC基因表达重要的、但不是惟一的因子.     

NF-κB通过调控早期反应基因-2参与小鼠肝再生启动

目的结合基因芯片技术、生物信息学分析和染色质免疫共沉淀技术分析小鼠肝再生启动阶段的差异表达基因,并探讨其调控方式。方法采用小鼠全基因组基因表达谱芯片检测并验证肝再生启动阶段2组差异表达基因;应用基于TRANSFAC数据库的PAINT对差异表达基因进行转录调控分析;最后运用染色质免疫共沉淀技术验证NF-κB的潜在靶基因。结果肝切后4 h小鼠差异表达基因共332个(上调127个,下调205个),其中早期反应基因-2(immediate earlyresponse 2,IER2)上调约5倍;对所有差异表达基因进行PAINT分析,预测到多个转录因子如Stat家族和NF-κB均参与差异表达基因调控网络;免疫共沉淀技术证实IER2受NF-κB调控。结论NF-κB可能通过调控IER2参与肝再生启动。     

肌节同源盒基因同系物2对小鼠晶状体发育的影响

目的 观察肌节同源盒基因同系物2(Msx2)表达缺失后晶状体早期发育过程的变化,探讨Msx2对晶状体早期发育的影响.方法 利用Msx2基因敲除小鼠胚胎,采取组织学染色及免疫组织化学方法 观察晶状体发育过程中的异常变化及细胞增殖情况.结果 Msx2基因敲除后,晶状体的发育受到明显的抑制,晶状体早期发育迟缓,晶状体与角膜组织分离延迟.同时Msx2表达缺失使晶状体细胞溴脱氧尿核苷(BrdU)标记比例下降.结论 Msx2基因敲除小鼠晶状体发育出现异常,晶状体发育异常的原因之一是晶状体发育过程中晶状体上皮细胞细胞增殖受到抑制.     

HSF1调控的炎症相关基因的筛选及SOCS3基因的实验验证

目的：筛选热休克因子1（HSF1）调控的炎症相关基因,初步探讨HSF1对下游基因的调控作用。方法：采用HSF1基因敲除小鼠,制备内毒素腹腔注射以及热休克反应后再给予内毒素腹腔注射的内毒素血症模型,分别抽提HSF1缺失突变纯合子和HSF1野生型小鼠肺组织总RNA,用微阵列进行筛选;用转录元件搜索软件分析差异表达基因的启动子区;选取启动子区含有热休克元件的基因：细胞因子信号转导抑制子3（SOCS3）,采用热休克反应（HSR）和HSF1过表达的RAW264,7巨噬细胞给予内毒素刺激,抽提总RNA进行RT—PCR,Northern印迹实验,观察HSR和HSF1过表达对内毒素诱导的SOCS3基因表达的影响。结果：用微阵列的方法筛选到HSF1可能抑制表达的炎症介质基因15个,其中9个基因的启动子区含有热休克元件;HSF1可能促进表达的炎症介质基因11个,其中8个基因的启动子区含有热休克元件;HSR和HSF1过表达可明显抑制小鼠RAW264．7巨噬细胞内毒素诱导的SOCS3mRNA的表达。结论：HSF1可抑制炎症介质SOCS3mRNA的表达。     

诱导型热休克蛋白在对小鼠缺血性急性肾衰的保护作用

目的：采用HSF1基因敲除小鼠模型探讨诱导型热休克蛋白（HSP）对小鼠缺血性急性肾衰的保护作用。方法：野生型及HSF1基因敲除小鼠经钳夹左右两肾肾蒂30min以阻断肾动脉血流，松开钳夹24h后聚血测定尿素氮（BUN）及血清肌酐浓度；部分动物于肾缺血－再灌注前24h进行热休克处理（肛温42℃，15min）以诱导各种HSP的表达。结果：肾缺血－再灌注导致BUN及血清肌酐浓度明显升高，HSF1基因敲除导致二者上升更加明显。热休克预处理使野生型及杂合子小鼠肾中HSP70，HSP90α及HSP25表达明显升高，并明显减轻了因－再灌注所致BUN及血清肌酐浓度的升高。HSF1基因敲除废除了热休克所致的HSP诱导表达及其对缺血性急性肾衰的保护作用。结论：诱导型HSP在保护缺血所致的小鼠急性肾衰中发挥重要作用。     

Claudin-7—潜在的抑癌基因

目的分析Claudin-7基因敲除后小鼠表型及Claudin-7潜在的抑癌功能。方法将小鼠分为2组,Claudin-7基因敲除组及野生型组,每组各15只,分别采用PCR鉴定小鼠基因型,HE染色观察Claudin-7基因敲除后各脏器的组织病理学变化;免疫共沉淀(CO-IP)检测Claudin-7与intergrinα2相互作用;蛋白印迹技术检测Claudin-7在小鼠不同脏器及C-fos、C-jun、Cox-2蛋白在小鼠肠道中表达,同时检测Claudin-7在人不同分化大肠癌及肝转移组织中的表达情况,分正常人大肠组织、高分化大肠癌组织、低分化大肠癌组织及大肠癌肝转移组织4组,每组20例患者。结果 Claudin-7基因敲除小鼠自出生后第4 d左右停止生长,7 d左右死亡;HE染色以肠道病理变化最为显著,表现为黏膜上皮细胞严重脱落、空泡形成、并有炎性反应细胞浸润,其他脏器病理变化显示除有轻微的中性粒细胞浸润外未见明显的组织损伤;Claudin-7在肠道、胃、肺、膀胱、皮肤、胸腺、肾脏脏器中均有表达,小肠和大肠广泛强表达;Claudin-7和intergrinα2免疫共沉淀,C-fos、C-jun及Cox-2蛋白表达在Claudin-7基因敲除小鼠肠道中显著高表达(P<0.001);Claudin-7蛋白表达随大肠癌的分化降低而降低,在大肠癌肝转移组织中表达显著降低(P<0.001),差异有统计学意义。结论 Claudin-7基因敲除可诱导严重的肠道炎性反应,Claudin-7可能为潜在的抑癌基因。     

食管鳞癌中转录因子IRF4对miR-133b表达的调控作用研究

目的 食管鳞癌中miR-133b通过调控EGFR/ITGB4/FAK信号通路,发挥抑制肿瘤增殖、侵袭、转移的作用。但目前对于miR-133b的上游调控机制尚不完全清楚,故展开探索。 方法 采用生信分析预测参与调控miR-133b表达的上游转录因子;采用qRT-PCR、Western blotting验证转染IRF4过表达质粒对IRF4和miR-133b在转录和蛋白水平表达的影响;采用染色质免疫共沉淀技术确认IRF4与miR-133b的相互作用;双荧光素酶报告基因实验验证IRF4对miR-133b表达的调控作用机制。 结果 使用ConTra V3预测发现转录因子IRF4能够与miR-133b结合;qRT-PCR、Western blotting实验证实转染IRF4过表达质粒可显著上调IRF4在mRNA(t=-18.950,P=0.010)和蛋白水平的表达(t=-4.061,P=0.042),并促进miR-133b的表达(t=-8.681,P=0.005);染色质免疫共沉淀实验(引物1:t=-17.391,P=0.003;引物2:t=-14.421,P=0.004)和双荧光素酶报告基因实验(t=-22.112,P=0.010)证实转录因子IRF4可直接靶向作用于miR-133b。 结论 验证IRF4对miR-133b的直接靶向调控作用,有助于构建miR-133b的信号调控网络,为食管鳞癌的诊疗提供新靶点。      

热休克因子1及热休克蛋白对慢性心理应激鼠工作记忆的保护作用

目的采用HSF1基因敲除小鼠模型探讨热休克因子1及热休克蛋白(heat shock prote in,HSP)在慢性心理应激中对工作记忆的保护作用。方法将热休克因子1(heat shock factor 1)基因野生型小鼠(HSF1 / )和热休克因子1基因敲除小鼠(HSF1-/-)暴露于2个月的慢性心理应激,部分小鼠在暴露于心理应激前给予热休克预处理,2个月后采用T迷宫检测各组小鼠工作记忆,western b lots检测和比较HSP72,HSP25表达,采用单因素方差分析和多因素析因设计方差分析对各组小鼠T迷宫转换正确数和HSP72,HSP25表达进行比较。结果HSF1基因野生型小鼠中,慢性心理应激对T迷宫转换正确数(8.90±0.46)次与对照组(9.58±0.48)次没有明显影响(F(1,65)=0.23,P>0.05),HSF1基因敲除小鼠中,慢性心理应激引起T迷宫转换正确数(4.00±0.26)次明显低于对照组(7.33±0.43)次,F(1,65)=32.39,P<0.05)。同时野生型小鼠心理应激后海马组织中HSP72表达(1.35±0.11),HSP25表达(1.05±0.03)明显高于HSF1基因敲除小鼠(0.23±0.03),(0.26±0.02),均P<0.05)。热应激也诱导HSP72(1.71±0.05),HSP25(1.33±0.05)表达增加,明显高于HSF1基因敲除小鼠[(0.26±0.03),(0.23±0.08),均P<0.05],但未发现热应激预处理对T迷宫转换正确数有影响(F(1,65)=0.32,P>0.05)。结论HSF1以及慢性心理应激诱导的HSP72,HSP25表达,在慢性心理应激中对工作记忆具有保护作用。     

α晶状体蛋白与白内障的研究进展

晶状体是人体内蛋白含量最高的组织结构。白内障被认为是一种构象性疾病,当α晶状体蛋白受到氧化损伤,晶状体蛋白错误折叠增多,加剧蛋白质变性、聚集和光散射,这可能是白内障发生的关键环节。α晶状体蛋白分子伴侣活性保护因子的发现,将对白内障发病机制和临床治疗研究开辟新领域。本文综述了近年来对α晶状体蛋白结构功能,表达部位及分子伴侣活性影响因素的研究。     

m6A识别蛋白Ythdf3在精子发生中的作用研究

目的：通过基因敲除模型研究N6?甲基腺嘌呤（m6A）识别蛋白Ythdf3在小鼠精子发生过程的调控作用。方法：利用CRISPR/Cas9技术构建Ythdf3基因敲除小鼠,通过免疫荧光和HE染色对敲除小鼠进行表型分析,研究Ythdf3在调控小鼠精子发生过程中的作用。结果：免疫组化染色显示Ythdf3在精原及各级生精细胞核中均有表达;成功构建Ythdf3基因敲除小鼠模型;HE染色显示Ythdf3敲除小鼠睾丸各级生精时相及附睾尾精子与对照相比无明显异常。结论：在正常生理条件下,敲除Ythdf3不影响雄性小鼠精子发生。     

受体酪氨酸激酶Axl调控糖蛋白Ⅵ介导的血小板活化

目的研究生长静止特异性基因6的受体Axl对胶原蛋白受体糖蛋白Ⅵ介导的血小板活化的调控作用。方法利用Axl基因敲除小鼠和糖蛋白Ⅵ特异性刺激剂,在体外分别研究血小板的聚集和铺展功能,并应用流式细胞术检测血小板的颗粒释放和整合素αⅡbβ3的活化。结果与野生型小鼠相比,Axl基因敲除小鼠的血小板聚集和铺展功能受到明显抑制;流式细胞术检测结果表明,Axl敲除的血小板的颗粒释放标记物CD62P的表达明显降低（P〈0.05）,整合素αⅡbβ3的活化同样受到明显抑制（P〈0.05）。结论生长静止特异性基因6的受体Axl在糖蛋白Ⅵ介导的血小板活化中发挥重要的调控作用。     

氯通道蛋白-3在透明晶状体和老年性白内障患者晶状体上皮细胞中的表达

目的研究透明晶状体和老年性白内障患者晶状体上皮细胞氯通道蛋白-3（chloride channel protein 3，CLC-3）的表达。方法随机收集40例老年性白内障手术患者和5例透明晶状体（来自晶状体脱位患者）的晶状体前囊膜，采用免疫组织化学染色和免疫荧光技术检测晶状体上皮细胞CLC-3的表达。结果CLC-3阳性表达于晶状体上皮细胞的细胞膜。老年白内障组40张切片中，CLC-3表达均为阳性。而透明晶状体组5张切片中，4张阴性，1张可疑阳性。计算机图像分析结果，透明晶状体组平均吸光度（A）值明显低于老年白内障组，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论老年性白内障患者晶状体上皮细胞CLC-3表达阳性。CLC-3可能参与老年性白内障的形成。     

MAPK相互作用蛋白激酶1对心肌细胞炎症的作用

目的 于在体水平和离体水平研究MAPK相互作用蛋白激酶1对心肌细胞炎症的作用。方法 应用MAPK相互作用蛋白激酶1基因敲除小鼠和C57 BL/6野生型小鼠,行主动脉缩窄术,于术后4周取材。应用免疫荧光染色,检测心肌组织中P-NF-κBp65在心肌细胞中的核转位。应用Western blot法检测心肌组织中P-NF-κBp65和TNF-α。应用Mnk1 shRNA腺病毒转染技术,降低H9c2细胞中Mnk1的表达,给予血管紧张素Ⅱ刺激48h。应用免疫荧光染色,检测H9c2细胞中P-NF-κBp65的核转位。应用RT-PCR检测H9c2细胞中TNF-α mRNA的表达。结果 在体实验表明,主动脉缩窄术后4周,与野生型小鼠相比,MAPK相互作用蛋白激酶1基因敲除小鼠心肌组织中P-NF-κBp65在心肌细胞中的核转位明显增多,TNF-α和P-NF-κBp65的蛋白表达明显增加。离体实验表明,MAPK相互作用蛋白激酶1表达降低的H9c2细胞中P-NF-κBp65的核转位明显增多,TNF-α mRNA的表达明显增加。结论 MAPK相互作用蛋白激酶1基因缺失促进压力负荷诱导的小鼠心肌组织炎症,其表达降低可促进血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞炎症。     

αB-晶状体蛋白基因rs14133G/C和rs2070894G/A多态性在广西西部人群中的分布

目的检测中国广西西部人群αB-晶状体蛋白(CRYAB)基因rs14133 G/C和rs2070894 G/A位点多态性,并探讨中国广西西部人群αB-晶状体蛋白基因多态性与其他4个种族人群的差异。方法通过聚合酶链式反应结合单碱基延伸技术和DNA测序方法检测199名广西西部健康人CRYAB基因rs14133 G/C和rs2070894 G/A位点基因型,并与国际人类基因组单倍型图谱计划公布的欧洲人、非洲人、日本人、中国北京人的CRYAB基因多态性进行对比。结果在199名广西西部健康人中,男女性组间CRYAB基因rs14133 G/C位点、rs2070894 G/A位点的基因型和等位基因型频率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。中国广西西部人群和欧洲人相比,CRYAB基因rs14133 G/C和rs2070894 G/A位点基因型和等位基因型频率比较,差异有统计学意义(P<0.05);与非洲人、日本人、中国北京人相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 CRYAB基因多态性分布具有种群和地域差异,这种差异可能是相同疾病在不同人群中临床表现不同的原因之一。     

βB2基因敲除小鼠睾丸组织长链非编码RNA的差异性表达分析

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)在βB2基因敲除小鼠睾丸中的表达及其影响睾丸发育的可能机制.方法 采用lncRNA芯片技术,筛选野生型(WT)和βb2基因敲除(KO)小鼠睾丸组织(均n=3)中lncRNA及信使RNA(mRNA)表达谱的变化;对差异表达lncRNA和mRNA进行GO数据库分析及KEGG数据库分析,建立调控网络图;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证差异表达的lncRNA和mRNA,探讨调控通路.结果 (1)两组小鼠睾丸组织差异表达的lncRNA共140条,mRNA共477条;(2)通过GO数据库分析,筛选出差异表达lncRNA共12条,其中上调7条,下调5条;(3)经KEGG数据库进行路径分析,发现差异表达mRNA主要经由Ca2+信号、配体-受体相互作用等信号通路起作用;(4)用关联矩阵法建立了lncRNA和mRNA共表达网络图,共有17个节点,12条连接,包含9条lncRNA和8条mRNA;其中Rsl1由3条lncRNA调控,Lpo和Mpo各由2条lncRNA调控,Hdac1、Ephb4等各由1条lncRNA调控.(5) qRT-PCR分析结果表明,在βB2基因敲除小鼠睾丸组织中,lncRNA A-30-P01019163和P2rx7的表达均下调(P＜0.05).结论 lncRNA与βB2基因的晶状体外功能密切相关,其中lncRNA A-30-P01019163可能通过调控下游P2rx7 mRNA的表达影响睾丸组织细胞周期及信号转导,进而调控睾丸发育.