应用CRISPR/Cas9和Cas9⁃D10A建立Nsun5基因敲除小鼠模型并分析脱靶效应

目的：为了检测CRISPR/Cas9系统的潜在脱靶效应,分别利用野生型Cas9和切口酶Cas9?D10A构建了RNA甲基转移酶Nsun5基因敲除小鼠模型,并对两种策略得到的F0小鼠进行脱靶分析,以比较两种敲除策略的特异性。方法：针对Nsun5基因第3外显子,设计1对sgRNA,将野生型Cas9 mRNA和切口酶Cas9?D10A mRNA分别同这对sgRNA混合后注入小鼠一细胞期受精卵中,实现靶基因敲除,比较两种Cas9得到的F0代敲除小鼠的脱靶效应。结果：利用CRISPR/Cas9和Cas9?D10A成功建立Nsun5基因敲除小鼠模型,对两种Cas9得到的F0代突变小鼠进行潜在脱靶位点分析,均未检测到脱靶位点的存在。结论：两种策略都成功构建了不含脱靶位点的Nsun5基因敲除小鼠模型,为进一步研究Nsun5的生物学功能打下基础。     

应用CRISPR/Cas9技术制备MrgD基因敲除小鼠模型

目的 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立MrgD基因敲除的小鼠模型,为研究MrgD基因在糖、脂代谢中的作用提供实验工具。方法 根据MrgD基因第一外显子碱基序列,设计针对MrgD基因的sgRNA（single guide RNA）,构建sgRNA表达质粒,利用T7RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9后,将Cas9 mRNA和sgRNA对C57BL/6J小鼠的受精卵进行显微注射。使用基因测序检测MrgD基因碱基的突变情况。结果 获得了MrgD基因突变的F2代纯合子小鼠,即MrgD基因缺失173bp的小鼠。并且,初步研究显示MrgD基因纯合突变小鼠在普通饲料喂养下糖、脂代谢正常。结论 成功构建了MrgD基因敲除小鼠动物模型,为探讨MrgD基因在糖尿病发生发展中的作用提供研究平台。     

利用CRISPR/Cas9技术构建Bpi基因敲除小鼠

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术高效构建Bpi基因敲除的小鼠模型,并继续繁殖、鉴定及建立稳定遗传的Bpi基因敲除小鼠品系。方法针对C57BL/6小鼠Bpi基因的第2～3外显子两端设计敲除靶点,筛选高活性gRNA(guide RNA)靶点,体外转录得到sgRNA(small guide RNA)并与Cas9 mRNA一起显微注射到C57BL/6小鼠的受精卵内,经胚胎移植至代孕母鼠体内,获得F0代小鼠后,通过基因型鉴定和DNA测序获得基因突变的阳性子代鼠。结果筛选到高活性gRNA靶点并成功获得体外转录产物sgRNA;与Cas9 mRNA一起通过显微注射的方式获得了64枚状态良好的受精卵并成功移植到2只代孕母鼠体内;获得了22只F0代小鼠,经PCR鉴定和DNA测序后选择一只单链缺失708 bp碱基的阳性小鼠进行扩繁,并在F1、F2代检测到该突变,且F2代成功繁育出纯合子小鼠。结论成功构建Bpi基因敲除小鼠模型,为进一步研究Bpi基因及其表达产物的生物学功能奠定了基础。     

小鼠TDO2基因条件性敲除打靶载体的构建

目的 构建小鼠TDO2基因条件性敲除打靶载体,为建立TDO2基因条件性敲除小鼠奠定基础。方法 根据CRISPR/Cas9技术原理,设计并构建单链向导RNA(sgRNA)和Donor载体,以TDO2-201(ENSMUST00000029645.13)转录本的外显子3作为敲除区,在打靶基因两侧各放置一个Loxp元件,建立条件性敲除TDO2第3号外显子的条件性基因打靶载体。将CRISPR/Cas9复合体和Donor载体显微注射到C57BL/6小鼠的受精卵中,获得阳性F0小鼠,再将阳性F0代小鼠与C57BL/6小鼠交配获得F1代小鼠,并经PCR和基因测序鉴定F1代小鼠基因型。结果 结果证实所构建的TDO2基因条件性敲除打靶载体符合设计要求,成功繁育并鉴定出B6/JGpt-TDO2^em1Cflox/Gpt小鼠。结论 成功构建了小鼠TDO2基因条件性敲除打靶载体,为后续进一步构建TDO2基因条件敲除小鼠奠定了基础。     

CRISPR/Cas9系统介导Slc6a6基因敲除大鼠的繁殖与鉴定

目的利用CRISPR/Cas9技术构建牛磺酸转运体基因(solute carrier family 6 member 6,Slc6a6)敲除大鼠,繁殖并鉴定,为研究牛磺酸缺失对神经系统疾病的影响提供稳定的大鼠模型。方法针对Slc6a6基因第5外显子,设计向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)介导Cas9核酸酶与靶点DNA特异性结合,并切割基因组DNA,被切割后的DNA进行重组修复,从而实现基因的敲除。通过基因型鉴定和测序分析检测新生大鼠基因型。利用Real-time PCR、Western blot技术和免疫组化等方法,分析大鼠脑组织的牛磺酸转运体(taurine transporter,TauT)的mRNA表达和蛋白表达,建立Slc6a6基因敲除大鼠模型。结果 F3代出现21只Slc6a6基因敲除纯合子(TauT~(-/-)),54只杂合子(TauT~(+/-)),27只阴性(TauT~(+/+)),F3代纯合率约为20.59%,基本符合孟德尔遗传定律。Slc6a6基因敲除纯合子大鼠脑组织mRNA水平基本不表达,TauT蛋白表达水平显著低于同窝阴性大鼠。结论本研究利用CRISPR/Cas9系统定向敲除Slc6a6基因,成功构建Slc6a6基因敲除大鼠模型。     

利用CRISPR/Csa9技术构建溶酶体运输调节因子基因缺陷C57BL/6小鼠

目的获得自然杀伤(NK)细胞缺陷的小鼠动物模型,并研究溶酶体运输调节因子(Lyst)基因的功能。方法采用CRISPR/Cas9技术敲除C57BL/6小鼠的Lyst基因:针对小鼠Lyst基因编码区第50个外显子,设计CRISPR/Cas9靶点引物(sgRNA),并重组构建pUC57-Lyst-sg RNA载体。将重组质粒体与Cas9质粒分别利用T7 RNA聚合酶体外转录为mRNA,并按比例显微注射入小鼠受精卵,将受精卵移植到受体动物。获得子代小鼠后,利用PCR扩增和测序方法筛选Lyst基因发生改变的动物个体。结果显微注射移植后获得7只F0代基因敲除小鼠,且毛色均发生了明显的变化。结论利用CRISPR/Cas9技术可以构建Lyst基因缺陷小鼠,外观表型与已有的文献报道一致。     

基于CRISPR/Cas9技术构建GP73基因敲除小鼠模型及表型验证

目的：基于CRISPR/Cas9技术构建高尔基体73(GP73)基因敲除小鼠模型并对其表型进行初步验证。方法：利用非同源末端连接(NHEJ)修复引入突变的方式,造成GP73基因蛋白读码框移码,使其功能缺失,针对GP73基因外显子4设计sgRNA靶位点,体外转录获得sgRNA,与编码Cas9的mRNA混合后通过受精卵显微注射方法获得F0代阳性敲除小鼠,通过繁育及基因型鉴定获得GP73基因敲除纯合子小鼠(GP73^-/-小鼠)。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测肝、肾、皮下脂肪、棕色脂肪组织中GP73 mRNA表达,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清GP73蛋白水平。结果：与野生型(WT)小鼠相比,GP73^-/-小鼠肝、肾、皮下脂肪、棕色脂肪组织GP73 mRNA及蛋白表达水平降低,血清GP73蛋白水平降低(均P<0.05)。结论：基于CRISPR/Cas9技术成功构建了GP73基因敲除小鼠。     

利用CRISPR/Cas9技术建立RelB敲除小鼠模型

目的：利用CRISP/Cas9技术敲除C57BL/6小鼠中的RelB基因,为核因子（nuclear factor,NF）?κB转录因子蛋白家族的RelB基因与肿瘤转移等方面的研究提供RelB基因敲除实验动物模型。方法：利用基因编辑技术CRISPR/Cas9系统,设计并构建针对目的基因RelB第4外显子sgRNA,同时利用T7 RNA聚合酶体外转录Cas9 mRNA。取C57BL/6小鼠受精卵体外注射sgRNA和Cas9 mRNA后,进行胚胎移植,实现靶基因敲除。待小鼠出生后提取DNA并进行PCR鉴定,获得F0代,后与野生型交配后繁殖,取样提取DNA,测序分析鉴定后获得F1代小鼠,并在蛋白质水平和基因组水平分别验证敲除效果。结果：获得了4个在RelB基因突变的首建鼠,并得到了稳定遗传的RelB基因敲除小鼠。基因组测序结果示,敲除实验组中RelB的mRNA出现无义突变,令其mRNA翻译终止。与对照组相比,敲除实验组检测不到RelB蛋白表达。同时,Western blot结果显示,NF?κB家族中其他成员RelA、p50和p52的蛋白表达不受影响。结论：成功获得特异性敲除RelB的C57BL/6小鼠,为RelB在肿瘤转移、耐药中的研究提供了重要工具。     

基于CRISPR/Cas9技术构建严重联合免疫缺陷小鼠的实验研究

目的：应用CRISPR/Cas9技术靶向敲除编码小鼠T、B细胞的Rag2基因及编码NK细胞的IL2rg基因,构建T、B细胞及NK细胞联合免疫缺陷小鼠。方法：根据Genbank报道的Rag2及IL2rg基因序列,分别针对其外显子设计25bp左右的sgRNA并进行合成, sgRNA退火后克隆入pX330载体。Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA及Cas9重组质粒体外转录为mRNA后显微注射入BALB/c小鼠受精卵细胞,受精卵细胞移植到受体动物获得子代小鼠,首建鼠（F0）与野生型小鼠交配获得F1代小鼠,突变的F1代小鼠互交后筛选F2代纯合子小鼠。通过基因测序、流式细胞术及接种人源性肿瘤细胞系方法检测子代小鼠基因型和表型。结果：成功构建了Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA重组质粒并对其进行了体外转录,mRNA显微注射并移植后获得57只F0小鼠。连续交配后,获得F2代纯合子小鼠。序列分析表明子代小鼠中IL2rg有两个基因型,分别是10bp和11bp的缺失突变;而Rag2只有一个基因型,为8bp的缺失突变。与野生型BALB/c小鼠相比,小鼠外周血中CD3、B220及NKp46阳性细胞数量明显降低。接种人乳腺癌细胞系SKBR-2HL后,肿瘤生长良好,且随着时间延长肿瘤组织逐渐增大。结论：利用CRISPR/Cas9技术可有效实现BABL/c小鼠体内Rag2、IL2rg基因突变,并导致小鼠T、B及NK细胞功能异常。