从噬菌体环肽库中筛选TNF-α表位模拟肽的研究

目的：用具有中和活性的抗TNF—α单抗(mAb)J1D9筛选噬菌体环七肽库，从中获得可模拟TNF—α表位的短肽。方法：筛选TNF—α表位模拟肽，并用夹心ELISA法鉴定阳性克隆。结果：对环七肽库进行3轮筛选后，随机挑选20个噬菌体克隆，经ELISA鉴定出9个阳性克隆。DNA序列分析后，推导的氨基酸序列共3种：c—RRPAQSG—c、c—NKHNRKI—c和c—RGMSRKI—c。结论：筛选的环七肽克隆展示肽具有TNF—α的抗原性，为TNF—α表位模拟肽。     

利用噬菌体肽库筛选TNF-α表位的相关短肽

目的 从噬菌体肽库筛选TNF－α相关短肽，为临床上治疗肿瘤奠定基础。方法 用可溶性TNF受体Ⅰ（sTNFR Ⅰ）筛选噬菌体随机12肽库，利用细胞毒效应进行生物学效应筛选，再进行单链DNA测序。结果 分别得到若干模拟跨膜型TNF－α（TM－TNF－α）和模拟分泌型TNF－α（S－TNF－α）细胞毒效应的短肽，选择细胞毒效应最好的模拟TM－TNF－α短肽进行人工合成，体外实验显示此肽段对S－TNF－α耐受肿瘤细胞系HL－60具有明显细胞毒效应，且主要引起靶细胞凋亡。另外，利用激光共聚焦显微镜证实该合成肽段不能诱导NF－κB发生核转位。结论 获得模拟TM－TNF－α的短肽，为TM－TNF－α用于临床抗瘤治疗提供新线索。     

噬菌体展示法筛选抗入PTA1单克隆抗体结合肽

目的 从噬菌体展示文库中筛选能与抗人PTA1单克隆抗体（mAbs)特异性结合的短肽。方法 采用protein-A亲和层析法纯化系列抗人PTA1mAbs,通过流式细胞术检测筛选出能够阻断PTA1-Fc融合蛋白与其天然配体结合的mAb,经过三轮亲和筛选,从噬菌体随机12肽库中筛选可特异必结合mAb的重组噬菌体阳性克隆,进而对这些克隆的短肽序列进行测定和分析,结果 确定了能够阻断PTA1-Fc融合蛋白与其天然配体结合的mAb为LeoA1,得到了13个具有特异性结合LeoA1的重组噬菌体阳性克隆,序列测定结果发现,这些可结合LeoA1的短肽,有较保守而集中的模式序列,即WPXHHX序列,结论 这些具有保守模式序列的短肽,有可能模拟PTA1分子的功能表位,成为其天然配体拮抗剂的候选肽段,此外,PTA1分子与其配体结合的功能表位的确定,也为今后寻找天然配体和进一步深入研究PTA1分子的结构和功能提供了实验依据。     

利用体内噬菌体展示技术筛选及鉴定肺癌特异性结合肽

目的利用体内噬菌体展示技术筛选并鉴定与肺癌特异性结合的多肽。方法用肺癌细胞A549接种裸鼠复制荷瘤动物模型,将随机肽库尾静脉注入裸鼠体内,循环15 min后取肿瘤组织中结合的噬菌体,如此进行3轮体内筛选后挑取噬菌体克隆,ELISA初步鉴定噬菌体克隆对肺癌细胞的亲和力、特异性。将阳性噬菌体克隆扩增、测序获得外源多肽氨基酸序列,化学方法合成多肽,鉴定多肽对肺癌细胞和组织的亲和力、特异性。结果ELISA结果显示,随机挑选的20个噬菌体单克隆中,1个对A549具有很强亲和力。测序获得多肽,命名为zp2。化学合成多肽zp2。竞争抑制、细胞免疫荧光和组织免疫荧光实验结果表明多肽zp2与肺癌细胞A549及肺癌组织特异性结合。结论利用体内噬菌体展示技术筛选出与肺癌细胞A549特异性结合的多肽,为肺癌诊断及治疗药物的研制奠定基础。     

利用体内噬菌体展示技术筛选膀胱癌特异性结合肽

目的:利用体内噬菌体展示技术筛选与人膀胱移行细胞癌特异性结合的小分子多肽。方法:将人膀胱移行细胞癌细胞BIU87接种于裸鼠体内,制备膀胱癌荷瘤小鼠模型,尾静脉注射噬菌体展示环七肽库,然后筛选与膀胱移行细胞癌特异性结合的含外源多肽的噬菌体,经过3轮体内筛选后,免疫组织化学法及ELISA法鉴定单克隆噬菌体对BIU87的亲和力。提取阳性单克隆噬菌体单链DNA进行测序,并推导出外源多肽氨基酸序列,化学合成多肽、制备分子探针后采用激光扫描共聚焦显微镜术及流式细胞术鉴定多肽对膀胱癌细胞和组织的特异性。结果:3轮体内筛选后,噬菌体富集率达到4.334×102倍。免疫组化结果显示,肿瘤组织中噬菌体肽的含量随着每一轮筛选呈增长趋势,且结合逐渐增强,同时由于噬菌体经肝、肾代谢,可见肝脏结合大量非特异性的噬菌体。ELISA结果显示,随机挑选的30个单克隆噬菌体斑中,有24个阳性噬菌体,其中10个噬菌体对BIU87有较强的亲和力,对其测序并推导出3种多肽序列,重复率最高的序列CSSPIGRHC(8/10)命名为NYZL1。化学合成FITC-C6-NYZL1,通过激光扫描共聚焦显微镜术、流式细胞术均证明多肽NYZL1可以特异性结合膀胱癌细胞。结论:利用体内噬菌体展示技术筛选出了与人膀胱移行细胞癌特异性结合的小分子多肽NYZL1,为膀胱癌早期诊断和靶向治疗提供一定的理论依据。     

应用噬菌体肽文库筛选mAb F3特异性结合肽

目的 应用噬菌体展示肽文库筛选可与汉坦病毒囊膜蛋白中和性单抗（mAb） F3特异性结合的配体肽。方法 以F3mAb为筛选配基，对噬菌体展示和随机12肽文加进行3轮生物亲和淘选；用夹心ELISA和竞争ELISA鉴定筛选克隆的结合特性，并进一步对阳性克隆进行序列测定和分析。结果 通过3轮生物淘选，能被抗体捕获的噬菌体克隆为21／22，ELISA测定显示，筛选到的噬菌体短肽能与F3mAb特异性结合。序列分析表明，7个阳性克隆氨基酸序列相同，均为－MHGPTKNQMWHT；同源性分析显示，该序列与HTNV／SEOV M蛋白G2区第750－759位氨基酸有较高的同源性。结论 本研究为基于表位水平的HFRSV特异性分子多肽疫苗的设计提供了重要的依据。     

噬菌体展示法筛选抗人 PTA1单克隆抗体结合肽

目的从噬菌体展示文库中筛选能与抗人PTA1单克隆抗体(mAbs)特异性结合的短肽。方法采用protein-A亲和层析法纯化系列抗人PTA1mAbs,通过流式细胞术检测筛选出能够阻断PTA1-Fc融合蛋白与其天然配体结合的mAb,经过三轮亲和筛选,从噬菌体随机12肽库中筛选可特异性结合mAb的重组噬菌体阳性克隆,进而对这些克隆的短肽序列进行测定和分析。结果确定了能够阻断PTA1-Fc融合蛋白与其天然配体结合的mAb为LeoA1,得到了13个具有特异性结合LeoA1的重组噬菌体阳性克隆,序列测定结果发现,这些可结合LeoA1的短肽,有较保守而集中的模式序列,即WPXHHX序列。结论这些具有保守模式序列的短肽,有可能模拟PTA1分子的功能表位,成为其天然配体拮抗剂的候选肽段。此外,PTA1分子与其配体结合的功能表位的确定,也为今后寻找天然配体和进一步深入研究PTA1分子的结构和功能提供了实验依据。     

噬菌体肽库的免疫学应用研究

噬菌体展示肽库技术是一种用于筛选蛋白、多肽的强有力的生物技术,将外源蛋白与噬菌体外壳蛋白融合而表达于噬菌体颗粒表面,被展示的外源蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性.本文总结了这一技术及其相关展示系统在蛋白质相互作用的研究、抗体及疫苗的制备、多肽药物的研制等方面的应用潜力和独特的优点.     

用噬菌体展示随机12肽库筛选HCV B细胞抗原表位

目的用患者血清中抗丙型肝炎病毒(HCV)抗体从噬菌体展示随机12肽库筛选HCV抗原表位。方法用硫酸铵粗提HCV患者血清中Ig后用DEAE—Sephadex A50层析纯化并作为筛选的配基;对噬菌体展示随机12肽库采用配基亲和富集、阴性血清吸收的方法进行生物淘洗;ELISA鉴定筛选克隆的结合特性;测定阳性克隆所携带DNA序列并进行计算机辅助分析。结果三轮生物淘洗后特异性克隆得到了富集。用第3轮淘洗出的26个克隆进行结合实验,其中有3个克隆与HCV患者血清结合力较高而与正常人血清结合能力较弱;序列分析发现2个序列与HCV蛋白第1082～1093和1954～1965位(1082YHGAGTRTIASP 1093和1954TQLLRRLHQWIS 1965)氨基酸有较高的同源性;计算机辅助分析提示这两个位点具有形成表位的性质。结论获得了两个HCV抗原表位,在HCV感染的检测中具有潜在的应用价值。     

从噬菌体15肽库中筛选乙脑病毒糖蛋白模拟肽

目的 用抗JEVE蛋白的mAb2H4筛选噬菌体15肽库,以研究JEVE蛋白模拟肽。方法 用生物素标记的mAb2H4,对噬菌体随机15肽库进行3轮筛选,经ELISA鉴定后,随机挑战取10个阳性噬菌体克隆测序,并与JEVE蛋白进行同源性比较,结果 筛选到的噬菌体能与mAb2H4特异地结合,并且这种结合可被天然JEV抗原所抑制,10个阳性噬菌体克隆的氨基酸序列相同,均为RQD-PQWPYANSTIAR,同源分析表明,在JEVE蛋白不同区域有两个同源性较高的序列：STXAR和WXXAXST,阳性噬菌体展示肽了能与抗天然JEV抗原的鼠血清产生特异性反应。结论 筛选的该噬菌体克隆展示肽可模拟JEVE蛋白的部分抗原性。     

应用噬菌体随机肽库研究蛋白质原表位的进展

蛋白质抗原表位分析在抗原的结构与功能、抗原抗体反应、以及疫苗等新型生物制剂的研究中具有重要意义。近年来 ,随着噬菌体随机肽库研究技术的发展 ,人们逐渐将该技术应用于蛋白质抗原表位研究中。结果表明 :噬菌体随机肽库技术比传统的蛋白质抗原表位分析技术有着较明显的优点。这种新的蛋白质抗原表位分析技术弥补了传统分析技术的不足 ,在蛋白质抗原表位分析中具有广阔的应用前景。     

利用噬菌体肽库确定IL-2Rα表位序列

目的：确定ＩＬ－2Ｒα表位,为研制高效特异性强的小分子肽类免疫抑制剂奠定基础。方法：用抗ＩＬ－２Ｒα单克隆抗体５Ｇ１对噬菌体六肽库进行筛选,选择出与５Ｇ１结合较强的克隆,经ＤＮＡ序列分析,获得保守序列。对合保守序列的克隆进行生物学活性鉴定。结果：选择出３１个与５Ｇ１结合较强的克隆。获得Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ和Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ两种保守序列。生物学活性鉴定表明：含Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ序列克隆较含Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ被抑制效果好。结论：Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ是ＩＬ－２Ｒα表位的关键序列。以此表位序列合成的小分子肽可作为ＩＬ－２Ｒα的拮抗剂而成为免疫抑制剂。     

用噬菌体表面显示肽库技术筛选乙酰胆碱酯酶有效抗原表位的研究

目的：筛选和鉴定乙酰胆碱酯酶的有效抗原表位。方法：收集乙酰胆碱受体抗体阴性而乙酰胆碱酯酶抗体阳性的重症肌无力病人血清，采用溴化氰活化的琼脂糖柱（CNBr-actived sepharose^TM4B）纯化抗乙酰胆碱酯酶的多克隆抗体并定量；用纯化的抗乙酰胆碱酯酶的抗体对随机的12肽噬菌体表面显示肽库进行5轮免疫学筛选，随机挑取克隆；采用Western blot免疫识别，识别为阳性的克隆进行核苷酸序列的测定，并与乙酰胆碱酯酶的氨基酸序列进行同源性比较。将获得的不同表位的阳性克隆分别免疫小鼠，采用Western blot筛选能刺激小鼠产生抗乙酰胆碱酯酶抗体的阳性克隆，进行生物学活性的鉴定。结果：经5轮免疫学筛选后挑取的49个克隆中，经Westem blot识别15个克隆能被抗乙酰胆碱酯酶抗体识别。核苷酸序列分析发现共有7种不同的表位，其中1种表位与乙酰胆碱酯酶有较高的同源性，其余6种表位与其无一级结构的同源性。经动物免疫初步实验筛选，共有5个免疫原性较强的阳性克隆，其免疫的鼠血清均可识别人乙酰胆碱酯酶。结论：获得了5种乙酰胆碱酯酶的有效抗原表位，1种可能为结构表位，4种为模拟表位。     

用噬菌体肽库筛选IBDV单克隆抗体的模拟表位

目的:筛选法氏囊病毒(IBDV)单克隆抗体所针对的模拟抗原表位。方法:以纯化的3株IBDV单克隆抗体为靶分子用噬菌体12肽库筛选相应抗原模拟表位;应用间接和竞争ELISA鉴定所筛选的阳性样品;最后对与抗体高亲和结合的噬菌体进行测序分析。结果:经过四轮淘洗,随机挑取30个克隆经间接ELISA鉴定,发现其中22个克隆结合活性较高。进一步应用竞争ELISA,获得14个噬菌体克隆,其抑制率高达50%以上。对这些噬菌体进行DNA测序,并分析比对了IBDV相应序列,确定了3个抗原模拟表位。结论:通过噬菌体随机肽库成功筛选出3个IBDV模拟表位,为进一步研究IBDV抗原性质奠定了基础。     

应用噬菌体展示肽库筛选生殖支原体黏附蛋白的模拟表位

目的 利用纯化的兔抗重组生殖支原体黏附素蛋白(rMgPa)的多克隆抗体(pAb)从噬菌体展示随机12肽库筛选MgPa的模拟表位.方法 用纯化的兔抗rMgPa的pAb对噬菌体随机12肽库进行生物淘洗,随机挑取噬菌体克隆进行DNA测序与分析,并用MIMOX对噬菌体克隆所展示的肽序列进行生物信息学分析.用ELISA、竞争性结合试验和Western blot检测噬菌体与pAb结合的特异性.结果 4轮生物淘洗后特异性噬菌体克隆得到了明显的富集.依据氨基酸组成的不同,74个噬菌体克隆所展示的肽序列可大致分为3组.经对肽序列进行比较分析以及用MIMOX进行生物信息学分析,结果表明这3组的核心序列分别为:P-S-A-A/V-X-R-F/W-E/S-L-S-P、A-K-I/L-T/Q-X-T-L-X-L和K-S-L-S-R-X-D-X-I.ELISA、竞争性结合试验和Western blot方法检测的结果表明噬菌体能与pAb发生特异性结合,说明其可能是MgPa的模拟表位.结论 成功筛选到MgPa的3个可能的模拟表位,为研制基于Mg抗原表位的诊断试剂与多肽疫苗奠定了一定的实验基础.     

从噬菌体12肽库筛选旋毛虫抗原模拟表位

为研究和开发新的旋毛虫病诊断抗原和疫苗 ,以纯化旋毛虫病患者血清免疫球蛋白 (Ts Ig)对噬菌体1 2肽库进行 5轮筛选获得旋毛虫抗原模拟表位 ,随机挑选 2 4个克隆 ,通过ELISA选取吸光度 (A)较高的 6个克隆 (T1～T6 )并检测其灵敏性和特异性。结果显示 :T1～T6灵敏性与旋毛虫幼虫抗原 (TsA)相同 (阳性反应率 :1 0 0 % ,P >0 0 5 ) ,特异性与TsA无明显差异 (阳性反应率 :0～ 4 0 % ,P >0 0 5 ) ,其中T3,T6与肺吸虫病患者血清无交叉反应 ,特异性高于TsA(P <0 0 5 ) ,T6与日本血吸虫病患者血清无交叉反应 ,特异性亦高于TsA(P<0 0 5 ) ,证实利用噬菌体 1 2肽库可以成功地筛选到旋毛虫抗原模拟表位 ,为旋毛虫病诊断抗原和疫苗的研究和开发提供了新的研究途径     

从噬菌体随机肽库筛选CD137结合肽

目的应用噬菌体随机七肽库筛选与人CD137特异结合的肽序列。方法以重组人CD137作为筛选分子，对噬菌体展示随机七肽库进行亲和淘选。经过5轮淘选后，共随机挑选23个噬菌斑并对其进行了扩增和测序，据此推导随机多肽的氨基酸序列。经夹心ELISA进一步鉴定噬菌体克隆与CD137的结合力。^3H-TdR法检测了噬菌体展示多肽对抗CD137Ab刺激的人外周血淋巴细胞增殖反应影响。结果5轮淘选所得的噬菌体回收率逐步提高，显示淘选过程对随机肽库有一定的富集效果。通过对阳性克隆的测序和序列比较分析，得到RPTQGAF、RPTQVAL、RPTQVAF的相似序列和与CD137L具有同源SRS序列的SRSRVRY、HRRPSRS肽序列，ELISA结果显示这5个克隆都有良好的与CD137的结合力。RPTQGAF、RPTQVAL、RPTQVAF和SRSRVRY4个噬菌体展示肽均能在体外抑制抗CD137Ab刺激的淋巴细胞增殖反应。结论通过对噬菌体随机肽库的淘选，得到与CD137结合的相关多肽，为进一步研究CD137与配体结合的特异性位点及其拮抗性多肽药物设计提供了实验依据和结构基础。     

应用噬菌体肽文库筛选McAb F3特异性结合肽

目的：应用噬菌体展示肽文库筛选可与抗汉坦病毒囊膜蛋白单抗F3特异性结合的配体肽。方法：采用protein-A亲和层析纯化的F3单抗为筛选配基，对噬菌体展示的随机12肽文库进行生物亲和淘洗，夹心ELISA、竞争ELISA鉴定筛选克隆的结合特性，并进一步对阳性克隆进行序列测定和分析。结果：通过3轮生物淘洗，能被抗体捕获的噬菌体克隆为91．7％（11／12）；ELISA测定显示筛选到的噬菌体短肽能与F3单抗特异性结合；序列分析表明7个阳性克隆氨基酸序列相同，均为－MHGPTKNQMWHT，同源性分析显示该序列与HTNV／SEOV M蛋白G2区第750－759位氨基酸有较高的同源性，结论：获得了具有良好结合活性的模拟表位肽，为基于表位水平的HFRSV（肾病综合征出血热病毒）特异性分子多肽疫苗的设计提供了重要依据。     

利用噬菌体肽库筛选与人CD59特异性结合的短肽

目的:筛选并鉴定与人CD59分子特异结合的短肽,为设计具有拮抗CD59肿瘤逃逸活性的短肽封条奠定基础。方法:以高表达人CD59的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为靶细胞,采用竞争结合试验,对噬菌体随机12肽库进行5轮亲和筛选。用ELISA筛选噬菌体阳性克隆并对其进行DNA序列分析。结果:随机挑选的16个克隆中,有8个与人CD59的结合力高。测序后,得到3个高度同源的氨基酸序列。DNAstar分析显示,3个序列均与已公布的(PubMed)人CD2的氨基酸序列有一定的同源性。结论:获得的序列H×A××××××P××为设计肿瘤逃逸相关的CD59活性位点的短肽封条提供了技术基础。     

利用噬菌体肽库筛选IL-2Rα模拟表位肽的研究

目的 筛选IL-2Rα模拟表位肽,为研制高效、特异性强的小分子肽类免疫抑制剂奠定基础.方法 应用离子交换层析法从小鼠腹水中纯化抗人IL-2Rα单克隆抗体5G1,细胞ELISA方法检测其特异性.用5G1单抗筛选噬菌体环七肽库,并对噬菌体克隆进行抗原性鉴定.根据阳性克隆的DNA序列合成环肽并鉴定其生物活性.结果 经5轮筛选、鉴定,获得5个与5G1有较强结合特性的噬菌体阳性克隆.DNA测序并推导氨基酸序列,得到Lys-X-{X}-Lys-Gly保守序列.依此序列合成环七肽CP,小鼠淋巴细胞增殖试验证实其有免疫抑制活性.结论 环肽CP为IL-2Rα模拟表位肽,可作为IL-2Rα的拮抗剂发挥免疫抑制效应.