尾型同源盒转录因子2 shRNA慢病毒表达载体的构建及其转染对结肠癌细胞生长的影响

目的:构建尾型同源盒转录因子2(CDX2)shRNA慢病毒表达载体,并观察下调CDX2基因其对结肠癌细胞生长的影响。方法:根据CDX2 m RNA序列设计shRNA,并合成shRNA的互补序列,通过连接酶链接到GV248载体上,用测序方法鉴定阳性克隆后,将构建好的慢病毒表达载体与慢病毒包装载体用Lpofectamine 2000共转染293T细胞,产生慢病毒颗粒并用稀释法进行滴度测定。将CDX2 shRNA慢病毒表达载体转染人结肠癌细胞SW480、HT29后,分别用q RT-PCR和Western blot检测CDX2 m RNA及蛋白水平,CCK8实验及克隆形成实验检测细胞增殖能力。结果:DNA测序鉴定证实,CDX2 shRNA表达片段正确插入GV248载体中,包装后的病毒滴度为1×109TU/m L;SW480、HT29细胞转染CDX2-shRNA慢病毒表达载体后,CDX2 mRNA及蛋白表达水平均明显降低(均P0.05),但细胞的增殖与克隆形成能力无明显改变(均P0.05)。结论:成功构建shRNA慢病毒表达载体,其转染结肠癌细胞后能有效地抑制CDX2基因的表达;下调CDX2基因对人结肠癌细胞的增殖无明显影响。     

CXCR4靶向shRNA质粒载体的制备和体外鉴定

目的：设计并构建CXCR4靶向shRNA质粒载体,转染黑色素瘤细胞株,验证shRNA对黑色素瘤CXCR4基因的沉默效应。方法：设计合成CXCR4特异性shRNA,将其插入pSilencer质粒载体,并将重组后的pSilencer质粒载体经脂质体包裹转染黑色素瘤MV3细胞株,抗性筛选稳定抑制CXCR4表达的永久性克隆。应用RT-PCR技术检测shRNA对黑色素瘤细胞内CXCR4 mRNA表达,应用Westernblot法检测CXCR4蛋白变化。结果：成功构建和筛选出CXCR4特异性的shRNA质粒载体及稳定抑制CXCR4表达的永久性细胞克隆。阳性克隆测序结果表明合成的寡核苷酸链序列插入正确。稳定转染CXCR4-shRNA的高转移性黑色素瘤细胞MV3的CXCR4 mRNA和蛋白的表达较空白对照组明显下调。结论：脂质体介导shRNA体内表达法制备的CXCR4-shRNA在黑色素瘤细胞中可获得高效转染,并能产生特异性的基因沉默效应,以CXCR4为靶向的shRNA能够有效下调CXCR4基因的表达,有望为转移性黑色素瘤的靶向基因治疗提供一条新途径。     

靶向CXCR1基因的shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建靶向化学趋化因子受体1（CXCR1）的短发夹小干扰RNA（shRNA）质粒表达载体。方法：针对人CXCR1基因的mRNA序列,按RNA干扰靶位点的设计原则,设计并构建靶向CXCR1基因的3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经酶切和测序确认构建成功后,转染胃癌细胞MKN45,RT-PCR和Western blot检测CXCR1 mRNA和蛋白的表达。结果：经酶切和测序证实,3个靶向CXCR1基因的shRNA真核表达质粒均构建成功;与未转染和转染阴性对照质粒的MKN45细胞比较,转染3种shRNA质粒的MKN45细胞,CXCR1 mRNA和蛋白水平均明显下调（均P<0.05）。结论：靶向CXCR1基因的shRNA真核表达质粒的成功构建,为进一步研究CXCR1在胃癌中的功能和实验性靶向治疗提供了初步的基础。

     

慢病毒介导shRNA沉默STAT3表达治疗结直肠癌的体内外研究

目的 探讨慢病毒介导shRNA沉默STAT3表达对结直肠癌生长的影响.方法 分别用慢病毒干扰质粒pRNAT-shSTAT3、慢病毒空质粒pRNAT-GFP和慢病毒包装质粒混合物共转染293T细胞,获得慢病毒分别感染结直肠癌HT-29细胞,筛选培养后获得HT-29-shSTAT3、HT-29-GFP细胞株.将3种细胞株用于建立裸鼠皮下移植瘤模型,分为3组:第1组为HT-29组,第2组为HT-29-GFP组,第3组为HT-29-shSTAT3组,每组5只.MTT法检测细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞周期变化,取瘤组织切片行CD34免疫组织化学观察肿瘤微血管密度(MVD)的变化.应用单因素方差分析检测结果.结果 结直肠癌HT-29、HT-29-GFP细胞株生长能力明显强于HT-29-shSTAT3细胞株,3者比较,差异有统计学意义(F=632.50,P<0.05).HT-29-shSTAT3细胞株生长明显减慢,G0/G1期细胞占68.7%±2.9%,HT-29-GFP细胞株为38.5%±1.6%,HT-29细胞株为38.7%±2.3%;3者比较,差异有统计学意义(F=166.53,P<0.05).HT-29组、HT-29-GFP组和HT-29-sh STAT3组MVD分别为29±5、28±4、10±3,3组比较,差异有统计学意义(F=31.60,P<0.05).结论 慢病毒介导的shRNA沉默STAT3表达能明显抑制结直肠癌的生长.     

shRNA介导的热休克蛋白70敲低对人结肠癌细胞在裸鼠体内生长的影响

目的:探讨热休克蛋白70(HSP70)敲低对结肠癌细胞在裸鼠体内生长的影响。方法:构建两种干扰HSP70的shRNA(HSP70 shRNA-1和HSP70 shRNA-2)质粒表达载体,分别转染到结肠癌HT29细胞,并以空质粒转染(阴性对照)和未转染的HT29细胞(空白对照)为对照,用RT-PCR和Western blot方法检测各组HT29细胞HSP70基因和蛋白的表达;将HSP70shRNA-2转染、空质粒转染及未转染的HT29细胞分别接种至裸鼠皮下建立移3组植瘤模型,观察肿瘤生长情况,3周后剥离瘤块,用HE染色、免疫组化和TUNEL法分别检测移植瘤组织形态学、增殖细胞核抗原(PCNA)的表达及细胞凋亡情况。结果:RT-PCR和Western blot结果显示HSP70 shRNA-1和HSP70 shRNA-2均能明显抑制HT29细胞HSP70基因和蛋白的表达,且HSP70 shRNA-2的抑制作用更为明显,空质粒转染对HSP70的表达无明显影响;与空白对照组比较,HSP70 shRNA-2转染组裸鼠移植瘤生长明显较明显减慢(P<0.01),瘤组织中心出现明显坏死,PCNA表达明显降低,细胞凋亡率明显增加(P<0.01),而空质粒转染组无明显上述改变(P>0.05)。结论:HSP70沉默能抑制结肠癌HT29细胞裸鼠移植瘤的生长,促进细胞凋亡,HSP70可能是治疗结肠癌有效靶点。     

PSF1在结肠癌组织中的表达及其对结肠癌细胞增殖的影响

目的检测PSF1在结肠癌组织中的表达,探讨RNA干扰沉默PSF1表达对人结肠癌细胞增殖的影响及其可能的机制。方法收集2004年5月至2006年12月间经病理确诊的40例结肠癌标本．采用Westerllblot检测标本中PSF1蛋白表达水平;应用脂质体法将靶向PSF1的短发夹RNA（shRNA）干扰质粒转染人结肠癌细胞株LOVO、HT．29和HCT116,Westernblot法检测PSF1蛋白表达变化．分别应用MTY法、软琼脂克隆形成实验及荧光定量PCR检测转染PSF1shRNA干扰质粒对结肠癌细胞增殖活性、锚定非依赖性生长能力及PSF2、PSF3和SLD5mRNA表达的影响。结果结肠癌组织中PSF1蛋白相对表达量为0．485±0．113,显著高于正常黏膜组织的0．056±0．014（P〈0．01）。转染PSF1sbRNA干扰质粒后,LOVO、HT-29和HCT116细胞中PSF1蛋白表达水平均显著下降（P〈0．05）,细胞增殖能力显著降低,软琼脂克隆形成率明显下降。与阴性对照组及正常生长组细胞比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。转染PSF1shRNA干扰质粒后．LOVO、HT-29和HCT116细胞中PSF2、PSF3和SLD5mRNA表达均明显下降（P〈0．05）。结论PSF1与结肠癌的发生发展具有一定关系。利用RNA干扰技术能有效抑制结肠癌细胞中PSF1表达。并抑制结肠癌细胞增殖。PSF1基因有望成为结肠癌靶向治疗的新靶点。     

靶向人SIRT1基因的shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建针对人SIRT1基因的shRNA真核表达质粒,并筛选出对胰腺癌细胞系PANC-1基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体。方法针对SIRT1基因的mRNA序列设计,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经大肠杆菌扩增,酶切,PCR,测序鉴定,转染胰腺癌PANC-1细胞,实时荧光定量PCR和Western blot检测SIRT1 mRNA和蛋白的被抑制情况。结果经测序证实,成功构建SIRT1-shRNA真核表达质粒,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致。重组质粒转染PANC-1细胞后,SIRT1 mRNA和蛋白水平明显下调;其中以1号重组质粒效应最强。结论成功构建了携带以SIRT1为靶向的shRNA的重组质粒。其对胰腺癌PANC-1细胞SIRT1的表达具有显著抑制效应。该实验为进一步研究SIRT1的功能和肿瘤的基因治疗提供了实验基础。     

靶向Pik3cb shRNA表达载体的构建及其对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的构建大鼠Pik3cb shRNA真核表达载体，并检测其下调大鼠血管平滑肌细胞Pik3cb mRNA表达的效应。方法根据Genbank中大鼠Pik3cb序列设计并合成两条shRNA寡核苷酸片段，退火形成双链并克隆导入载体pGenesil-1，酶切鉴定和测序无误后分别命名为pU6-Pik3cb—shRNA．1和pU6-Pik3cb—shRNA-2。通过脂质体转染大鼠胸主动脉平滑肌细胞，确定转染效率；通过荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测Pik3cb mRNA的表达；TUNEL法检测细胞凋亡。结果pU6-Pik3cb—shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2经测序和PCR扩增与原序列相同，转染大鼠平滑肌细胞48h时转染率为15．7％，荧光定量PCR结果显示转染组Pik3cb mRNA表达明显减少，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05），错配质粒组与对照组比较Pil（3cb mRNA表达差异无统计学意义（P〉0．05）。TUNEL结果显示转染组凋亡细胞明显增加，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论成功构建重组真核表达质粒pU6-Pik3cb—shRNA，并有效下调大鼠胸主动脉平滑肌细胞Pik3cb mRNA的表达，为靶向Pik3cb防治移植血管再狭窄的基因治疗奠定了基础。     

siRNA真核表达载体的构建及其对CXCR4基因的沉默效应

目的：构建趋化因子受体（CXCR4） 特异性siRNA ( small interfere RNA)真核表达载体,体外观察对CXCR4基因的沉默作用。方法：采用基因克隆技术, 将合成的特异性CXCR4 RNA干扰寡核苷酸序列插入真核表达载体pSUPER, 构建CXCR4 siRNA真核表达载体。以脂质体法将pSUPER空载体和2个(pSUPER/CXCR4 siRNA0和pSUPER/ CXCR4 siRNA1 )重组质粒分别导入具有高转移特性的MDA MB 231乳腺癌细胞系，检测各组乳腺癌细胞内CXCR4 mRNA及蛋白的表达情况。 结果：成功构建CXCR4 siRNA真核表达载体. 转染CXCR4 RNA干扰片段的乳腺癌细胞, 72 h后CXCR4 mRNA及蛋白表达下调,抑制作用明显。 结论：构建的RNA干扰真核表达载体能明显下调CXCR4 mRNA及蛋白的表达,为应用于乳腺癌的治疗研究提供了一定的实验基础。     

靶向RNA干扰Survivin对结肠癌细胞HT-29增殖凋亡的影响

目的探讨肿瘤增殖型腺病毒（Ad-delE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP）介导的以人Survivin为靶标的RNA干扰对结肠癌细胞株HT-29中Survivin mRNA和蛋白表达及对HT-29增殖凋亡的影响。方法用Ad-delE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP转染结肠癌细胞株HT-29（以携带相同shRNA的增殖缺陷型腺病毒和脂质体载体为对照），用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot分别检测转染后的HT-29细胞中Survivin mRNA和蛋白表达的变化，用噻唑蓝（MTT）法、吖啶橙／溴乙锭荧光染色法、Annexin V-PE／7-AAD联合染色法检测细胞死亡率及凋亡率。结果与复制缺陷型腺病毒载体和脂质体载体比较，转染Ad-delE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP后，HT-29细胞中Survivin mRNA拷贝数及蛋白表达显著降低，其细胞死亡率和凋亡率显著提高（P〈0．05）。结论Ad-deIE1b55KD-shRNA／Survivin-EGFP介导的RNA干扰较之增殖缺陷型腺病毒载体和脂质体载体具有更高的干扰效率，且能高效地诱导结肠癌细胞凋亡并抑制其增殖。     

人PPFP基因的重组慢病毒载体的构建和表达

目的 构建含人PAX8/PPARγ/融合基因(PPFP)基因重组慢病毒载体并检测其表达性能.方法 从已构建好的含PPFP的质粒克降模板PEGFP-C-PPFP中,利用聚合酶链反应(PCR)方法钓取目的 基因PPFP,将该基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU(含Flag基因)中,得到重组的pGC-FU-PPFP,通过PCR、酶切、测序和分析比对验证PPFP基因后,将pGC-FU-PPFP质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞株293T细胞,获得携带PPFP基因和Flag基因的重组慢病毒,收集并浓缩病毒上清液,测定重组病毒的滴度.通过Western blot鉴定PPFP-Flag融合蛋白在靶细胞内的表达进一步验证目的 基因在靶细胞中的表达.结果 经PCR扩增获得2591 bp的目的 基因片段,构建的重组质粒经PCR、酶切及测序和分析比对鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293T细胞获取的慢病毒滴度达3.5×10~7转导单位TU/ml;感染的293T细胞,Western blot结果显示条带大小为90 KDr,可判断目的 基因PPFP在293T细胞中表达.结论 成功构建PPFP基因慢病毒载体质粒pGC-FU-PPFP,并建立慢病毒过表达系统.     

慢病毒介导的RNA干扰沉默Wip1基因对人脑胶质母细胞瘤细胞生长的影响

目的 构建人Wip1基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默人胶质瘤U251细胞的Wip1基因并观察其对细胞生长的影响.方法 设计并合成3条Wip1基因特异性RNAi靶序列,构建到慢病毒pFU-GW-iRNA载体中.慢病毒包装转染HEK293T细胞,获得病毒上清并测定其滴度;感染U251细胞,实时定量聚合酶链反应(PCR)及Western blot鉴定RNA干扰效率;筛选出基因沉默效率最高的慢病毒感染U251细胞,CCK-8法检测细胞的增殖,Western blot检测RNA干扰后的bcl-2蛋白表达.结果 PCR扩增和测序表明成功构建Wip1慢病毒干扰载体,病毒载体包装获得的病毒上清滴度在3×10~8～8×10~8 TU/ml.可以有效地沉默U251细胞中Wip1基因的表达,构建的RNAi慢病毒载体感染U251细胞后Wip1基因的mRNA表达量同对照组比较分别为36.3%、32.9%、23.8%.稳定Wip1 RNA干扰后的U251细胞4 d后细胞增殖能力下降35.1%.结论 慢病毒介导的RNA干扰可以高效稳定地沉默基因表达,Wip1基因促进了U251细胞的增殖.     

人分化抑制蛋白1慢病毒干扰载体的构建、筛选及其沉默效应的鉴定

目的探索以小干扰RNA（si RNA）慢病毒干扰载体组建的慢病毒对人Hep G2细胞分化抑制蛋白1（Id1）基因的沉默效应。方法构建4种针对Id1基因不同干扰靶点的Id1-siRNA慢病毒干扰载体（pCGSIL-GFPId1-1、pCGSIL-GFP-Id1-2、pCGSIL-GFP-Id1-3及pCGSIL-GFP-Id1-4）,将其转染至293T细胞,以筛选出针对Id1基因的最有效的RNA干扰（RNAi）靶序列。再以沉默效果最优的干扰载体进一步构建慢病毒（Id1-RNAi-LV）,感染人HepG2细胞后,采用实时定量PCR法和Western blot法分别检测其Id1 mRNA及其蛋白的表达水平。结果与pCGSIL-GFP-Id1-1组、pCGSIL-GFP-Id1-2组及p CGSIL-GFP-Id1-3组比较,pCGSIL-GFP-Id1-4组的Id1蛋白表达水平最低（P〈0.05）,沉默效果最优。以pCGSIL-GFP-Id1-4干扰载体组建慢病毒后,测得慢病毒的病毒滴度为2.0×10^9 TU/mL。与空白对照组和阴性对照组比较,以组建的慢病毒感染人HepG2细胞后,人HepG2细胞中Id1m RNA及其蛋白的表达水平均降低（P〈0.05）。结论本实验构建的特异性慢病毒可稳定地介导Id1基因的沉默。     

FOXP3 shRNA3对肝癌细胞趋化因子及受体CXCL12、CXCL11、CXCR4、CXCR7作用的研究

目的研究FOXP3 shRNA对肝癌细胞株SMMC-7721和MHCC-97H的趋化因子及受体CXCL12、CXCL11、CXCR4、CXCR7的影响。方法设计三种编码FOXP3 shRNA的FOXP3干扰慢病毒,sh-FOXP3-1-pGreenPuro、sh-FOXP3-2-pGreenPuro和sh-FOXP3-pgreenpuro并分别转染SMMC-7721和MHCC-97H细胞。q-PCR检测各组CXCL12、CXCL11、CXCR4、CXCR7 mRNA的表达情况;Western Blot检测各组CXCL12、CXCL11、CXCR4、CXCR7蛋白的表达情况。结果经菌落PCR和测序验证证明三个FOXP3干扰慢病毒载体构建正确;三种干扰序列中sh-FOXP3-1干扰效果最明显,因此后期实验都使用sh-FOXP3-1进行下面的实验。研究显示:(1)与对照组相比,sh-FOXP3-1组的CXCL12、CXCL11、CXCR4、CXCR7 mRNA表达明显下降,差异具有统计学意义。(2)与对照组相比,sh-FOXP3-1组的CXCL12、CXCL11、CXCR4、CXCR7蛋白表达明显下降,差异具有统计学意义。结论干扰FOXP3的表达后,能减少趋化因子CXCL12、CXCL11、CXCR4、CXCR7的表达。     

人白介素-8 shRNA慢病毒载体的构建和鉴定

目的:构建携载人白介素-8(IL-8)shRNA的慢病毒并鉴定其对MDA-MB-231细胞该基因的沉默效率。方法:设计两个IL-8基因特异性siRNA靶点,与pMagic7.1慢病毒载体质粒重组,经PCR鉴定并测序,通过293T细胞实现慢病毒包装,DNA定量试剂盒分别检测两种慢病毒滴度。将这两种慢病毒分别以最佳感染复数感染MDA-MB-231细胞,通过Real-time PCR检测IL-8沉默效率。结果:PCR鉴定阳性的shRNA重组质粒测序正确,包装后两种病毒滴度分别为1.93×109 IU/mL和1.89×109IU/mL;分别以MOI=40感染MDA-MB-231细胞后,IL-8沉默效率分别为80%和90%。结论:成功构建IL-8 shRNA慢病毒并达到较高的沉默效率,为下一步研究沉默靶基因后细胞生物学功能变化提供实验基础。     

短发卡RNA稳定沉默FOXM1对肝癌细胞体外生长的影响

目的 探讨短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体稳定沉默叉头框M1(forkhead box M1,FOXM1)基因对人肝癌细胞体外生长的影响.方法 构建针对人类FOXM1mRNA的不同干扰靶点的4个shRNA表达载体,选择干扰效果最佳的表达载体和阴性对照质粒转染人肝癌细胞QGY-7703,用新霉素(G418)筛选稳定转染的克隆.用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法和平板克隆形成实验检测FOXM1基因沉默前后肝癌细胞体外生长能力的变化.用Annexin V-APC/PI双染法检测细胞凋亡.结果 不同人肝癌细胞株中普遍表达FOXM1蛋白.4个shRNA表达载体中,shRNA-1026表达载体的干扰效果最佳,对FOXM1 mRNA和蛋白表达水平的抑制率分别为38.5%和53.2%.用shRNA-1026稳定沉默FOXM1基因后,QGY-7703细胞增殖受到抑制,培养48、72和96 h后,沉默组的吸光值均显著低于对照组(分别t=10.830,3.578,5.734,均P＜0.05);沉默组的克隆形成能力较对照组显著降低(t=5.336,P＜0.05),而细胞凋亡较对照组显著增加(t=6.827.P＜0.05).结论 shRNA表达载体稳定沉默FOXM1基因抑制肝癌细胞的生长.

Abstract：

Objective To evaluate the effect of sustained silencing Forkhead box Ml (F0XM1) gene by short-hairpin RNA (shRNA) expression vector on cell growth of hepatocelluar carcinoma (HCC) in vitro.Methods Four shRNA expression vectors targeting different sequences of human F0XM1 mRNA were constructed.The expression vector with the best interfering effect and the negative control plasmid were used to transfect HCC cell line QGY-7703, stably transfected cell clones were selected by neomycin (G418).Cell growth was evaluated by 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay and colony formation was assessed by clonogenic assay.Cell apoptosis was detected by double staining with APC conjugated Annexin V and PI.Results F0XM1 protein was detected with different levels in all these studied human cell lines.The expression vector shRNA-1026 exhibited excellent interference effect after transient transfection, which showed 38.5% and 53.2% reduction of FOXM1 mRNA and protein level respectively.The growth of QGY-7703 cells was inhibited after stable inhibition of FOXM1 expression by shRNA-1026, which was indicated by decreased absorbance value of the test group after culture for 48, 72 and 96 h compared to control group (t = 10.830,3.578 and 5.734 respectively, P ＜ 0.05).Stable inhibition of F0XM1 also led to reduced colony formation ( t = 5.336, P ＜ 0.05 ) and increased apoptosis of QGY-7703 cells in comparison to control cells (t = 6.827, P ＜ 0.05 ).Conclusions Stable silencing F0XM1 gene by shRNA suppresses the growth of HCC cells in vitro.     

WTX 慢病毒载体及其稳转结肠癌细胞株Lovo/WTX-EGFP 的建立

目的：构建抑癌基因WTX慢病毒载体,建立稳定转导WTX的结肠癌Lovo/WTX-EGFP细胞株,为研究WTX在结肠癌中的作用机制提供有效工具。方法：通过Gateway技术构建WTX慢病毒载体pLV.Ex3d.null-EF1A>WTX>IRES/EGFP并通过菌落PCR筛选鉴定,将其与辅助质粒pLV/helper-SL3,PLV/helper-SL4,PLV/helper-SL5共转染293FT细胞包装慢病毒并在荧光显微镜下行滴度值测定。用WTX慢病毒载体转导结肠癌Lovo细胞株,并通过多次挑克隆培养建立稳定表达WTX的Lovo/WTX-EGFP细胞株。结果：Gateway技术构建的慢病毒载体pLV.Ex3d.null-EF1A>WTX>IRES/EGFP经鉴定完全正确;慢病毒包装48 h后视野下可见清晰绿色荧光表达,病毒滴度为5×107 TU/mL。慢病毒载体成功转导Lovo细胞,经qPCR及Western blot检测WTX表达水平明显升高;通过多次挑克隆培养成功建立了稳定转导WTX的Lovo/WTX-EGFP细胞株。结论：通过Gateway技术可成功构建WTX慢病毒载体并获稳定转导WTX的Lovo/WTX-EGFP细胞株,为研究WTX在结肠癌中的作用机制提供了实验基础。