小鼠胚胎原始生殖细胞的体外培养

采用细胞生物学方法和组织培养技术研究小鼠胚胎原始生殖细胞(PGCs)的一般形态学特征及生物学特点.在体外培养条件下,PGCs 按体积大小可分大、中、小3类。本研究发现,中、小型原始生殖细胞在培养的第2、3 d 增多,形态似大型原始生殖细胞。培养中的 PGCs 不贴壁而悬浮生长于培养液中,培养到第6～7 d时开始死亡。体细胞(间充质细胞或间皮细胞)贴壁生长,生长旺盛,与PGCs 同时死亡。     

小鼠原始生殖细胞源胚胎干细胞的分离培养和建系

目的 :对小鼠胚胎干细胞分离材料的获取及处理、胚胎干细胞分化抑制培养、细胞系的建立及保存所用技术进行探讨。方法 :取胎鼠生殖嵴及其周围组织 ,采用胎鼠的胚胎干细胞与其成纤维细胞共培养的方式进行。结果 :分离得到大量原始生殖细胞(PGCs)集落。多次克隆传代具有胚胎干 (ES)细胞的诸多特征 ,如有连续传代的能力 (有两组分别传至 3代和 4代 ) ,有典型鸟巢状结构 ,AKP染色阳性 ,体外分化实验具有形成类胚体的能力。结论 :从胎鼠生殖嵴中能够获得大量的ES细胞。采用的胚胎干细胞与其成纤维细胞共培养的方式进行胚胎干细胞的分离培养和建系是可行的     

小鼠雌性和雄性胚胎原始生殖细胞发育的比较研究

目的 观察研究小鼠雄性和雌性胚胎中原始生殖细胞(primordial germ cell,PGCs)发育的差异,为进一步深入研究PGCs以及生殖细胞发育的基因调控提供实验依据.方法 在本研究采用C57BL/6J小鼠胚胎为实验材料,通过石蜡切片、免疫荧光组织化学染色方法,检测C57BL/6J小鼠胚胎在11至13.5d之间生殖嵴发育的形态学改变,比较雌性和雄性胚胎中原始生殖细胞数量与增殖的变化.结果 发现雄性和雌性胚胎中PGCs的数量在13.5d最多,而处于增殖期的PGCs在13d时最多;在13d的雄性胚胎中,PGCs数量上显著高于雌性,并且其中增殖期的PGCs也较雌性的多.结论 在胚胎发育早期(11至13.5d),小鼠PGCs的发育存在性别差异.     

小鼠早期胚胎原始生殖细胞的组织化学研究

对妊娠12.5～16.5d小鼠胚胎的原始性腺做恒冷箱切片与胶原酶分离标本进行组织化学研究。结果证明,原始生殖细胞含有丰富的碱性磷酸酶(AKP)和亮氨酸氨基肽酶(LNAse),后者为作者第一次发现。酸性磷酸酶(ACP),非特异性酯酶(NSE),葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase),琥珀酸脱氢酶(SDH),3-磷酸腺苷酶(ATPase),糖原及脂类含量极少。用AKP染色可把原始生殖细胞分为大、中和小3类,后者与体细胞很难区别。     

小鼠胚胎腭突间充质细胞的分离与体外培养方法研究

目的改进小鼠胚胎腭突取材方法,原代培养C57BL／6J小鼠胚胎腭突间充质细胞并加以纯化。方法通过改良方法在显微镜下切取胚胎腭突,然后应用Dispase酶消化离体腭突,纯化腭突胚胎间充质细胞,免疫荧光染色法鉴定腭突间充质细胞生物学特性。结果改良的取材方法使小鼠胚胎腭突取材更精确,操作更简单;纯化后的原代间充质细胞几乎不含上皮细胞;免疫荧光显示细胞HNK-1、S-100、波形蛋白标记阳性,角蛋白标记阴性。结论建立了一种小鼠胚胎腭突精确取材及纯化腭突外胚间充质细胞的方法,为下一步研究工作打下基础。     

小鼠胚胎脊髓及脊神经节中的细胞凋亡

目的:观察小鼠胚胎脊髓(spinal cord,SC)和脊神经节(spinalganglion,SG)发生中的细胞凋亡.方法:以体视学方法观察E12d～E15 5d ICR胎鼠H.E染色石蜡连续切片中臂丛段、胸段、腰从段的SC和SG的凋亡细胞密度(Density of apoptot ic cell,DAC).部分切片用TUNEL法标记凋亡细胞作对照.结果:胎鼠SC和SG中均见核碎裂的凋亡细胞.SC中的凋亡细胞主要分布在基板,偶见于翼板.统计结果显示,三段SC中的DAC峰值均在E14 d,P＜0.01;臂丛段的DAC高于后两段,除E15d外,P均＜0 05.胸段和腰从段SG中的DAC峰值均在E15d,P＜0.01;臂丛段的DAC峰值不明显.结论:E12d～E155d胎鼠SC和SG中,凋亡细胞主要见于脊髓的基板和脊神经节.SC的DAC峰值较SG早一天.DAC的峰值可能与其组织分化有关.     

小鼠胚胎干细胞克隆形成和传代的影响因素

目的:探讨昆明小鼠胚胎干细胞(ESC)分离后克隆形成和细胞传代的几种影响因素,对其特性作初步鉴定.方法:对比超排卵和自然受孕2种囊胚获取方法、囊胚培养液和高糖DMEM培养液2种培养液对其克隆形成和细胞传代的影响.对贴壁后形成的原代ESC克隆进行评分.稳定传代的一株ESC进行鉴定.结果:超排卵组、自然受孕组的内细胞团形成率(64.9% vs 68.2%)和原代ECS克隆形成率(10.1% vs 14.5%)比较,差异均无统计学意义(χ2=0.345和1.385,P=0.557和0.239).囊胚培养液组24 h囊胚孵出率明显高于DMEM培养液组(56.8% vs 17.1%)(χ2=33.026,P=0.001),原代ESC克隆形成率明显低于DMEM培养液组(35.2% vs 15.9%)(χ2=9.021,P=0.002).ICM的评分与ESC克隆传代能力相关(r=0.531,P＜0.001),直径70～100 μm、周边规则、隆起明显的ICM,ESC克隆传代持久.结论:高糖DMEM培养液对克隆的分离和传代有利.对ICM贴壁后形成的ESC克隆进行评分有助于确定挑选克隆传代的时机.     

葛根素对小鼠胚胎干细胞源的心肌细胞T管发育的影响

目的:探讨葛根素(puerarin)对小鼠胚胎干细胞分化的心肌细胞横管(T管)发育的影响。方法:采用经典的悬滴法诱导小鼠D3系胚胎干细胞向心肌细胞分化,在分化过程中持续使用葛根素(100μmol/L)处理;应用Di-8-ANEPPS活细胞染色观察T管的形成;Real-time PCR测定T管发育相关蛋白的mRNA表达情况。结果:⑴在分化16 d和20 d,葛根素组中有T管的心肌细胞百分比分别为(39.56±1.02)%和(39.93±2.35)%,明显高于对照组(25.28±1.27)%和(29.57±1.54)%,(P<0.01);⑵葛根素显著上调T管发育相关基因caveolin-3、amphiphysin-2和junctophinlin-2的转录水平。结论:葛根素能促进小鼠胚胎干细胞源的心肌细胞中T管的发育,该作用可能与上调T管发育相关基因表达有关。     

小鼠原始生殖细胞定向分化为神经样细胞的研究

目的：探讨微囊对原始生殖细胞（PGCs）定向分化为神经样细胞的诱导效果。方法：用原代PGCs经悬浮培养获取类胚体（EBs）;将孕13d胎鼠的大脑半球取出,将其中的神经干细胞（NSCs）作为包在微囊里的成分。待EBs贴壁后将含有NSCs的微囊放入其中,同时另外孔板中放入等量的EBs让其自然分化。将微囊诱导分化出的细胞进行NESTIN、NSE和GFAP免疫染色鉴定。结果：用微囊诱导定向分化为神经样细胞的比例显著高于自然分化的比例。结论：悬浮培养可使PGCs形成EBs,将EBs贴壁培养可自发分化形成内、中和外三个胚层的细胞,即上皮样细胞、成纤维样细胞和神经样细胞。通过微囊的诱导方法可以使EGs定向分化为神经样细胞。     

红外线对小鼠胚胎发育的影响

目的 研究不同波段红外线对小鼠胚胎的作用.方法 采用不同波段的红外线对孕鼠照射并与对照组比较的方法,观察了受孕母鼠的体重变化,活胎率,吸收胎率,以及胎鼠的身长、尾长、体重等指标.结果 红外线照射各组孕鼠的体重、胎鼠的体重、身长、尾长都有增加.中波红外线组与正常对照组相比有显著性差异(P＜0.01).结论 :红外线特别是中波红外线能促进胚胎的生长.     

氯乙烯诱导小鼠胚胎神经管发育畸形的研究

目的观察孕早期不同剂量氯乙烯(VC)染毒后胎鼠神经系统发育以及神经上皮细胞增殖和凋亡的变化情况,明确VC对神经系统发育的致畸作用。方法将孕鼠21只按完全随机设计分组法分为实验组和对照组,实验组分别用不同剂量的VC对孕6.5 d的小鼠进行腹腔染毒,对照组注射花生油,均于E12.5取胚胎。观察胎鼠的表观发育情况,计算胚胎畸形率以及神经系统异常的发生率。运用PCNA免疫组织化学技术和TUNEL染色技术检测并观察神经管上皮细胞的增殖及其凋亡的变化。结果①中剂量VC组胎鼠活胎率下降,活胎中畸胎发生率高达51%,其中神经管畸形发生率占40%,与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);高剂量VC组胎鼠活胎率仅占55%,活胎中畸胎率明显增高占71%,其中神经管畸形发生率占50%,与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。②中剂量和高剂量VC组胚胎神经管上皮厚薄不一致;高剂量组神经管多数呈明显未闭合状,神经管周围的间充质细胞肿胀,轮廓不清。③正常小鼠神经管神经上皮内可见PCNA阳性细胞与TUNEL阳性细胞分布;实验组各型阳性细胞分布与对照组相似,但随着染毒剂量的增加,PCNA阳性细胞表达减少,而TUNEL阳性细...     

成体小鼠肠神经嵴干细胞体外分离、培养及鉴定

目的:利用简化无血清培养基和连续传代法,从成体小鼠肠管分离培养肠神经嵴干细胞(GNCSCs),观察细胞体外培养过程中增殖、分化的特点.用p75, GFAP,Peripherin,α-Actin作为特异性标志来鉴定GNCSCs及其分化的细胞系.方法:将新生1, 5 d的小鼠肠管制成单细胞悬液,接种于无血清DMEM/F12完全培养基中贴壁培养,连续传代培养并观察克隆球的形成过程.将克隆球接种于含血清的DMEM/F12完全培养基中,观察其分化现象.用免疫细胞化学和免疫荧光法检测克隆球及其分化细胞系特异性标志物的表达.结果:成体小鼠肠管中有少数细胞在无血清培养基中存活且增殖形成克隆球.免疫染色表明克隆球是GNCSCs并且在血清诱导下可分化为神经元、神经胶质细胞、平滑肌细胞.结论:成体肠管中存在具有自我更新和多向分化能力的GNCSCs,在体外GNCSCs可分化为肠神经系统所必须的细胞类型.     

平皿-微滴法玻璃化冷冻保存小鼠胚胎

目的 :使用平皿 微滴法玻璃化冷冻小鼠 8～ 12细胞胚胎 ,检验该方法对胚胎的冻存效果。方法 :胚胎在EG2 0 中平衡 3min ,EFS4 0 中平衡 1min ,将含有胚胎的小于 0 .5 μl的EFS4 0 微滴吹于 35mm平皿上并立即直接浸入液氮保存。结果 :解冻后胚胎回收率达到 98.1% ,透明带无破损 ,冷冻后存活率为 95 .2 %。冻融胚胎体外发育和体内发育能力与对照组胚胎比较差异无显著性 (84 .3%对 90 .1% ,12 .1%对 13.5 % ,P >0 .0 5 )。结论 :小鼠 8～ 12细胞胚胎可以用平皿 微滴法有效地进行玻璃化冻存。     

激活素A在围植入期小鼠子宫内膜的表达

目的 探讨激活素A(activin-A)在围植入期小鼠子宫内膜中表达的分布及生物学意义.方法 应用免疫组化SP法和图像分析方法检测分析孕2～6 d小鼠子宫内膜activin-A的表达情况,并以未孕动情期及假孕2～6 d小鼠子宫内膜作对照.结果 activin-A主要表达于小鼠子宫内膜的腔上皮、腺上皮和基质细胞.acti...     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养和鉴定

目的探讨大鼠胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化,为进一步的实验研究提供基础。方法取孕14~16 d的SD大鼠胚胎端脑皮层在条件培养基中培养增殖传代分化,用神经干细胞特异性抗体———巢蛋白(Nestin)鉴定克隆细胞,用特异性的单克隆抗体鉴定克隆球诱导分化后的细胞。结果获得了大量自我增殖并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的神经干细胞。结论成功分离并获得了大鼠胚胎端脑皮层神经干细胞,并连续稳定传代,具有多向分化潜能,可用于进一步的实验研究。     

两种小鼠胚胎移植方法的比较

目的:通过将传统的撕破囊膜进行小鼠胚胎移植的方法改为囊膜穿刺,以期提高胚胎移植的成功率.方法:共移植ICR和C57BL/6供体小鼠106只,其中改进方法移植47只(ICR小鼠31只,C57BL/6小鼠16只),传统方法移植59只(ICR小鼠39只,C57BL/6小鼠20只).结果:囊膜穿刺方法将输卵管和腹壁的炎性黏连发生率由60%降低到了20%,减轻了对移植后胚胎存活的不利影响,将ICR小鼠和C57BL/6小鼠胚胎移植成功率分别提高到了61%和37%.结论:通过囊膜穿刺进行胚胎移植提高了胚胎移植成功率.     

转录因子EN2在小鼠胚胎组织中的分布

目的观察转录因子EN2在小鼠胚胎发育过程中的时空分布规律。方法利用Western blot技术检测EN2在小鼠胚胎E8.5~E17.5的表达强度;利用免疫组化技术观察EN2在胚胎发育不同时期各组织器官中的分布。结果Western blot:E8.5未检测到明显的阳性蛋白条带,E9.5~E15.5在相对分子质量为41×103处检测到清晰的EN2蛋白条带,表达水平从E9.5~E12.5逐渐增强,E13.5之后逐渐减弱,至E16.5消失。②免疫组化:在胚胎不同时期,EN2蛋白在中后脑交界部、Rathke囊周围、下颌弓、视交叉、嗅球、椎间盘、轴旁肌和一些间充质组织中都有不同程度的表达。结论EN2蛋白可能参与了神经系统、骨骼肌、椎间盘和一些间充质组织的发育与分化。     

一期缝合与术中留置T管在腹腔镜胆总管探查取石术中的应用效果比较

目的:比较一期缝合与术中留置T管在腹腔镜胆总管探查取石术(LCBDE)中的应用效果。方法:将186例行LCBDE患者随机分为一期缝合组98例与术中留置T管组88例。比较2组手术时间、术中出血量、术后住院时间、胆汁丢失量、住院费用、肛门排气时间、抗生素使用时间、输液量、输液时间、胃功能恢复时间、术后下床活动时间、不良反应及生活质量评分。结果:一期缝合组术中出血量、术后住院时间、胆汁丢失量、住院费用、肛门排气时间、抗生素使用时间、输液量、输液时间、胃功能恢复时间和术后下床活动时间均少于术中留置T管组(P<0.05~P<0.01);一期缝合组不良反应总发生率为6.82%,术中留置T管组为7.14%,差异无统计学意义(P>0.05);根据SF-36生活质量评价标准,一期缝合组患者生活质量各维度及总得分均显著高于术中留置T管组(P<0.01)。结论:与术中留置T管相比,一期缝合在LCBDE中的应用效果更佳,应加以推广及应用。