分离肝星形细胞的简便方法

目的　建立一种简便而可靠的肝星形细胞 (HSC)的分离方法。　方法　雄性 SD大鼠 ,常规门脉穿刺插管 ,蠕动泵灌注不含钙 D- Hanks液后游离肝脏 ,先后用含链霉蛋白酶 E、 型胶原酶消化液 37℃体外灌注消化和振荡消化 ,细胞悬液过滤后 ,经 1 1 % Nycodenz密度梯度离心 (2 730 r/ min× 1 5 m in)分离 HSC,锥虫蓝染色排斥法鉴定细胞活率 ,以 1× 1 0 6 m L- 1 密度混悬后接种在培养瓶。结蛋白免疫细胞化学染色鉴定 HSC纯度。　结果　成功分离 HSC,细胞得率 (1 .2～ 2 .3)× 1 0 6 g- 1 肝组织 ,活率 >90 % ,纯度 >90 % ,可用于实验研究。　结论　链霉蛋白酶E和 型胶原酶体外灌注消化及 1 1 % Nycodenz密度梯度离心是分离大鼠 HSC简便、可靠的方法     

肝星形细胞的分离与培养

目的 :分离培养大鼠肝星形细胞 ,为深入研究肝纤维化的发生机制奠定基础。方法 :采用IV型胶原酶、链酶蛋白酶消化肝脏 ,密度梯度离心分离HSC ,台盼蓝染色排斥法鉴定细胞活率 ,Desmin免疫细胞化学法鉴定HSC纯度。结果 :每只成年大鼠肝脏的HSC得率为 (2 33± 0 1 5)× 1 0 7个 ,细胞存活率在 95 %以上。免疫细胞化学显示 ,desmin阳性细胞为 (90 3± 2 8) % ,传代培养后阳性细胞在 98%以上。结论 :建立了稳定、高产的HSC分离方法 ,细胞得率、活率、纯度方面达到了国内外文献报道的水平     

大鼠肝星状细胞和枯否细胞的分离与培养方法

目的建立一种可以同时分离大鼠肝星状细胞(HSC)和枯否细胞(KC)的方法。方法选用SD大鼠,经胶原酶和蛋白酶灌注肝脏后,用18%Nycodenz密度梯度离心,分离大鼠HSC和KC,HSC处在界面,KC处在界面下。常规台盼蓝染色行细胞活力鉴定;荧光显微镜下观察自发荧光确定HSC的纯度;KC免疫细胞化学检测。结果成功分离大鼠肝星状细胞和枯否细胞,HSC得率为2×107/肝,KC得率为(3~6)×106/肝,活性>90%,纯度>90%。结论该方法建立的HSC和KC同时分离培养的方法,简单、易行、可靠,细胞纯度高,同时获得的细胞可保持良好的生物学性状。     

Optiprep法分离大鼠肝星状细胞的实验研究

目的：建立一种合理、经济、便捷的大鼠原代肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSC）分离方法。方法：运用改良肝脏原位灌注D-Hanks后,改用Ⅳ型胶原酶和DNA酶Ⅰ离体灌注,10%、16%Optiprep密度梯度离心分离大鼠肝星状细胞,台盼蓝排斥试验鉴定细胞活力,α-SMA免疫细胞化学法鉴定细胞纯度。结果：我们采用Optiprep密度梯度离心法成功分离出大鼠HSC,且活力、纯度均达到研究要求,HSC得率约为2×107/肝,细胞存活率为95%以上,纯度为90%以上。结论：本方法分离大鼠HSC合理、经济、便捷。     

实验性大鼠肝脏星状细胞的培养

目的完善大鼠肝星形细胞(HSC)的体外分离及培养方法,为肝纤维化的基础实验研究提供技术支持。方法选用Wistar大鼠经消化酶灌注肝脏后,用分离液分离HSC,通过观察其自发荧光及其显著特征性结构的脂肪染色、细胞免疫化学染色等方法鉴定。结果分离得到HSC,细胞得率为2×107/只,存活率为96%。结论通过本法成功分离及培养HSC,且方法经济、简便、稳定,有利于原代大鼠肝星状细胞的生物学研究。     

改良法大鼠肝星状细胞的分离培养及鉴定

目的:改良大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)的分离培养及鉴定方法,使之简便易行,高效可靠.方法:采用肝离体胶原酶灌注消化,低速离心去除肝细胞,密度梯度离心法分离HSC,采用台盼蓝染色排斥法鉴定细胞活率,desmin加GFAP免疫细胞化学双染色法鉴定HSC纯度.结果:采用改良法,每只大鼠的HSC得率为(2.54±0.13)×107个,细胞活率为(98.8±0.7)%,高于旧方法的HSC得率[(2.18±0.18)×107个,P＜0.01]和活率(94.3±0.6)%,P＜0.01].用desmin加GFAP免疫细胞化学双染色法鉴定,HSC纯度为(96.8±1.0)%,高于单用desmin鉴定的纯度(91.8±2.2)%(P＜0.01).结论:改良的大鼠HSC分离培养方法简便易行又经济,在保证纯度的同时,提高了得率和活率.采用desmin加GFAP免疫细胞化学双染色法鉴定细胞纯度,提高了鉴定的敏感性.     

大鼠肝星状细胞简便分离法及鉴定

目的：介绍一种简便、经济、稳定的大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）分离方法,为肝纤维化的研究提供细胞模型。方法：取符合标准的雄性SD大鼠,体重约400-450g,行肝脏门静脉插管,灌洗肝脏后,先后采用链酶蛋白酶、Ⅳ型胶原酶、DNA酶I灌注,消化肝脏制成细胞悬液,20％Nycodenz密度梯度离心分离得到原代HSC。Desmin及α—SMA抗体免疫组化鉴定纯度。结果：HSC得率2×10^7／每肝,细胞存活率及纯度达95％以上。结论：该法简便、经济,细胞得率和纯度稳定,是一种实用的大鼠HSC分离方法。     

长爪沙鼠肝星状细胞的分离培养与鉴定

目的探索长爪沙鼠稳定、经济的肝星状细胞分离和培养方法,为深入探讨长爪沙鼠肝纤维化的细胞机制提供技术支撑。方法取成年雄性长爪沙鼠,用链蛋白酶、胶原酶及DNA酶体内门静脉灌注消化长爪沙鼠肝脏细胞,经Nycodenz密度梯度离心,分离肝星状细胞。台盼蓝拒染实验鉴定细胞活力,α-SMA,Desmin免疫细胞化学染色鉴定细胞性质。结果肝星状细胞得率为0.5~1×107/肝。肝星状细胞存活率在90%以上。原代培养3 dα-SMA阳性细胞达75%以上,传代培养后,α-SMA,Desmin阳性达100%。结论成功建立了稳定可靠的长爪沙鼠肝星状细胞分离培养方法,为肝脏相关疾病研究和防治药物的开发提供了技术支持。     

Optiprep梯度离心法提取大鼠肝星状细胞的研究

目的探索SD大鼠肝星状细胞(HSCs)的提取方法,观察其生物学特性,为进一步研究它在肝纤维化和免疫应答中的可能机制奠定基础。方法依次采用前灌注液、0.15mg/ml的链霉蛋白酶E和0.5mg/ml的Ⅳ型胶原酶在体原位灌注消化肝脏。肝脏离体剪碎后,在0.3mg/ml链霉蛋白酶E、0.3mg/mlⅣ型胶原酶、0.02mg/ml DNA酶Ⅰ液中37℃振荡消化20min,低速离心(30g,5min)去除残余肝实质细胞,Optiprep密度梯度离心法获得纯化的HSCs。台盼蓝排斥试验评估HSCs细胞存活率;328nm紫外光激发HSCs自发蓝绿色荧光结合光镜鉴定细胞纯度;α-SMA免疫细胞化学方法鉴定HSCs;通过光镜观察HSCs的形态学变化。结果本方法,每只大鼠肝脏HSCs产量约8.2×106个,HSCs存活率在90%以上;原代培养24h后,纯度在85%以上;传1代后,纯度达95%以上。结论本方法简单、经济、实用,可获得较多的大鼠HSCs。     

大鼠肝星状细胞的分离、培养与鉴定

目的:改进大鼠肝星状细胞的分离、培养方法,提高其分离质量。方法:取成年雄性Wistar大鼠,用链蛋白酶、胶原酶体内门静脉灌注消化大鼠肝脏细胞,经Nycodenz密度梯度离心分离肝星状细胞。台盼蓝拒染实验鉴定细胞活力,Desmin免疫细胞化学染色鉴定细胞纯度。结果:肝星状细胞得率为2.8×107/肝。肝星状细胞存活率在90%以上。Desmin阳性细胞原代培养达90%以上,传代培养达95%以上。结论:改良大鼠肝星状细胞的分离、培养方法,有利于原代大鼠肝星状细胞的生物学研究。     

硫化氢在大鼠肝星状细胞氧应激中的作用

目的利用铁超载的方法在体外复制肝纤维化的氧应激模型，给予H2S供体硫氢化钠（NaHS）和内源性H2S作用的KATP通道阻滞剂格列苯脲（GLBN），论证氧应激下硫化氢对HSC细胞具有保护作用的假说。方法将HSC—T6分为8组：空白组、对照组、NaHS组（分为3个浓度组）、格列苯脲组（分为3个浓度组）。用CCK-8试剂盒测定HSC细胞增殖情况；用MDA试剂盒测定上清液MDA（丙二醛）含量；用SOD（超氧化物歧化酶）试剂盒测定上清液和裂解液中SOD活力；用RT—PCR试剂盒检测p38基因表达水平。结果1．Fe—NTA能够促进HSC的增殖，使p38基因表达水平降低、SOD活性降低、MDA浓度提高。对照组和空白组有明显差异（P〈0．05）；2．给予NaHS处理后，细胞增殖减慢，上清液中MDA含量下降，上清液、裂解液中SOD活性提高，p38基因表达水平增高（P〈0．05）；3．给予GLBN处理后，各项指标结果与给予NaHS处理后结果相对应，各组与对照组比较均有明显差异（P〈0．05）。结论氧应激下硫化氢对HSC细胞具有保护作用，可抑制肝纤维化的发生发展。     

福尔肝6号对肝星状细胞增殖的影响

目的：探讨福尔肝6号对肝星状细胞增殖影响的抗肝纤维化作用机理。方法：采用血清药理学实验方法作用于活化的大鼠肝星状细胞（HSC）,以^3H-TdR掺入法观察肝星状细胞增殖。结果：福尔肝6号和秋水仙碱药物血清能抑制肝星状细胞增殖,福尔肝6号药物血清组优于秋水仙碱药物血清组。结论：福尔肝6号药物血清能抑制HSC的增殖,从而减少胶原等ECM合成。     

永生大鼠肝星状细胞系的建立及鉴定

目的建立永生性大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)系.方法采用改良胶原酶原位灌注法消化肝脏,经Nycodenz密度梯度离心分离、鉴定成年Sprague-Dawley大鼠的HSC.然后通过细胞克隆建立HSC系(HSC-PQ)并传代培养.结合细胞动力学、光镜、透射电镜及免疫细胞化学技术检测HSC-PQ系的倍增时间、(平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及结蛋白表达、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成等表型特征.结果分离获得的HSC约为2×107细胞/只大鼠,细胞成活率＞95%,纯度＞90%,培养2周后几乎所有HSC均已活化.在此基础上经细胞克隆所得的HSC-PQ系表型类似成纤维细胞,倍增时间约75 h,可表达结蛋白、α-SMA以及除Ⅳ型胶原外的多种ECM成分(Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等),且传代过程中增殖、ECM表达等特性均保持稳定.该细胞系已在体外培养32代(1 a以上),提示其具有永生性.结论已成功建立永生性大鼠HSC系,该细胞系的基本特征与活化的原代HSC相似.     

大鼠肝星状细胞的简易分离法

目的在肝脏二步酶灌注法分离大鼠肝星状细胞的基础上,探讨一种简单易行且结果稳定的分离方法。方法采用大鼠肝脏二步酶灌注法对成年大鼠的肝脏进行消化,经密度梯度离心去杂质后得到肝星状细胞。台盼蓝拒染实验鉴定细胞活率,结蛋白(Desmin)免疫荧光鉴定肝星状细胞的纯度。结果肝星状细胞的得率为4.0×107以上,肝星状细胞纯度为96%左右,肝星状细胞存活率为(95.0±1.2)%。结论本实验采用的大鼠肝星状细胞的分离方法,结果稳定,细胞纯度较高,有利于进一步的生物学研究。     

剔毒护肝方药物血清对大鼠肝星状细胞增殖及凋亡的影响

目的：探讨剔毒护肝方对大鼠肝星状细胞增殖及凋亡的影响。方法：分离正常肝星状细胞，并传代培养；用剔毒护肝方给正常大鼠灌胃，制备药物血清，温育培养细胞；用^3H-TdR掺入法观察细胞增殖，TUNEL检测细胞凋亡。结果：剔毒护肝方药物血清能显抑制肝星状细胞增殖。并能促进肝星细胞凋亡。结论：剔毒护肝方具有抑制肝星状细胞增殖和促进其凋亡的作用。     

巨噬细胞游走抑制因子参与肝星状细胞活化的实验研究

目的 探讨大鼠肝星状细胞(HSC)活化过程中表达巨噬细胞游走抑制因子(MIF)的变化,以及MIF特异的反义寡核苷酸(MIF-ASONs)对活化的原代HSC表达MIF和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的影响。 方法 检测分离培养不同时间(1、3、5、7和10 d)的HSC,以及转染MIF-ASONs后的HSC中MIF和α-SMA的表达。基因表达用RT-PCR,蛋白表达用酶联免疫吸附(ELISA)、免疫荧光(IF)或免疫细胞化学(ICC)检测。 结果 随着培养时间延长,原代HSC形态逐渐改变,脂滴减少消失,自行激活;MIF基因和蛋白表达逐渐增加(P<0.05),且MIF与α-SMA mRNA表达正相关(r=0.944,P<0.01);活化的原代HSC转染MIF-ASONs后MIF与α-SMA基因表达和MIF蛋白表达均比对照组低(P<0.05)。 结论 HSC活化过程中,MIF表达逐渐增加并与α-SMA正相关;MIF-ASONs可抑制HSC活化,提示MIF是HSC活化过程中一种重要的细胞因子,可能参与肝纤维化的发生。     

Effect of retinoid X receptor alpha (RXRα) transfection on the proliferation and phenotype of rat hepatic stellate cells in vitro

Objective To study the effect of retinoid X receptor alpha (RXRα) transfection plus treatment with the RXRα ligand, 9-cis-RA, on the proliferation and phenotype of platelet-derived growth factor (PDGF)-activated hepatic stellate cells (HSCs). Methods PDGF activated rat hepatic stellate cells were transfected with eukaryotic expression vector pcDNA3.1- human RXRα, and confirmed by Western blot. Proliferation of transfected HSC was assayed by bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation as well as MTT, and the phenotype (α-smooth muscle actin, desmin) was observed by immunocytochemistry with image analysis. Results Transfection of the RXRα gene and treatment with ligand 9-cis-RA of PDGF-activated HSCs extended the increased expression of RXRα protein for at least 168 hours. Cell proliferation and expressions of alpha-smooth muscle actin (α-SMA) and desmin were blocked, compared with groups of sham-transfected, PDGF-activated, no transfection, no ligand treatment, and irrelevant ligand treated HSCs. Conclusion Transfection with the RXRα gene followed by 9-cis-RA ligand treatment will inhibit the proliferation and reverse the phenotype of activated HSC.