胰岛素样生长因子Ⅰ抑制氧化型低密度脂蛋白诱导内皮细胞凋亡的体外试验

目的:胰岛素样生长因子Ⅰ作为重要的促细胞生长因子之一,其对内皮细胞凋亡影响的报道不多.实验拟验证和探讨胰岛素样生长因子Ⅰ对氧化型低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的抑制作用及可能机制.方法:实验于2006-12/2007-07在华中科技大学同济医学院协和医院心血管疾病研究所完成.①实验材料及分组处理:取人新鲜脐带(产妇或家属签署知情同意书)分离培养人脐静脉内皮细胞,分为: 胰岛素样生长因子Ⅰ组(1×10-9 mmol/L)、氧化型低密度脂蛋白(200 mg/L) 胰岛素样生长因子Ⅰ组(1×10-9 mmol/L)、氧化型低密度脂蛋白(200 mg/L)组、正常对照组.分别在细胞培养24 h后加入.②实验评估:采用四甲基偶氮唑盐法测定细胞活力;DAPI细胞核荧光染色法观察细胞凋亡的形态学变化及细胞凋亡率的测定;并进行内皮细胞 caspase-3活性的检测.结果:①氧化型低密度脂蛋白可明显抑制人脐静脉内皮细胞增殖,胰岛素样生长因子Ⅰ与氧化型低密度脂蛋白共同加入后,细胞增殖率明显上升(P ＜ 0.05).②氧化型低密度脂蛋白可诱导人脐静脉内皮细胞发生凋亡,而加入胰岛素样生长因子Ⅰ刺激后细胞凋亡率降低(P ＜ 0.05).③caspase-3活性检测表明与对照组相比,氧化型低密度脂蛋白能明显上调caspase-3的表达,而胰岛素样生长因子Ⅰ 氧化型低密度脂蛋白组caspase-3活性则降低(P ＜ 0.05).结论:胰岛素样生长因子Ⅰ对氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡具有抑制作用,可能与其下调caspase-3蛋白表达有关.     

三七总皂苷对氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞血管细胞黏附分子1表达的影响

背景：氧化低密度脂蛋白能诱导血管内皮细胞活化和黏附分子表达,在动脉粥样硬化形成早期起重要作用。三七总皂苷在心血管系统方面具有保护血管内皮细胞、显著改善动脉粥样硬化病变程度的药理作用。目的：验证三七总皂苷对氧化型低密度脂蛋白损伤内皮细胞后血管细胞黏附分子1的表达及与人单核细胞黏附的影响。设计、时间及地点：体外实验,分组对照,于2007—03／2008—05在北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部重点实验室完成。材料：原代人脐静脉内皮细胞为美国CascadeBiologics公司产品;三七总皂苷（血塞通冻干粉针）为黑龙江珍宝岛制药有限公司产品,成分为三七总皂苷,批号：20040207。方法：以培养原代人脐静脉内皮细胞作为靶细胞,用氧化型低密度脂蛋白造成人脐静脉内皮细胞损伤模型。将培养的人脐静脉内皮细胞分为5组：氧化型低密度脂蛋白组（100mg／L）、氧化型低密度脂蛋白＋三七总皂苷组（终浓度分别为200,100,50mg／L）、正常对照组。主要观察指标：光镜下观察细胞形态变化,四甲基偶氮唑盐法检测细胞活性;采用蛋白定量法检测人脐静脉内皮细胞与单核细胞的黏附率;用流式细胞仪测定人脐静脉内皮细胞的血管细胞黏附分子1的蛋白表达。结果：氧化型低密度脂蛋白作用人脐静脉内皮细胞后12,24．h时,人脐静脉内皮细胞损伤明显,细胞活性显著降低,人单核细胞与人脐静脉内皮细胞的黏附率显著升高,人脐静脉内皮细胞的血管细胞黏附分子1的蛋白表达水平也均明显升高,_均明显高于正常对照组（P〈0．05,P〈0．01）,而三七总皂苷能使氧化型低密度脂蛋白损伤的人脐静脉内皮细胞形态趋于正常,活性增强,并明显降低人单核细胞与人脐静脉内皮细胞的黏附率,以及显著降低血管细胞黏附分子1的蛋白的表达水平,与氧化型低密度脂蛋白组相比均有显著性差异（P〈0．05,P〈001）,这种作用随着剂量的增加而增强。结论：三七总皂苷能通过下调血管细胞黏附分子1的表达抑制单核一血管内皮细胞黏附,从而发挥对血管内皮细胞的保护作用,这可能是其治疗动脉硬化闭塞症的机制之一。     

辛伐他汀对人脐静脉内细胞CD40／CD40L表达的影响

目的：探讨辛伐他汀对氧化低密度脂蛋白刺激下的人脐静脉内皮细胞CD40／CD40L表达的影响。方法：实验于2004—03／06在中南大学湘雅二医院实验室完成。实验所用脐带于无菌条件下取自本院产房健康新生儿，产妇知情同意，实验符合赫尔辛基宣言中的伦理学标准。辛伐他汀原粉由杭州默沙东制药公司提供。原代培养人脐静脉内皮细胞，实验在第4代有70％细胞汇合的情况下进行。低密度脂蛋白快速分离后加入含10μmol／L硫酸铜的磷酸盐缓冲液氧化修饰24h，在准备后15d内用于实验。采用流式细胞技术检测CD40／CD40L在细胞上的表达，采用逆转录多聚酶链式反应检测NF-κBP65 mRNA，同时行细胞免疫化学染色检测细胞NF-κBP65的表达。观察辛伐他汀对氧化低密度脂蛋白刺激人脐静脉内皮细胞表达CD40／CD40L分子和NF-κB P65 mRNA的影响实验中，共分5组：①空白对照组，给予磷酸盐缓冲液。②氧化低密度脂蛋白刺激组，80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h。③低浓度辛伐他汀组，先予1μmol／L辛伐他汀干预1h，再予80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h。④高浓度辛伐他汀组，先予10μmol／L辛伐他汀干预1h，再予80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h。⑤单纯辛伐他汀组，10μmol／L辛伐他汀干预25h。免疫化学检测人脐静脉内皮细胞NF-κBP65分子表达的实验中，共分3组：①空白对照组，给予磷酸盐缓冲液。②氧化低密度脂蛋白刺激组，80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h。③辛伐他汀组，10μmol／L辛伐他汀干预1h，再予80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h。结果：①氧化低密度脂蛋白刺激人脐静脉内皮细胞后CD40／CD40L的表达情况：20-80mg／L氧化低密度脂蛋白与人脐静脉内皮细胞共同培养24h后，CD40／CD40L的表达以浓度依赖和时间依赖的方式增加。②辛伐他汀对氧化低密度脂蛋白刺激的人脐静脉内皮细胞CD40／CD40L表达的影响：预先给予辛伐他汀（1μmol／L和10μmol／L）干预1h明显降低氧化低密度脂蛋白所致的CD40／CD40L表达，与单纯氧化低密度脂蛋白刺激组比较，差异显著（P均〈0．05）；10μmol／L的高浓度辛伐他汀较1μmol／L的低浓度辛伐他汀作用更明显（P〈0．05）；而单纯给予10μLmol／L的辛伐他汀干预不影响人脐静脉内皮细胞CD40／CD40L的表达。③辛伐他汀对NF-v：BP65 mRNA在人脐静脉内皮细胞表达的影响：人脐静脉内皮细胞中加入80mg／L氧化低密度脂蛋白培养24h后NF-κB mRNA的表达明显高于空白对照组（0．53&;#177;0．06，0．08&;#177;0．01，P〈0．01）。而预先给予1μmol／L辛伐他汀孵育lh显著降低氧化低密度脂蛋白刺激升高的NF-κB P65 mRNA，明显低于单纯氧化低密度脂蛋白刺激组（0．31&;#177;0．04，0．53&;#177;0．06，P〈0．01）。高浓度组（10μmol／L）作用更显著，显著低于单纯氧化低密度脂蛋白刺激组（0．14&;#177;0．04，0．53&;#177;0．06，P〈0．01），而单纯给予辛伐他汀（10μmol／L）不影响人脐静脉内皮细胞NF-κB P65 mRNA的表达。结论：氧化低密度脂蛋白以浓度和时间依赖的方式刺激人脐静脉内皮细胞表达CD40/CD40L，而辛伐他汀以剂量依赖的方式减轻氧化低密度脂蛋白刺激下人脐静脉内皮细胞CD40/CD40L的表达，可能与其抑制人脐静脉内皮细胞的NF—κBP65的表达有关。提示辛伐他汀可通过抑制高脂血症患者炎症信号通路而到达抗动脉硬化的作用。     

尼莫地平对氧化低密度脂蛋白诱导人血管内皮细胞凋亡的影响

目的研究尼莫地平对不同浓度氧化低密度脂蛋白诱导的人血管内皮细胞凋亡的影响。方法在人脐静脉内皮细胞株ECV304培养基中加入不同浓度氧化低密度脂蛋白和尼莫地平（1.2μg/ml）,作用6-24 h。透射电镜观察内皮细胞ECV304的凋亡情况;流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率;用激光共聚焦显微镜检测钙离子浓度。结果不同浓度氧化低密度脂蛋白能明显诱导培养的内皮细胞发生凋亡,尼莫地平可显著降低氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞凋亡率（P〈0.01）。结论尼莫地平对氧化低密度脂蛋白诱导的人血管内皮细胞凋亡具有保护作用。     

重组人胰岛素样生长因子I对成骨细胞的影响

背景：人胰岛索样生长因子I在成骨细胞中含量丰富,与骨密度有密切关系。目的：观察重组人胰岛素样生长因子I对体外培养大鼠成骨细胞的增殖、凋亡及碱性磷酸酶合成的影响。方法：不同质量浓度重组人胰岛素样生长因子I刺激体外培养的大鼠成骨细胞,噻唑蓝法测定活细胞数量;肿瘤坏死因子a单独或与重组人胰岛素样生长因子I共同刺激成骨细胞,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率,采用对硝基酚磷酸盐法测定细胞裂解液中碱性磷酸酶活性。结果与结论：与对照组相比,一定剂量的重组人胰岛素样生长因子I能明显增加大鼠成骨细胞数量（P〈0．05）,在质量浓度为0．1-100pg／L时,成骨细胞数量的增加与质量浓度呈正相关;肿瘤坏死因子a在0．1-100pg／L范围内呈剂量依赖性地促进成骨细胞凋亡（户〈0．05）,并使S期细胞减少（尸〈0．05）,而重组人胰岛素样生长因子I能抑制肿瘤坏死因子a对成骨细胞的促凋亡作用（P〈0．05）：与对照组相比,重组人胰岛素样生长因子I刺激的成骨细胞碱性磷酸酶的活性明显增高（尸〈0．05）。重组人胰岛素样生长因子I对大鼠成骨细胞有明显的促增殖作用,且能明显抑制肿瘤坏死因子a诱导的大鼠成骨细胞凋亡,提示增加成骨细胞数量可能是重组人胰岛索样生长因子I促进骨形成的机制之一：重组人胰岛素样生长因子I能促进大鼠成骨细胞碱性磷酸酶的合成,提示重组人胰岛素样生长因子I有可能促进骨基质的合成和钙化。     

人脐静脉内皮细胞中单核细胞趋化因子1表达与糖化白蛋白的影响

背景：研究表明，糖化白蛋白在内皮细胞凋亡过程中发挥重要作用，并通过增加丝裂原活化蛋白激酶、酪氨酸激酶活性和产生活性氧产物介导单核细胞趋化因子1。 目的：观察糖化白蛋白对培养的人脐静脉内皮细胞的单核细胞趋化因子1表达的影响。 设计、时间及地点：单一样本观察，于2006—05／11在东南大学心血管实验室完成。 材料：脐静脉内皮建株人脐静脉内皮细胞ECV304，引自中国科学院上海细胞生物研究所。 方法：实验分两部分，第一部分以糖化白蛋白（浓度为400mg／L）对人脐静脉内皮细胞分别干预0，8，16，24，48，72h；第二部分以不同浓度（100，200，400，800mg／L）的糖化白蛋白对人脐静脉内皮细胞干预24h。两部分实验均用无血清培养基RPMI 1640和不含牛血清白蛋白葡萄糖干预（浓度为400mg／L）的无血清培养基作为对照。 主要观察指标：四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法检测人脐静脉内皮细胞增殖，酶联免疫吸附法检测人脐静脉内皮细胞上清液单核细胞趋化因子1含量。 结果：①不同时间点糖化白蛋白对人脐静脉内皮细胞增殖的抑制作用依次为48h〉24h〉16h（相临时间点比较，P均〈0．05）；干预8h对细胞的抑制无明显作用，72h抑制作用弱于48h。②与RPMI1640组和牛血清白蛋白组相比，糖化白蛋白400mg／L及800mg／L对细胞的抑制作用明显增强（P〈0．05），并随着糖化白蛋白浓度的增高而增强。③用浓度为400mg／L的糖化白蛋白干预6h及12h，人脐静脉内皮细胞单核细胞趋化因子l表达持续升高（P〈0．05）；随着糖化白蛋白浓度加大，细胞的单核细胞趋化因子1表达进一步增高，800mg／L时达到最高峰。 结论：①糖化白蛋白以浓度、时间依赖方式抑制人脐静脉内皮细胞增殖，并在一定时间范围内呈时间依赖性地增加人脐静脉内皮细胞表达单核细胞趋化因子1表达。     

胰岛素和胰岛素样生长因子Ⅰ对高糖条件下成骨细胞的影响

目的：观察胰岛素和胰岛素样生长因子Ⅰ在高浓度葡萄糖条件下对成骨细胞增殖和矿化的影响，探讨胰岛素和胰岛素样生长因子Ⅰ对糖尿病性骨质疏松和骨质减少治疗的作用。方法：实验于2004—07／2005-09在第四军医大学唐都医院感染病中心完成。健康新生24h内的SD仔鼠3只。①采用组织块培养法分离培养新生SD大鼠颅骨成骨细胞，分别给以不同葡萄糖浓度的培养液，即正常浓度葡萄糖（5．5mmol／L）和高浓度葡萄糖（25．5mmol／L）。在高糖条件下分别加人胰岛素（10^-6mmol／L）和胰岛素样生长因子Ⅰ（10^-7mmol／L）。所有实验分为四组：正常浓度葡萄糖组，高浓度葡萄糖组，高浓度葡萄糖＋胰岛素样生长因子Ⅰ组，高浓度葡萄糖＋胰岛素组。②MTT法检测不同培养条件对成骨细胞增殖的影响。③原子能吸收法检测钙离子吸收量和体外诱导骨结节的形成来评价成骨细胞的分化。结果：①MTT比色法显示连续培养5d，不同组吸光度值均成比例增加，与正常浓度葡萄糖相比，高浓度葡萄糖显著促进细胞的增殖，细胞生长率显著高于其他组。胰岛素和胰岛素样生长因子Ⅰ下调了高浓度葡萄糖导致的细胞增殖，除第1天以外，该两组细胞的生长率与正常浓度葡萄糖组的结果相似。②从第17天到第32天，各组的钙吸收量显著增加，但高糖组的钙吸收量明显低于其他组。胰岛素样生长因子Ⅰ组的钙吸收量高于胰岛素组，与正常浓度葡萄糖组的钙吸收量相比没有明显差别（P〉0．05）。在第32天，高糖组的骨结节数明显低于其他组，而且多数细胞仍处于增殖阶段，钙化的细胞很少。胰岛素样生长因子Ⅰ组的骨结节数多于胰岛素组（P〈0．05），少于正常葡萄糖组（P〉0．05）。结论：高浓度葡萄糖刺激成骨细胞增殖但抑制细胞矿化可能直接导致了糖尿病性骨病的病理改变；胰岛素和胰岛素样生长因子Ⅰ对其矿化的促进作用可能是治疗糖尿病性骨质减少和骨质疏松的机制之一。     

银杏黄酮苷元对ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞P-选择素、LOX-1表达的影响

目的：探讨银杏黄酮苷元（ginkgetin aglycone,GA）对氧化低密度脂蛋白（oxidized-low density lipoprotein,ox-LDL）诱导的人脐静脉内皮细胞P-选择素和植物血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1（lectin—like oxidized low density lipoprotein receptor-1,LOX-1）表达的影响。方法：培养人脐静脉内皮细胞株ECV304,分为对照组、ox-LDL组、LOX-1拮抗剂聚肌苷酸加ox-LDL混合刺激组（聚肌苷酸组）、不同含量GA加ox-LDL混合刺激组（GA6．25mg／L组、GA12．5mg／L组、GA25mg／L组和GA50mg／L）,通过逆转录聚合酶链式反应检测P-选择素mRNA和LOX-1mRNA表达,用ELISA检测各组培养基上清中P-选择素蛋白含量,辣根过氧化物酶免疫组织化学法检测LOX．1蛋白,并作比较。结果：OX-LDL上调内皮细胞P-选择素和LOX-1表达（P〈0．05）;6．25～50mg／LGA明显抑制OX-LDL诱导的内皮细胞P-选择素mRNA和LOX．1mRNA和蛋白表达（P〈0．05）;聚肌苷酸可部分或完全阻断OX-LDL诱导的内皮细胞P．选择素mRNA、LOX-1mRNA及其蛋白表达（P〈0．05）。结论：GA通过抑制LOX-1表达而降低内皮细胞合成和分泌黏附分子P-选择素,这可能是其抗动脉粥样硬化的机制之一。     

人巨细胞病毒感染对人脐静脉内皮细胞周期和凋亡的影响——动脉粥样硬化发生的可能病因

目的：探讨人巨细胞病毒感染对人脐静脉内皮细胞细胞周期和细胞凋亡的影响。方法：实验于2003—06／2004／06在解放军第四军医大学老年病二科和解放军第四军医大学基础部生理学教研室完成。①细胞来源及分组：将液氮中冻存的人巨细胞病毒AD169株，用人胚肺成纤维细胞进行增殖培养6-8代；将人脐静脉内皮细胞消化成单细胞悬液，用DMEM培养基重新悬浮，细胞以一传三种于培养瓶继续培养至细胞贴壁并已伸展但未汇合，用台盼蓝拒染法检查活细胞数大于95％，对照组为空白对照，实验组接种人巨细胞病毒169病毒株。②组织学及实验室检查：凋亡的人脐静脉内皮细胞形态学特点在倒置相差显微镜下观察。两组人脐静脉内皮细胞增殖情况采用四甲基偶氮唑蓝比色法，以酶联免疫检测仪测得的A490值表示。两组人脐静脉内皮细胞的细胞周期变化采用流式细胞技术（在荧光激活细胞分选仪上进行细胞周期分析）；检测两组人脐静脉内皮细胞的细胞凋亡情况以Annex—in V染色法的以荧光强度判定。结果：①凋亡的人脐静脉内皮细胞形态学特点：正常的生长融合的人脐静脉内皮细胞呈铺路石状镶嵌排列，细胞边界清楚，胞浆丰富，胞核椭圆居中，核仁明显；凋亡的细胞有的变成大细胞。②人巨细胞病毒对人脐静脉内皮细胞增殖的影响：人巨细胞病毒感染人脐静脉内皮细胞后24h，对照组与人巨细胞病毒组A490值分别为1．09&;#177;0．08与2．08&;#177;0．09（t=7．96，P〈0．05）。③人巨细胞病毒对人脐静脉内皮细胞细胞周期的影响：正常对照组G0／G1期的细胞为74．4％，加入人巨细胞病毒后为59．3％，较正常对照组降低20．3％（P〈0．05）。④人巨细胞病毒对人脐静脉内皮凋亡的影响：正常对照组凋亡细胞为8.3％，当加人人巨细胞病毒后为5.8％，较对照组降低30．1％（P〈0．01）。结论：人巨细胞病毒感染人脐静脉内皮细胞后，引起细胞生长周期和凋亡水平的改变增加G0／G1期细胞进入S和G2／M期，降低细胞凋亡，导致细胞最终表现为增殖。     

穿膜肽-凋亡蛋白融合蛋白导入人脐静脉内皮细胞和人肺腺癌Anip973细胞的生物学特性

目的：在大肠杆菌内表达穿膜肽与凋亡蛋白的融合蛋白，观察其诱导肺腺癌Anip973细胞凋亡的活性，并了解其是否有剂量依赖性。 方法：实验于2005-08／2006-01在哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室完成。①在大肠杆菌中表达穿膜肽-凋亡蛋白并用IDA-Ni^2＋亲和层析纯化。②细胞增殖抑制实验：取对数生长期人脐静脉内皮细胞和Anip973细胞接种于96孔培养板中，培养12h后加入终浓度分别为0，10，20，30，40，50mg／L融合蛋白培养48h，弃上清，每孔中加入四甲基偶氮唑盐溶液（5g／L）20μL，继续孵育4h，检测吸光度，计算肿瘤生长抑制率。③取对数生长期人脐静脉内皮细胞、Anip973细胞，每种细胞分成两组：给药组加入终浓度为30mg／L穿膜肽-凋亡蛋白，对照组加入相同体积的磷酸盐缓冲液，继续培养48h。苏木精-伊红染色，光镜下观察细胞形态；溴乙啶／丫啶橙荧光染色观察细胞凋亡率。 结果：①细胞增殖抑制实验结果表明浓度为10～50mg／L穿膜肽-凋亡蛋白对人脐静脉内皮细胞没有明显抑制作用，对Anip973细胞呈剂量依赖性抑制作用，半数抑制浓度为27mg／L。②30mg／L穿膜肽-凋亡蛋白作用48h后，人脐静脉内皮细胞形态没有显著改变，对照组和给药组的凋亡率分别为（2．9&;#177;0．4）％和（3．1&;#177;0．6）％，没有显著差异（P〉0．05）；Anip973细胞可见到细胞皱缩，染色质浓缩和出现凋亡小体等凋亡特征性形态变化，给药组和对照组凋亡率分别为（36．8&;#177;1．7）％和（6．7&;#177;0．5）％，差异显著（P〈0．01）。 结论：穿膜肽-凋亡蛋白能诱导肿瘤细胞凋亡，这种作用呈剂量依赖性，而对正常细胞没有毒性作用。     

三七总皂苷对氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞血管细胞黏附分子1表达的影响水

背景:氧化低密度脂蛋白能诱导血管内皮细胞活化和黏附分子表达,在动脉粥样硬化形成早期起重要作用.三七总皂苷在心血管系统方面具有保护血管内皮细胞、显著改善动脉粥样硬化病变程度的药理作用.目的:验证三七总皂苷对氧化型低密度脂蛋白损伤内皮细胞后血管细胞黏附分子1的表达及与人单核细胞黏附的影响.设计、时间及地点:体外实验,分组对照,于2007-03/2008-05在北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部重点实验室完成.材料:原代人脐静脉内皮细胞为美国Cascade Biologics公司产品;三七总皂苷(血塞通冻干粉针)为黑龙江珍宝岛制药有限公司产品,成分为三七总皂苷,批号:20040207.方法:以培养原代人脐静脉内皮细胞作为靶细胞.用氧化型低密度脂蛋白造成人脐静脉内皮细胞损伤模型.将培养的人脐静脉内皮细胞分为5组:氧化型低密度脂蛋白组(100 mg/L)、氧化型低密度脂蛋白+三七总皂苷组(终浓度分别为200,100,50 mg/L)、正常对照组.主要观察指标:光镜下观察细胞形态变化,四甲基偶氮唑盐法检测细胞活性;采用蛋白定量法检测人脐静脉内皮细胞与单核细胞的黏附率;用流式细胞仪测定人脐静脉内皮细胞的血管细胞黏附分子1的蛋白表达.结果:氧化型低密度脂蛋白作用人脐静脉内皮细胞后12,24 h时,人脐静脉内皮细胞损伤明显,细胞活性显著降低,人单核细胞与人脐静脉内皮细胞的黏附率显著升高,人脐静脉内皮细胞的血管细胞黏附分了1的蛋白表达水平也均明显升高,均明显高于正常对照组(P<0.05,P<0.01),而三七总皂苷能使氧化型低密度脂蛋白损伤的人脐静脉内皮细胞形态趋于正常,活性增强,并明显降低人单核细胞与人脐静脉内皮细胞的黏附率,以及显著降低血管细胞黏附分子1的蛋白的表达水平,与氧化型低密度脂蛋白组相比均有显著性差异(P<0.05,P<0.01),这种作用随着剂量的增加而增强.结论:三七总皂苷能通过下调血管细胞黏附分子1的表达抑制单核-血管内皮细胞黏附,从而发挥对血管内皮细胞的保护作用,这可能是其治疗动脉硬化闭塞症的机制之一.     

阴性突变Rac-N17基因转染对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的 探讨基因转染对内皮细胞凋亡的影响及其相关机制。方法 采用凝血酶诱导法诱导人脐静脉内皮细胞株（HUVECs）凋亡，检测细胞凋亡情况及caspase-3活性。结果 结果显示，凝血酶诱导48 h后，HUVECs细胞浆内颗粒和空泡增多，细胞凋亡率明显增高，caspase-3活性明显增加，而加入RacN17干预后，细胞凋亡率明显降低、caspase-3活性明显下降。结论 Rac-N17基因转染能防止细胞的凋亡与衰老，保护血管内皮细胞。     

关节软骨缺损修复的基因治疗实验 人胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染软骨细胞及其在软骨细胞中的表达

目的：探讨胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染人软骨细胞的可能性及其在软骨细胞中的表达，并初步判断转基因细胞的生物学功能变化。方法：实验于2002-07／2003-06在中山大学附属第二医院医学研究中心完成。①构建pcDNA3.1-胰岛素样生长因子Ⅰ／GS质粒。将构建质粒在大肠杆菌DH10B中大量扩增后，抽提纯化质粒，并对质粒进行测序鉴定。②将鉴定的质粒用阳离子脂质体转染人关节软骨细胞，通过逆转录-聚合酶链反应、Westren-blot等方法检测胰岛素样生长因子Ⅰ基因在人关节软骨细胞中的表达。③分别将同代软骨细胞与转基因细胞的培养液、软骨细胞与转基因细胞裂解液和二甲基亚甲蓝共孵育后，检测各混合液的吸光度，以此判断同代软骨细胞、转基因细胞、软骨细胞培养液、转基因细胞培养液中的蛋白多糖含量。结果：①质粒鉴定结果：质粒抽提纯化后电泳可见3条DNA条带，符合质粒的电泳图谱；质粒的测序结果和胰岛素样生长因子Ⅰ基因序列完全吻合。②胰岛素样生长因子Ⅰ基因在软骨细胞中的表达：质粒转染软骨细胞后，反转录-聚合酶链反应能见到298bp的胰岛素样生长因子ⅠmRNA片断的表达；Western-blot可见7．6ku的胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白表达条带。③转胰岛素样生长因子Ⅰ基因对软骨细胞分泌蛋白多糖的影响：转基因软骨细胞裂解液和同代的软骨细胞裂解液的蛋白多糖含量分别是（5．23&;#177;0．62）mg／L和（2．47&;#177;0．31）mg／L．两组比较，差异有显著性意义（t=2．88，P〈0．05）；转基因软骨细胞培养液和同代非转染软骨细胞培养液中的蛋白多糖含量分别为（9．92&;#177;1．04）mg／L和（4．56&;#177;0．51）mg／L，两组比较，差异有显著性意义（t=6．47，P〈0．05）。结论：胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染人关节软骨细胞后能在软骨细胞中表达，并能促进软骨细胞分泌软骨基质蛋白多糖，具有促DNA合成和维持软骨细胞表型稳定的能力。转胰岛素样生长因子Ⅰ基因软骨细胞的研究为体外软骨组织工程和关节软骨病的基因治疗提供了直接的实验依据。     

与胶原浮胶细胞共培养中内皮细胞血管新生相关基因的表达

背景：内皮细胞和平滑肌细胞的相互调节是稳定血管壁结构的关键因素，两者共同培养能够分别影响各自的形态和功能。目的：利用Ⅰ型胶原浮胶建立人脐静脉内皮细胞与人血管平滑肌细胞共培养体系，分析细胞之间的相互作用。设计、时间及地点：单一样本观察，于2006—10／2008—01在复旦大学上海医学院分子生物学实验室完成。材料：新鲜脐带取自国际第一妇婴保健医院，产妇知情同意。方法：取新鲜脐带，利用胶原酶灌注法分离人脐静脉内皮细胞，组织块培养法分离人血管平滑肌细胞。人血管平滑肌细胞直接种植于培养板表面，人脐静脉内皮细胞种植于鼠尾Ⅰ型胶原表面制成胶原浮胶，并与培养板上的人血管平滑肌细胞共培养。以人脐静脉内皮细胞单独在浮胶底面培养，培养板表面无人血管平滑肌细胞为对照。主要观察指标：①免疫荧光方法鉴定人血管平滑肌细胞和人脐静脉内皮细胞。光镜和电镜观察人脐静脉内皮细胞形态。②反转录-聚合酶链反应进行基因表达分析。结果：原代培养的内皮细胞呈铺路石样形态，CD31染色阳性。原代培养的人血管平滑肌细胞免疫荧光染色Q-SMA呈阳性。胶原支架上内皮细胞伸展，胶原纤维重新排列，24h后出现管腔样结构。在共培养体系中，人脐静脉内皮细胞的金属蛋白酶1和金属蛋白酶9基因表达量显著高于单独培养组人脐静脉内皮细胞的表达量（P〈0．05）。但层粘蛋白γ2和组织因子途径抑制物2的基因相对表达量在两组间未见明显变化。结论：实验建立的共培养体系，可以观察到与平滑肌细胞共培养的血管内皮细胞形成更加丰富的网络状管腔样结构，更易于血管结构的形成。     

胰岛素样生长因子1及血小板源性生长因子对人退变髓核细胞生物学活性的影响

背景：有研究表明胰岛素样生长因子1和血小板源性生长因子可抑制人椎间盘细胞凋亡。目的：观察在体外培养条件下胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子对人退变髓核细胞生物学活性的影响。方法：体外单层培养人退变髓核细胞,通过免疫组织化学鉴定细胞。对传3代人退变髓核细胞采用分别不同生长因子干预,实验分4组：胰岛素样生长因子1组,血小板源性生长因子组,胰岛素样生长因子1＋血小板源性生长因子组及对照组。结果与结论：胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子均可促进细胞增殖,促进细胞合成Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖,其中胰岛素样生长因子1促Ⅱ型胶原合成作用强于血小板源性生长因子（P〈0.05）,血小板源性生长因子促蛋白聚糖合成作用强于胰岛素样生长因子1（P〈0.05）。胰岛素样生长因子1促进细胞合成Ⅰ型胶原,血小板源性生长因子抑制细胞合成Ⅰ型胶原。结果证实,胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子均可通过促进细胞增殖、促进细胞合成Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖,从而提高人退变髓核细胞的生物学活性。     

碱性成纤维细胞生长因子荧光真核表达载体构建及对过氧化氢诱导血管内皮细胞凋亡的影响

背景：已证实外源性碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）可抑制血管内皮细胞凋亡。目的：构建表达bFGF的荧光真核表达载体,探讨其对过氧化氢（H2O2）诱导的血管内皮细胞凋亡和凋亡相关蛋白的影响。方法：通过基因亚克隆构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,利用脂质体介导将bFGF基因导入人脐静脉内皮细胞内,通过荧光观察和RT-PCR检测基因的表达。实验分为3组,对照组（转染pcDNA3.1）、过氧化氢组（转染pcDNA3.1＋H2O2）和bFGF转染＋过氧化氢组（转染pcDNA3.1-bFGF-GFP＋H2O2）,流式细胞术测定细胞凋亡率,Western blot检测caspase-3 P17活性亚单位和Bax蛋白表达。结果与结论：成功构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,该载体转染人脐静脉内皮细胞后,bFGF mRNA显著增加,并可观察到绿色荧光。与对照组相比,过氧化氢组细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量都明显增加（P〈0.01）,而bFGF转染＋过氧化氢组的细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量则比过氧化氢组显著降低（P〈0.01）。证实bFGF基因转染能抑制过氧化氢诱导的血管内皮细胞凋亡,其作用机制可能与调控Bax蛋白表达和caspase-3活性有关。     

脑源性神经营养因子与胰岛素样生长因子Ⅰ促进神经干细胞向神经元定向分化的作用差异

目的：选用脑源性神经营养因子及胰岛素样生长因子Ⅰ作为诱导分化剂。观察其对神经干细胞定向分化的作用及其效应差异。方法：实验于2004—12／2005—10在南京医科大学第一附属医院中心实验室完成。以无血清培养法从孕14～17d的胚胎大鼠脑组织分离接养获得神经干细胞后，分别加入20μg/L脑源性神经营养因子，20μg/L胰岛素样生长因子以及20μg/L脑源性神经营养因子＋20μg/L胰岛素样生长因子诱导其定向分化。微管相关蛋白2抗体来鉴定所获得的神经元，流式细胞仪检测计数神经元的分化比例。结果：①原代培养获得了Nestin染色阳性的神经干细胞。②干细胞经诱导分化后，各组均获得了微管相关蛋白2染色阳性神经元。③脑源性神经营养因子组，胰岛素样生长因子Ⅰ组和脑源性神经营养因子＋胰岛素样生长因子Ⅰ组及对照组（体积分数为0．01的胎牛血清）诱导分化后，流式细胞仪计数神经元的分化比例为47．8％，57．78％，61．94％和32．69％，三个实验姐与对照组差异显著（P〈0．05），而胰岛素样生长因子Ⅰ组与脑源性神经营养因子＋胰岛素样生长因子Ⅰ组间差异无显著性（P〉0．05）。绪论：神经干细胞具有多向分化潜能。脑源性神经营养因子与胰岛素样生长因子Ⅰ均能促进神经干细胞向神经元定向分化，但两者无明显的协同作用。     

川芎嗪对氧化型低密度脂蛋白诱导脐动脉平滑肌细胞增殖的作用

目的：观察川芎嗪对氧化型低密度脂蛋白诱导人脐动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用。 方法：实验于2004／2005在泰山医学院基础医学研究所完成。①分离健康人新鲜血浆制备氧化型低密度脂蛋白。②取新鲜健康人脐带，离体培养人脐动脉平滑肌细胞。③制备含药血清：取Wistar大鼠20只，雌雄各半。随机分为川芎嗪组15只，对照组5只。川芎嗪组大鼠分别给于10，30，100mg／kg灌胃，1次／d，连续3d；对照组以等量M199灌胃，饮水不受限制。第3天给药1．5h后，从腹主动脉取血6mL，分离血清备用。④采用生长稳定的三四代人脐动脉平滑肌细胞，用无血清培养基培养24h使其生长同步化后，应用氧化型低密度脂蛋白建立平滑肌细胞增殖模型。实验分为5组，空白对照组，氧化型低密度脂蛋白组，氧化型低密度脂蛋白＋10μmol／L川芎嗪组，氧化型低密度脂蛋白＋30μmol／L川芎嗪组；氧化型低密度脂蛋白＋100μmol／L川芎嗪组。其中，氧化型低密度脂蛋白的剂量为50μmol／L。经不同浓度川芎嗪处理72h后进行细胞计数，于川芎嗪处理12，24，72h采用氚胸腺嘧啶核苷掺入法检测药物效应。 结果：①氧化型低密度脂蛋白处理组与对照组相比，人脐动脉平滑肌细胞数同增加，氚-胸腺嘧啶核苷掺入率增加，DNA合成也增加。②与氧化型低密度脂蛋白处理组相比，氧化型低密度脂蛋白与不同浓度的川芎嗪同时处理组细胞数目减少，氚-胸腺嘧啶核苷掺入率也降低，DNA合成下降（r=0．9316，P〈0．05）。③随川芎嗪浓度增加对脐动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用递增。 结论：①氧化型低密度脂蛋白有促平滑肌细胞增殖作用，川芎嗪表现为剂量依赖性地抑制平滑肌细胞计数及氚-胸腺嘧啶核苷掺入量。②可初步认为川芎唪降血压作用可能与其抑制人脐动脉平滑肌细胞增殖有关。     

人脐静脉内皮细胞黏附分子1表达与活血中药对单核-血管内皮细胞黏附性能的干预

目的:观察活血注射液对氧化型低密度脂蛋白损伤人脐静脉内皮细胞后血管细胞黏附分子1的表达及与人单核细胞黏附的影响,探讨中药复方制剂防治动脉粥样硬化的作用机制。方法:实验于2004-03/12在北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部重点实验室完成。①实验材料:活血注射液由丹参、川芎、红花、赤芍组成,比例为丹参2,其余药物为1,含生药2000g/L。新生儿脐带(由中日友好医院妇产科提供,产妇及其家属知情同意,实验符合赫尔辛基宣言中的伦理学标准)。②实验过程:以培养人脐静脉内皮细胞作为靶细胞,在内皮细胞培养基中加入氧化型低密度脂蛋白制备细胞损伤模型。③实验评估:采用蛋白定量法检测人脐静脉内皮细胞与单核细胞的黏附率[将人脐静脉内皮细胞,用M199培养液(对照组)和含不同浓度(10,20,40ml/L)的活血注射液、氧化型低密度脂蛋白等实验因子的培养液(实验组)温育12,24h,再加含单核细胞的M199培养液];反转录聚合酶链反应检测人脐静脉内皮细胞的血管细胞黏附分子1的mRNA表达;用流式细胞仪测定人脐静脉内皮细胞的血管细胞黏附分子1的蛋白表达[(将人脐静脉内皮细胞,分为对照组、氧化型低密度脂蛋白组与氧化型低密度脂蛋白 活血注射液(终浓度分别为10,20,40ml/L)组,分别作用12,24h)。结果:①人单核细胞与人脐静脉内皮细胞的黏附率在氧化型低密度脂蛋白作用12,24h后升高,均明显高于对照组(P<0.01),不同剂量活血注射液可明显抑制人单核细胞与人脐静脉内皮细胞的黏附率,与氧化型低密度脂蛋白组相比差异均有显着性(P<0.01),这种作用随着剂量的增加而增强。②氧化型低密度脂蛋白能明显上调人脐静脉内皮细胞的血管细胞黏附分子1的mRNA和蛋白表达水平,而不同剂量活血注射液能显著下调血管细胞黏附分子1的mRNA和蛋白的表达水平(P<0.05,P<0.01),与氧化型低密度脂蛋白组相比差异均有显着性(P<0.05,P<0.01),这种作用随着剂量的增加而增强。结论:氧化型低密度脂蛋白促进内皮细胞的血管细胞黏附分子1表达,活血注射液能通过下调血管细胞黏附分子1的表达抑制单核-血管内皮细胞黏附,保护人内皮细胞免受氧化型低密度脂蛋白所致毒性损伤,从而减少或抑制动脉粥样硬化的形成。     

阿托伐他汀钙调节人脐静脉内皮细胞E-选择素和细胞间黏附分子1表达的浓度依赖性

目的：观察具有调脂作用的阿托伐他汀钙在不同浓度下对肿瘤坏死因子诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞表达E-选择素和细胞间黏附分子1的影响。 方法：①实验于2002-05／2003-12在大连医科大学附属第二医院实验室完成。将健康婴儿脐带进行无菌处理，用D-Hank’s液冲洗脐静脉，1g/L胶原酶消化、离心，置于37℃、体积分数0．05 CO2培养箱中培养，选择第2,3代细胞作为实验用。②用肿瘤坏死因子40μg／L、不同浓度（0．005～10μmol／L）的阿托伐他汀钙与体外培养的人脐静脉内皮细胞共同孵育24h后，提取细胞的总RNA，采用半定量反转录聚合酶链反应在mRNA水平进行分析。③用曲线图表示E-选择素和细胞间黏附分子1表达在不同浓度阿托伐他汀钙影响下的变化趋势。 结果：①在mRNA水平，阿托伐他汀钙对肿瘤坏死因子诱导的人脐静脉内皮细胞所表达的E-选择素与细胞黏附分子1均具有浓度依赖性。②阿托伐他汀钙对肿瘤坏死因子诱导人脐静脉内皮细胞表达E-选择素mRNA呈促进作用，即阿托伐他汀钙在0～10μmol／L的浓度区间内，随着其浓度由0，0．005,0．01μmol／L渐升至10μmol／L，E-选择素mRNA的表达呈逐渐升高的趋势。③阿托伐他汀钙对肿瘤坏死因子诱导人脐静脉内皮细胞表达细胞间黏附分子1的影响呈双向性，具有浓度差异性。即随着阿托伐他汀钙浓度由0,0．005,0．01μmol／L升至0．05μmol／L，细胞间黏附分子1 mRNA表达呈逐渐下降趋势，而在高浓度（0．05-10μmol／L）区间，随着阿托伐他汀钙浓度0．05，0．1μmol／L渐升至10μmol／L，细胞间黏附分子1 mRNA的量呈逐渐升高的趋势。 结论：在基因水平，阿托伐他汀钙对肿瘤坏死因子诱导血管内皮细胞黏附分子的表达有着确切的调节作用，且存在着浓度依赖性，并在不同的浓度区间，对不同的黏附分子作用不同。