细粒棘球蚴特异性抗原基因P-29的原核表达及免疫学鉴定

目的对细粒棘球蚴P-29基因进行克隆、表达和免疫反应性分析。方法以细粒棘球蚴总RNA为模板,反转录PCR扩增P-29基因,将其克隆至原核表达载体pET44a(+)中,构建重组原核表达载体pET-P-29,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察重组蛋白的表达情况,用蛋白纯化试剂盒纯化蛋白,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白与细粒棘球蚴病患者血清的免疫反应性。结果PCR、双酶切和DNA测序结果表明,重组质粒pET-P-29构建成功。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白Nus-P-29的相对分子质量(Mr)约为93000,纯化后的蛋白浓度为0.78mg/ml。重组蛋白Nus-P-29能被细粒棘球蚴病患者血清识别。结论细粒棘球蚴P-29基因表达成功,纯化后的重组蛋白Nus-P-29具有较强的免疫反应性。     

细粒棘球绦虫转酮醇酶克隆 表达及免疫性分析

目的 通过原核表达获得细粒棘球绦虫转酮醇酶（TK）表达产物,分析其作为棘球蚴病诊断抗原分子的价值。方法 PCR扩增TK基因,克隆至原核载体pMD19?EgTK,随后亚克隆至表达载体pET?28a,构建目的基因TK原核表达质粒pET?28a（+）?EgTK,转入大肠埃希菌BL21,分离纯化蛋白,经SDS?PAGE、Western blotting鉴定后,收集细粒棘球蚴病（CE组）、多房棘球蚴病（AE组）患者及健康人（健康组）血清,以酶联免疫吸附试验（ELISA）检测重组蛋白作为诊断抗原的价值。结果 成功构建pET?28a（+）?EgTK质粒,经SDS?PAGE和Western blotting分析,EgTK蛋白在70 kDa处出现条带,与理论值一致。ELISA显示,CE组、AE组和健康组血清反应吸光度A450值间差异有统计学意义（F = 44.47,P < 0.01）,CE组（1.46±0.41）、AE组A450值（1.28±0.29）高于健康组（0.66±0.23）（P ＜ 0.05）,但CE组和AE组间A450值差异无统计学意义（P＞ 0.05）。结论 重组TK分子可较好地区分棘球蚴病患者和非棘球蚴病患者,但无法区分细粒棘球蚴病和多房棘球蚴病患者。     

基于接头序列“GSGGSG”的细粒棘球蚴病重组多表位疫苗EgG1Y162⁃2（4）的制备及鉴定

目的　对细粒棘球蚴病重组多表位疫苗EgG1Y162⁃2（4）进行原核表达并初步鉴定。方法　利用免疫信息学方法对基于接头序列“GSGGSG”的细粒棘球蚴病重组多表位疫苗EgG1Y162⁃2（4）进行三维结构建模,分析其结构变化并评估该疫苗抗原性。通过EcoR I和Sal Ⅰ双酶切构建pET30a⁃EgG1Y162⁃2（4）重组质粒,将重组质粒转化入感受态细胞,利用异丙基⁃β⁃D⁃硫代半乳糖苷（isopropyl⁃β⁃D⁃thiogalactoside, IPTG）诱导蛋白表达, Western blotting鉴定原核表达蛋白产物,并应用细粒棘球蚴病患者及健康人血清分析重组蛋白抗原性。 结果　构建的重组疫苗EgG1Y162⁃2（4）三维结构串联的4个EgG1Y162⁃2蛋白均能独立、有效表达且具有良好抗原性。重组质粒pET30a⁃EgG1Y162⁃2（4）在0.2 mmol/L IPTG 37 ℃诱导4 h条件下,上清中目的蛋白表达量最高,使用60 mmol/L咪唑洗脱的蛋白成分较纯。Western blotting分析发现,重组多表位蛋白HIS⁃EgG1Y162⁃2（4）在约39 kDa位置处出现条带,且该蛋白可被细粒棘球蚴病患者血清识别。结论　成功构建了细粒棘球蚴重组疫苗EgG1Y162⁃2（4）,为研究细粒棘球蚴病重组多表位疫苗奠定了基础。     

快速诊断多房棘球蚴病胶体金免疫层析试条方法的建立与评价

目的建立快速、简便诊断多房棘球蚴病的胶体金免疫层析试条方法。方法提取多房棘球蚴原头节总RNA,通过RT-PCR获得编码Em18基因片段并克隆入pGEX-3X表达载体,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达得到重组蛋白;采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,标记抗人IgG单克隆抗体;将重组Em18抗原包被于硝酸纤维素膜适当位置,制成检测特异抗体的胶体金免疫层析试条。用该试条检测多房棘球蚴病(56份)、细粒棘球蚴病(87份)、囊尾蚴病(30份)、日本血吸虫病(10份)和弓形虫病(10份)患者血清,以及健康人(50份)血清,以评价其检测的敏感性和特异性,同时用ELISA法进行平行检测,以评价该试条的诊断性能。结果以重组蛋白Em18为抗原胶体金免疫层析试条检测多房棘球蚴病患者血清,敏感性为92.9%(52/56)。与细粒棘球蚴病和囊尾蚴病患者血清分别存在9.2%(8/87)和3.3%(1/30)的交叉反应,与健康人血清存在8.0%(4/50)的假阳性率,与日本血吸虫病和弓形虫病患者血清则无交叉反应,特异性为93.0%(174/187)。ELISA法检测的敏感性和特异性分别为94.6%(54/56)和92%(172/187),与试条法比较两者差异均无统计学意义(P>0.05)。kappa分析结果显示,试条法与ELISA法检测多房棘球蚴病患者血清的结果高度一致(κ=0.98)。结论以重组Em18抗原建立的快速诊断胶体金免疫层析试条,检测多房棘球蚴病的敏感性和特异性均较高。     

细粒棘球绦虫烯醇酶基因克隆 表达及免疫诊断研究

目的克隆表达细粒棘球绦虫烯醇酶(EgEno)基因,并对其免疫诊断价值进行初步评价。方法从细粒棘球绦虫cDNA中扩增目的基因,克隆入表达载体pET28a,转化E.coliBL21(DE3),经异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,进行SDS PAGE和免疫印迹法鉴定;采用细粒棘球蚴病及其他几种寄生虫病患者的血清和健康人血清,通过ELISA法评价重组EgEno抗原的免疫诊断效果。结果重组质粒pET28a EgEno构建成功。SDS PAGE和免疫印迹法结果显示,重组蛋白在E.coliBL21(DE3)中获得高效表达,重组蛋白EgEno相对分子量约为50 kDa,可被细粒棘球蚴病患者血清识别。EgEno对细粒棘球蚴病患者血清的免疫诊断敏感性为81.25%。结论克隆出细粒棘球绦虫EgEno基因并在E.coliBL21(DE3)中表达,重组EgEno对细粒棘球蚴病有较好的免疫诊断价值。     

我国细粒棘球绦虫新疆分离株AgB8/3亚基克隆表达及其检测囊型包虫病价值分析

目的评价重组细粒棘球蚴AgB8/3亚基检测囊型包虫病价值。方法从新疆源细粒棘球蚴原头节中提取总RNA,通过RT-PCR扩增目的基因片段并克隆入pGEX-3X表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞,IPTG诱导表达,用亲和层析法纯化重组蛋白,用ELISA方法评价其诊断价值并与本课题组制备的重组AgB8/1和AgB8/2进行比较。结果酶切鉴定及测序分析表明,成功构建细粒棘球蚴pGEX-3X-AgB8/3重组质粒,并在原核细胞用IPTG成功诱导目的蛋白表达。rAgB8/3检测囊型包虫病患者血清的敏感度为55.9%（66/118）;检测泡型包虫病患者血清阳性率为44.12%（15/34）;59份其它寄生虫病患者血清中除3份囊尾蚴病人血清阳性外,其他均为阴性;50份健康者血清全部为阴性,总特异度为87.4%（125/143）。rAgB8/3检测的敏感度与rAgB8/1相当（P〉0.05）而低于rAgB8/2（P〈0.05）;rAgB8/3检测的特异度与rAgB8/1和rAgB8/2均无统计学差异（P〉0.05）。结论成功构建新疆源细粒棘球蚴pGEX-3X-AgB8/3重组质粒并在原核细胞表达,rAgB8/3检测囊型包虫病结果与rAgB8/1无统计学差异。     

细粒棘球绦虫原头节抗原分子Eg-08002的克隆、表达及免疫反应性分析

目的筛选细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)原头节抗原分子,并进行克隆、表达及免疫反应性分析。方法在对细粒棘球绦虫六钩蚴和原头节阶段表达的转录组测序数据进行差异分析的基础上,筛选出原头节阶段特异性表达的抗原分子。PCR扩增后克隆至p ET28a载体,构建原核表达载体pET28a-Eg-08002,转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)JM109,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,抗His标签镍亲和层析柱纯化重组蛋白rEg-08002,快速免染聚丙烯酰胺电泳分析表达产物;蛋白质印迹(Western blotting)分析rEg-08002的免疫反应性。ELISA分析重组蛋白rEg-08002与细粒棘球蚴病患者血清和健康人血清的免疫反应性。结果筛选出了原头节中高表达的抗原分子Eg-08002,大小为612 bp,构建原核表达载体pET28a-Eg-08002。快速免染聚丙烯酰胺电泳和Western blotting分析结果显示重组蛋白rEg-08002在E.coli JM109中获得高效表达,在相对分子质量(Mr)约为23 000处可见重组蛋白rEg-08002条带,主要以包涵体形式存在,r Eg-08002可被感染棘球蚴的小鼠血清识别。ELISA分析结果表明,12份细粒棘球蚴病患者血清和12份健康人血清的平均吸光度(A450)值分别为1.245±0.265和0.469±0.006,差异具有统计学意义(P0.05)。结论筛选出了原头节中高表达的抗原分子Eg-08002,获得的重组蛋白rEg-08002具有较好的免疫反应性。     

5种抗原检测囊型包虫病血清学评价

目的 评价细粒棘球蚴纯化囊液粗抗原、天然抗原B（nAgB）及其3个重组亚基检测囊型包虫病的效能。 方法 从新疆源细粒棘球蚴原头节中提取总RNA,通过RT-PCR获得编码AgB8/1、AgB8/2和AgB8/3基因片段并克隆入pGEX-3X表达载体,IPTG诱导表达分别得到重组蛋白rAgB8/1、rAgB8/2 、rAgB8/3;羊细粒棘球蚴囊液经透析沉淀获得纯化囊液粗抗原（HCF）、此纯化囊液粗抗原经煮沸离心弃沉淀得到天然抗原B。用制备的5种抗原分别作为包被抗原,应用ELISA法检测囊型包虫病人及其它寄生虫病人和健康人血样中抗体。结果 HCF、nAgB、rAgB8/1、rAgB8/2和rAgB8/3应用于ELISA法检测囊型包虫病人血清的敏感性依次为90.8%（79/87）, 87.4%（76/87）, 67.8%（59/87）, 78.2%（68/87） 和 59.8%（52/87）;特异度依次为96.0%, 96.0%, 96.0%, 98.0% 和 97.0%。纯化HCF、nAgB、rAgB8/1、rAgB8/2和rAgB8/3的诊断效能分别为93.5%, 91.9%, 82.8%, 88.7% 和 79.6%。纯化HCF和nAgB检测的敏感度高于 rAgB8/1、rAgB8/2和rAgB8/3（P<0.05）;rAgB8/2检测的敏感度高于rAgB8/1、和rAgB8/3（P<0.05）;5种抗原检测的特异度之间均无统计学差异（P>0.05）。结论 天然抗原应用ELISA法检测囊型包虫病的效能总体优于重组抗原。     

细粒棘球蚴抗原EPC1基因的克隆、表达及其免疫诊断的研究

目的克隆、表达细粒棘球蚴EPC1(EgEPC1)基因,鉴定重组抗原的反应原性,并用棘球蚴病患者血清评价其诊断价值。方法从绵羊肝脏棘球蚴囊中分离原头节,提取其总RNA,采用RT-PCR扩增EgEPC1基因,将其克隆至pGEM-T载体,再将其与原核表达载体PET28a(+)连接构建重组质粒PET28a-EgEPC1,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)对纯化的重组抗原进行鉴定分析。以该重组蛋白作为包被抗原建立ELISA方法,检测细粒棘球蚴病患者血清(60份)特异性IgG抗体,同时以多房棘球蚴病(37份)、囊尾蚴病(16份)、华支睾吸虫病(7份)、日本血吸虫病(4份)患者和健康人血清(33份)作为对照,评价重组抗原EgEPC1的免疫诊断效果。结果双酶切鉴定和测序结果均显示重组质粒PET28a-EgEPC1构建成功。SDS-PAGE和Western blotting分析显示,重组质粒PET28a-EgEPC1在E.coli BL21(DE3)...     

细粒棘球绦虫H3蛋白的克隆表达及囊型包虫病检测效果评价

目的克隆、表达细粒棘球绦虫基底膜特异性硫酸乙酰肝素聚糖核心蛋白（H3）,并评价其检测囊型包虫病的 效果。方法将从细粒棘球绦虫原头节cDNA文库中免疫筛选的H3基因,克隆入pGEX?4T表达载体,将重组质粒转化 大肠杆菌BL21细胞,用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,用亲和层析法纯化重组蛋白,用ELISA方法检测囊型 包虫病患者血清、其他寄生虫病患者血清及健康人血清,评价其检测效能,并与本课题组制备的细粒棘球蚴包囊液粗抗 原（Hydatid cyst fluid,HCF）和重组AgB8/2进行比较。结果成功构建细粒棘球蚴pGEX?4T?H3重组质粒,并在原核细胞 中成功表达。重组H3抗原、纯化HCF和rAgB8/2检测囊型包虫病患者血清的敏感度分别为84.0%（68/81）、90.1%（73/ 81）、77.8%（63/81）,3者差异无统计学意义（ χ2 = 4.58,P > 0.05）。重组H3抗原与泡型包虫病患者、囊虫病患者及血吸虫 病患者血清分别存在63.3%（19/30）、16.7%（5/30）和5.0%（1/20）的交叉反应,与50份健康者血清无交叉反应;H3检测总 特异度为80.8%（105/130）,H3、纯化HCF［71.5%（93/130）］和rAgB8/2［82.3%（107/130）］特异度间差异无统计学意义 （χ2 = 5.71,P > 0.05）。结论重组H3抗原在囊型包虫病诊断上具有潜在的应用价值。     

细粒棘球蚴重组抗原B的表达提取及其血清学检测初探

用基因工程技术制备出的细粒棘球绦虫重组抗原B（rAgB）表达载体,经诱导表达、亲和层析纯化获得具生物活性的重组蛋白质rAgB,用Western-Blot法检测病人血清。结果显示rAgB敏感性为91．6％（44／48）,特异性为93．8％（30／32）,其中10例泡球蚴（AE）病人及10例肿瘤病人血清均无交叉反应。说明rAgB具有较高的敏感性及特异性,可用于包虫病的常规血清学诊断,rAgB在宿主菌JM109内稳定表达,因此可在实验室内大量制备用于血清学诊断的rAgB。     

细粒棘球绦虫FABP与Eg95融合基因的表达与抗原性鉴定

目的构建细粒棘球绦虫脂肪酸结合蛋白(FABP)和Eg95两个保护性抗原基因的融合基因,并研究其重组蛋白的免疫学特性。方法以细粒棘球绦虫青海绵羊株保护基因FABP和Eg95的cDNA为模板,通过编码4个甘氨酸残基的连接序列,用非对称聚合酶链反应扩增融合基因FABP·Eg95,克隆至表达载体pET28a(+)中,在大肠埃希菌BL21(DB3)中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定。通过Ni-IDA亲和层析获得高纯度目的蛋白,利用蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的免疫反应性。结果获得的融合基因FABP·Eg95长约795bp,双酶切和测序鉴定结果均显示pET-28a(+)-FABP-Eg95重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明,重组质粒pET-28a(+)-FABP-Eg95在大肠埃希菌BL21(DB3)中获得高效表达,表达相对分子质量(Mr)约为31000的重组蛋白,主要以包涵体形式存在,经亲和层析获得目的蛋白。Western blotting分析结果显示,重组蛋白与细粒棘球蚴病患者血清有良好的免疫反应性,而不与健康人血清和血吸虫病患者血清反应。结论 FABP·Eg95融合基因构建成功,纯化的重组蛋白具有一定的抗原性。     

细粒棘球蚴Eg10基因的克隆、表达及免疫特性研究

目的克隆、表达细粒棘球蚴分离株Eg10基因,并研究其重组蛋白的免疫特性。方法将细粒棘球蚴Eg10基因亚克隆于表达载体pET28a,转化重组质粒至大肠埃希菌BL21进行融合表达,His-bind树脂纯化系统纯化重组融合蛋白,以之作为抗原免疫小鼠。48只ICR小鼠随机均分为4组,A、B组为对照组,分别注射不含抗原的磷酸盐缓冲液(PBS)和福氏佐剂+PBS,每鼠皮下注射100μl。C、D组为免疫组,注射用福氏佐剂乳化的重组抗原Eg10,抗原量分别为0.1mg/μl和0.5mg/μl,每鼠皮下注射100μl。各组小鼠每隔2周免疫1次,共免疫3次。于免疫前和免疫后2、4、6、8和10周采血以获得抗血清。通过蛋白质印迹(Westernblotting)分析和ELISA检测重组抗原的免疫学特性。结果成功构建含目的片段Eg10的基因工程菌株。Westernblotting分析结果表明,免疫血清能识别重组抗原Eg10。ELISA检测结果显示,用重组蛋白免疫小鼠可诱导产生特异性抗体。统计学分析表明,免疫后C、D组抗体水平逐渐升高,至第8周抗体滴度达最高值,分别为(1.143±0.253)和(1.254±0.070);A、B组抗体一直维持在较低水平。第2、4、6、8和10周,A、B与C、D组间抗体水平差异有统计学意义(均P0.05),C、D组间差异无统计学意义(P0.05)。结论成功表达细粒棘球蚴重组蛋白Eg10,该蛋白有一定的免疫原性。     

棘球蚴特异性抗原的蛋白质印迹分析

目的　寻找细粒棘球蚴 (Eg)和多房棘球蚴 (Em)特异性抗原组分用于免疫诊断。　方法　对Eg、Em的囊液、原头节、囊壁角质层、囊壁生发层及犬泡状带绦虫、犬豆状带绦虫、羊细颈囊尾蚴、猪囊尾蚴等 4种异源性绦虫 ,共14种粗抗原进行免疫学分析。采用蛋白质印迹试验 (Western blotting)、Genesnap和Genetool分析软件比较分析不同抗原蛋白条带分别与囊型棘球蚴病 (CE)及泡型棘球蚴病 (AE)患者血清反应的差异。　结果　 14种粗抗原中与CE、AE患者血清发生交叉反应的 11条蛋白条带相对分子质量 (Mr)为 130000、100000、94000、80000、75000、66000、62000、52000、38000、32000及 24000 ;与CE患者血清有特异性反应的 5条蛋白条带Mr为 41000、40000、22000、160 00和12000 ;与AE患者血清具有特异性反应的 8条蛋白条带Mr为 120000、109000、86000、59000、43000、28000、20000及 18000。　结论　确定了Eg和Em共有的交叉反应性抗原和具有进一步研究价值的特异性抗原组分 ,为进一步分离和鉴定具有诊断价值的特异性抗原提供了基础资料     

细粒棘球蚴亲肌肉抗原在小鼠中的免疫保护力研究

目的 对细粒棘球蚴亲肌肉抗原(myophilin antigen)进行原核表达、纯化并用小鼠实验评价其免疫学特性. 方法 提取总RNA,构建克隆质粒Eg myophilin/pGEM-T,然后将亲肌肉抗原基因亚克隆于表达载体pET28a,进行诱导表达;纯化重组蛋白并免疫小鼠.利用Western blot、ELISA鉴定其免疫学特性,并通过包囊计数,评价其免疫保护力. 结果 成功构建原核重组表达载体Eg myophilin/pET28a,并表达、纯化出浓度较高的亲肌肉抗原.ELISA检测显示,用纯化的亲肌肉抗原免疫小鼠,诱导产生了特异性抗体;Western blot鉴定该抗体能识别重组抗原及原头蚴.攻击感染实验表明亲肌肉抗原免疫小鼠的包囊数为0.93±2.1,对照组为7.13±10.21,两者差异有统计学意义,获得的保护力约为94.4%. 结论 成功表达细粒棘球蚴亲肌肉抗原,纯化后的重组蛋白具有抗原性和免疫原性,有望作为棘球蚴病疫苗候选分子.     

细粒棘球绦虫AgB8／1-AgB8／2重组嵌合抗原表达系统的构建

目的构建pET32a—AgBS／1-AgBS／2原核表达载体,并对其重组蛋自进行原核细胞表达。方法从细粒棘球绦虫原头蚴中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板,用基因特异性引物分别扩增EgAgBS／1和EgAgBS／2基因编码其分泌型多肽的片段,经测序后,以此两条基因片段为依据,人2r-合成EgAgBS／1-EgAgBS／2嵌合抗原编码核酸序列,将其克隆至pUCm—T载体,测序鉴定其正确性。通过对pUCm—T／AgBS／1-AgBS／2重组质粒进行双酶切,将获得的AgB8／1-AgBS／Z嵌合抗原编码核酸序列用定向克隆技术克隆至原核表达质粒pET32a上,测序鉴定插入片段E-确后,转化至E.coli BL21（DE3）Lys S,IPTG初步诱导表达pET32a-AgBS／1-AgBS／2重组嵌合蛋白。用SDS—PAGE电泳分析鉴定重组蛋白的表达水平。结果测序表明,AgBS／1-AgBS／2嵌合抗原编码核酸序列正方向插入至pET32a质粒。SDS-PAGE电泳分析显示,IPTG诱导后重组嵌合蛋白得到成功表达,在相对分子量约38kD处有表达条带。结论成功构建了pET32a—AgBS／1-AgBS／2原核表达质粒,并初步诱导表达出AgBS／1-AgBS／2嵌合重组蛋白,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。