龙骨马尾杉环阿屯醇合成酶(HcCAS1)基因的 克隆和生物信息学分析

目的:对大伸筋草的原植物龙骨马尾杉Huperzia carinata环阿屯醇合成酶(cycloartenol synthase,CAS)基因HcCAS编码区进行克隆及序列分析。方法:根据本实验室已报道的龙骨马尾杉转录组高通量测序结果分析获得1条具有环氧角鲨烯环化酶保守结构域的CAS基因序列,采用RT-PCR技术,以龙骨马尾杉根、茎、叶混合样品总RNA为模板克隆得到龙骨马尾杉HcCAS基因的编码区序列,并对HcCAS蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析。结果:序列分析表明,所克隆的HcCAS基因编码区开放阅读框(open reading frame,ORF)长为2 274 bp,编码757个氨基酸残基,命名为HcCAS1(GenBank登陆号JN790125)。结论:该研究在国内外首次获得龙骨马尾杉HcCAS基因的编码区序列,为进一步研究HcCAS蛋白在石杉科植物甾醇合成途径中的功能及酶活性位点的鉴定奠定基础。     

龙骨马尾杉PcFPS1基因克隆及序列分析

目的 对龙骨马尾杉Phlegmariurus carinatus法呢二磷酸合成酶（Farnesyl diphosphate synthase,FPS）基因PcFPS1编码区进行克隆及序列分析。方法 根据已获得的龙骨马尾杉转录组数据,从中获得1条编码FPS的转录本,采用RT-PCR方法获得PcFPS1的编码区序列,并对PcFPS1蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析。结果 序列分析表明,所克隆的PcFPS1基因编码区长为1 119 bp,编码372个氨基酸残基,PcFPS1与挪威云杉Picea abies的FPS具有70%的序列相似性。生物信息学预测PcFPS1蛋白基本不含跨膜区,具有萜类合酶保守结构域,不含信号肽。结论 首次获得龙骨马尾杉PcFPS1基因的编码区序列,为进一步研究PcFPS1在石杉科植物萜类及甾醇类化合物生物合成途径中的功能及鉴定酶活性位点奠定基础。     

蛇足石杉HsCAS1基因克隆及序列分析

本研究对蛇足石杉(Huperzia serrata)环阿屯醇合成酶(Cycloartenol synthase,CAS)基因HsCAS1编码区进行克隆及序列分析。根据本实验室已获得的蛇足石杉转录组数据,从中获得1条具有环氧角鲨烯环化酶保守结构域的编码CAS的转录本,采用RT-PCR方法获得该基因的编码区序列,并对HsCAS1蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析。利用实时荧光定量PCR方法检测HsCAS1基因在蛇足石杉的根、茎、叶中的表达情况。序列分析表明,所克隆的HsCAS1基因编码区长为2,271 bp,编码756个氨基酸残基,HsCAS1与紫果冷杉(Abies magnifica)的CAS具有61%的序列相似性。生物信息学预测HsCAS1蛋白含有3个跨膜区,具有萜类环化酶等保守结构域,不含信号肽。HsCAS1在蛇足石杉的根中表达丰度高于茎和叶。本研究在国内外首次获得蛇足石杉HsCAS1基因的编码区序列,为进一步研究HsCAS1在石杉科植物甾醇合成途径中的功能及鉴定酶活性位点奠定基础。     

蛇足石杉1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸 还原异构酶（HsDXR1）基因克隆与表达分析

基于本实验室已获得的蛇足石杉转录组数据,获得一个编码1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR）的转录本,分析其开放阅读框序列,发现该转录本编码全长为1 440 bp 的蛇足石杉DXR 基因（HsDXR1）,含有479 个氨基酸残基。采用RT-PCR 方法获得了HsDXR1 全长,并对HsDXR1 编码蛋白的理化性质、结构域及三维结构进行预测分析。结果显示HsDXR1 编码蛋白的预测分子量为51.496 1 kDa,等电点为6.44;不含信号肽和跨膜区;亚细胞定位预测表明该蛋白最可能定位于叶绿体;具有DXR 蛋白典型的结构域。实时荧光定量PCR 检测HsDXR1 基因在蛇足石杉的茎中表达量最高,其次为根,在叶中表达量最低。本研究获得了蛇足石杉HsDXR1 基因的编码区序列,为进一步研究HsDXR1 在蛇足石杉萜类化合物生物合成途径中的功能奠定基础。     

长柄石杉L-赖氨酸脱羧酶基因克隆及序列分析

目的在对长柄石杉Huperzia serrata、闽浙马尾杉Phlegariurus minchegensis、华南马尾杉Phlegariurus austrosinicus和有柄马尾杉Phlegariurus petiolatus 4种石杉科植物的L-赖氨酸脱羧酶(L-lysine decarboxylase,LDC)基因编码区进行克隆的基础上,对长柄石杉的LDC基因全长序列进行分析并预测其蛋白结构。方法采用RT-PCR技术,以石杉科植物叶片提取的总RNA为模板克隆得到LDC基因编码区序列,通过BLAST比对和MEGA5.0软件对克隆的序列进行分析。采用RACE技术获得石杉科广布种长柄石杉的LDC基因全长序列,并对其蛋白的二级结构及三维结构进行预测分析。结果克隆的4种石杉科植物LDC基因序列与数据库中被注释为编码LDC的基因序列保持高度的相似性,长柄石杉LDC蛋白与NCBI中的蛇足石杉LDC氨基酸序列相似度很高,与蕨类植物江南卷柏的同源性也较高。长柄石杉LDC基因编码区全长为1 266 bp,编码403个氨基酸,Gen Bank登录号KF040056。结论克隆得到4种石杉科植物的LDC基因,分析了长柄石杉LDC基因的全长序列并预测其蛋白结构,为进一步阐明石杉科植物石杉碱甲生物合成途径奠定基础。     

山茱萸CoDXR基因的克隆与分析

目的克隆山茱萸关键酶基因1-脱氧-D-核酮糖5-磷酸还原酶(CoDXR)的全长cDNA序列,为山茱萸的进一步研究提供依据。方法以本实验室获得的山茱萸转录组数据中的转录本序列c147202_g1为模板,通过Primer Premier 5.0设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆CoDXR基因的全长cDNA序列,并通过相关的生物信息学软件对其进行相关的生物信息学分析和功能预测。结果 CoDXR基因长度为1 505 bp,ORF长度是729 bp,编码242个氨基酸。而通过SignalP4.0Server和HMMTOP对CoDXR蛋白预测分析结果可知,该蛋白不具有信号肽和跨膜区,为疏水性蛋白。系统进化树分析结果表明CoDXR蛋白与野茶树(Camelliasinensis)的DXR蛋白序列相似性最高。结论在山茱萸果实和叶片转录组测序的基础上成功克隆了山茱萸萜类合成途径中的关键酶基因CoDXR,对其进行相关的生物信息学分析,为深入研究CoDXR基因在山茱萸萜类合成途径中的功能奠定了基础。     

红花2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶基因的克隆及表达分析

目的克隆红花维生素E合成相关关键酶2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶(MPBQ MT)基因,并进行生物信息学及表达分析,为红花维生素E生物合成及调控机制研究奠定基础。方法根据红花种子转录组数据库中得到的中间序列,采用RT-PCR和RACE方法从红花种子中克隆MPBQ MT基因序列,通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,构建MPBQ MT与相关物种MPBQ MT的系统进化树,利用RT-PCR方法分析在红花种子不同发育时期MPBQ MT基因的表达量。结果MPBQ MT基因全长1 392 bp,命名为Ct MPBQ MT,具有完整的开放阅读框(ORF),共1 038 bp,编码345个氨基酸。生物信息学分析显示,该基因编码的蛋白理论相对分子质量约为38 900。保守结构域预测表明,该基因编码的蛋白具有典型的SAM蛋白功能结构域。结合其他物种的MPBQ MT基因构建系统树表明,红花MPBQ MT基因与其他物种氨基酸具有一定的同源性,其中与向日葵和生菜同源性高达89%和86%。实时荧光定量PCR分析表明,MPBQ MT基因在红花开花后50 d的种子中表达量最高。结论成功地对MPBQ MT基因进行克隆及表达分析,为红花维生素E合成及调控机制研究奠定基础。     

山茱萸萜类合成途径关键酶HMGR1基因的克隆与分析

目的克隆山茱萸Cornus officinalis HMGR1的cDNA序列并进行生物信息学分析。方法以山茱萸转录组数据中unigenec100572_g1序列为参考,在其开放阅读框两端设计特异引物,经实时荧光定量PCR(RT-PCR)扩增、连接pTOPO-T载体克隆并测序,获得CoHMGR1基因的cDNA序列,并利用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行相关分析。结果 CoHMGR1基因长2 116 bp,含长度为1 338 bp的完整开放阅读框(ORF),编码445个氨基酸,为疏水性蛋白。多序列比对和亲缘关系分析显示,CoHMGR1基因编码的氨基酸序列与喜树的序列相似性较高,达79.56%。结论首次对山茱萸叶片和果实进行比较转录组测序的基础上,成功克隆并分析了CoHMGR1基因,为进一步研究CoHMGR1蛋白的功能及山茱萸萜类合成途径的分子机制奠定基础。     

铁皮石斛1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶基因的克隆与表达分析

目的从铁皮石斛Dendrobium officinale中克隆1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶[1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphatereductase,HDR]基因,并分析其在铁皮石斛不同组织中的表达差异以及不同信号分子诱导下的表达模式。方法采用RT-PCR和RACE等方法获得铁皮石斛HDR基因(Do HDR)全长,利用DNAMAN和MEGA6.0对其他物种的HDR基因编码的氨基酸序列进行同源性分析和进化关系分析,使用实时荧光定量分析HDR基因的表达模式。结果成功获得Do HDR基因,Gen Bank登录号为KC344827,全长1 658 bp,编码460个氨基酸,与其他科属植物的同源性达到80%以上。Do HDR基因在铁皮石斛叶片中表达量最高,从高到低依次是根、茎、原球茎;且受到脱落酸(abscisic acid,ABA)、水杨酸(salicylic acid,SA)信号分子的诱导。结论从铁皮石斛中获得Do HDR基因,为进一步阐明铁皮石斛萜类化合物合成途径中该基因的重要作用奠定了理论基础。     

山茱萸萜类甲羟戊酸合成途径关键酶CoHMGS基因的克隆与分析

目的克隆得到山茱萸Cornusofficinalis萜类合成途径的关键酶CoHMGS基因的cDNA序列,并进行相应的生物信息学分析,为深入研究CoHMGS基因的功能奠定基础。方法以山茱萸转录组筛选出的c102453_g2序列为参考序列设计特异引物,以山茱萸叶片总RNA,通过RT-PCR扩增获得CoHMGS基因序列,序列纯化回收后连接到pTOPO-T载体上,转化至大肠杆菌DH10B,选取阳性克隆测序。利用生物信息学软件预测CoHMGS基因及其编码蛋白质的功能。结果克隆得到长度为1645 bp的CoHMGS序列,包含1413 bp的完整开放阅读框,编码470个氨基酸。蛋白整体带负电荷,为不稳定亲水性蛋白,定位于细胞质内,不含跨膜结构。结论首次克隆得到山茱萸CoHMGS基因,对其编码蛋白质进行了初步的分析和预测,为深入揭示CoHMGS基因在山茱萸萜类物质合成途径中的功能奠定了基础。     

铁皮石斛内生真菌Verticillium sp. KY-18的化学成分研究

目的研究铁皮石斛Dendrobium officinale内生真菌Verticillium sp.KY-18中氧杂环类化合物。方法采用色谱分离技术进行分离和纯化,并根据谱学数据鉴定化合物的结构。结果从Verticillium sp.KY-18的发酵产物中分离得到13个氧杂环类化合物,分别鉴定为2,6-dihydroxy-2-methyl-7-(prop-1E-enyl)-1-benzofuran-3(2H)-one(1)、nigrosporapyrone D(2)、oosponol(3)、2-甲基-4-吡喃酮(4)、6-甲基-5-[(1E)-丁烯基]-2-吡喃酮(5)、penicisochroman D(6)、verrucosapyrone B(7)、(1S,3S)-1,8-dimethoxy-3,5-dimethyl-6-hydroxyisochroman(8)、phomopsinone A(9)、pseudohalonectrin A(10)、dictafolin-A(11)、2,3-dihydro-5,7-dihydroxy-2,6,8-trimethyl-4H-1-benzopyran-4-one(12)、2-pyrone-4,6-dicarboxylic acid(13)。结论化合物2~10为首次从该属真菌中分离得到;化合物11~13为首次从该真菌中分离得到。     

龙须草中1个新的二氢菲类化合物

目的研究龙须草Juncus setchuensis茎髓中的菲类化学成分。方法采用多种柱色谱方法分离纯化,通过理化性质及波谱分析技术鉴定化合物的结构。结果从龙须草茎髓的乙醇提取物中分离得到5个菲类化合物,分别鉴定为8-羟甲基-2-羟基-1-甲基-5-乙烯基-9,10-二氢菲(1)、4-ethenyl-9,10-dihydro-1,8-dimethyl-2,7-phenanthrenediol(2)、厄弗酚(3)、去氢厄弗酚(4)、4-ethenyl-9,10-dihydro-7-hydroxy-8-methyl-1-phenanthrenecarboxylic acid(5)。结论化合物1为未见文献报道的具有二氢菲类结构母核的新化合物,命名为龙须草醇A。     

新鲜烟叶中的1个新二萜类成分

目的研究烟草Nicotiana tabacum叶中的西松烷二萜类化学成分。方法采用柱色谱技术对烟草的95%乙醇提取物进行分离纯化,采用波谱技术结合化学方法进行结构鉴定。结果从烟草提取物中分离得到了5个西松烷二萜类成分,分别鉴定为(1R,3E,7E,10S,11E)-3,7,11-cem-bratriene-10,15-diols(1)、(1S,2E,4S,6R,7E,10E,12S)-2,7,10-cembratriene-4,6,11-triol(2)、(1S,2E,4R,6R,7E,10E,12S)-2,7,10-cembratriene-4,6,11-triol(3)、(1S,2E,4S,6R,7E)-4,6,11-trihydroxy-1-isopropyl-4,8-dimethylpentadeca-2,7-dien-12-one(4)、(1S,2E,4R,6R,7E,11S,12S)-11,12-epoxy-2,7-cembradiene-4,6-diol(5)。结论化合物1为1个新化合物,命名为烟叶二萜B;化合物4首次在植物中发现,为1个新的天然产物。     

肉桂的化学成分研究

采用硅胶柱色谱、ODS反相柱色谱、Sephadex LH-20及制备HPLC等多种色谱分离技术对肉桂乙醇提取物中的化学成分进行分离纯化,运用NMR、MS等波谱方法并结合已有文献对分离得到的化合物进行结构鉴定。结果从肉桂的乙醇提取物中分离得到12个化合物,分别鉴定为(2R, 3R)-5,7,3',4'-四甲氧基黄烷醇(1),(2R, 3R)-5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷醇(2),香豆素(3),肉桂酸(4),(E)-2-羟基苯丙酸桂酯(5),3, 3', 4, 4'-四羟基联苯(6),methylstictic acid(7),epi-boscialin(8),(1R,2S,3S,4S)2,3-环氧-1,4-二羟基-5-甲基-5-环己烯(9),4,5-二羟基-3-甲基-2-环己烯酮(10),顺式-4-羟基-蜂蜜曲菌素(11),2-羟基-4-甲氧基肉桂醛(12),其中化合物 5~11 为首次从该属植物中分离得到。     

亳芍内生真菌Alternaria alternate次生代谢产物的研究

目的研究亳芍内生真菌Alternariaalternate的次生代谢产物。方法利用硅胶、SephadexLH-20、反相、中压、高效液相制备等多种色谱法分离化合物,采用波谱方法对化合物进行结构鉴定。结果从内生真菌Alternaria alternate次生代谢产物中分离得到15个化合物,分别鉴定为methyl 4-acetamido-3-hydroxybenzoate(1)、(E)-methyl-5-hydroxy-3-methylpent-2-eno(2)、异苯并呋喃酮A(3)、对羟基苯乙酮(4)、6-hydroxy-isosclerone(5)、talaroflavone(6)、7-hydroxy-2-hydroxymethyl-5-methyl-4H-chromen-4-one (7)、 alternarienonicacid (8)、 7-hydroxy-2,5-dimethy-4H-1-benzopyran-4-one (9)、 5-hydroxy-epialtenuene(10)、交链孢醇(11)、methyl 3-hydroxybenzoate(12)、stemphyperylenol(13)、细格菌素(14)、交链孢烯(15)。结论其中化合物1、3、5～10、12～13为首次从内生真菌Alternaria alternate次生代谢产物中分离得到。     

红花转录因子CtMYB1基因的克隆及原核表达

目的 从红花Carthamus tinctorius 花瓣中克隆转录因子基因CtMYB1,并进行序列分析和原核表达载体的构建。方法 根据红花转录组测序结果中得到的高表达的Unigene123933序列,利用RT-PCR和RACE技术从红花花瓣中扩增得到CtMYB1基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;以CtMYB1基因的全长cDNA序列为模板,PCR扩增得到CtMYB1基因的开放阅读框(ORF)序列,构建原核表达载体pEASY-E1-CtMYB1。转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。结果 成功从红花中克隆1个MYB基因,命名为CtMYB1,GenBank登录号为KJ524853。CtMYB1基因全长893 bp,ORF为750 bp,编码249个氨基酸。同时,成功构建了该基因的原核表达载体。SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约30 000,与预测的蛋白相对分子质量一致。结论 成功克隆了CtMYB1基因,构建了原核表达载体,初步证明该基因在大肠杆菌中成功表达。     

三七香叶基香叶基焦磷酸合酶基因的克隆及表达分析

基于三七转录组测序结果,选择萜类代谢骨架上香叶基香叶基焦磷酸合酶基因(GGPPS),结合RACE技术,克隆得到全长1 203 bp的cDNA序列,最长开放阅读框为1 035 bp,命名为PnGGPPS,GeneBank登录号为KM486564,PnGGPPS基因全长2 370 bp,包含1个内含子和2个外显子,该基因编码344个氨基酸,与蓖麻Ricinus communis、丹参Salvia miltiorrhiza等植物GGPPS的同源性达到73%以上,具有富天冬氨酸区等多个结构域,属于类异戊二烯合成酶超家族。实时荧光定量PCR结果显示,PnGGPPS在一至三年生三七的根、茎、叶和三年生的花等不同器官组织中均有表达,但以三年生叶中具有显著水平的高表达量,暗示其既具有调节三七生长发育的基本功能,也与三七叶绿素和类胡萝卜素的合成、叶绿体的发育、阴生适应性,以及品质的形成有关。     

海南黄皮枝叶的化学成分研究

目的研究黄皮属植物海南黄皮Clausena hainanensis枝叶中的化学成分。方法综合运用硅胶柱色谱、反相硅胶柱色谱和Sephadex LH-20凝胶柱色谱以及制备型高效液相色谱等方法进行系统分离,根据化合物的理化性质及其波谱学数据鉴定化合物的结构。结果从海南黄皮枝叶的90%乙醇提取物中分离得到了18个化合物,分别鉴定为mukonine(1)、methyl carbazole-3-carboxylate(2)、lansine(3)、murrayanine(4)、3-甲酰基咔唑(5)、3-甲酰基-6-甲氧基咔唑(6)、lansamide4(7)、4-methoxy-N-methyl-2-quinolone(8)、(E)-N-(4-methoxyphenethyl)-2-methylbut-2-enamide(9)、(E)-N-甲基肉桂酰胺(10)、N-(2-羟基-2-苯乙基)肉桂酰胺(11)、N-苯甲酰酪胺(12)、aurantiamide(13)、N-methyl-2-pyrolidinone(14)、香豆酸(15)、6,8-dimethoxy-4,5-dimethyl-3-methyleneisochromanl-one(16)、8-甲氧基补骨脂素(17)和异黑麦草内酯(18)。其中化合物1~14为生物碱类化合物,15为酚酸类化合物,16为异香豆素类化合物,17为香豆素类化合物,18为倍半萜类化合物。结论首次对海南黄皮中的化学成分进行了系统研究,所有化合物均为首次从海南黄皮中分离得到,化合物12~16为首次从黄皮属植物中分离得到。     

人参茎叶中1个新皂苷20(S)-人参皂苷Rf_2

目的研究人参Panax ginseng茎叶总皂苷中的化学成分。方法采用硅胶柱色谱及半制备高效液相色谱等方法进行分离、纯化,通过NMR、MS等谱学方法进行化学结构鉴定。结果从人参茎叶的总皂苷中共分离鉴定了39个化合物,报道其中的1个新化合物和16个已知的化合物,分别为人参皂苷Re(1)、20(S)-人参皂苷Rh_1(2)、20(R)-人参皂苷Rh_1(3)、人参皂苷Rh_5(4)、20(E)-人参皂苷F_4(5)、人参皂苷F_2(6)、20(S)-人参皂苷Rg3(7)、20(R)-人参皂苷Rg_3(8)、20(S)-人参皂苷Rf_2(9)、20(R)-人参皂苷Rf_2(10)、20(S)-原人参二醇(11)、20(R)-原人参二醇(12)、20(S)-人参皂苷Rh2(13)、20(R)-人参皂苷Rh2(14)、20(S)-原人参三醇(15)、20(R)-原人参三醇(16)和人参皂苷Rd(17)。结论化合物9为1个新的化合物;2~10、13和14是稀有人参皂苷。