小干扰RNA抑制多药耐药基因表达并逆转耐药

目的探讨小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）影响卵巢癌耐药细胞株MDRl基因的表达并逆转其多药耐药的功能。方法2004年10月至2005年6月于山东省立医院中心实验室采用浓度梯度诱导法建立人卵巢癌阿霉素耐药细胞株OVCAR／AR。根据MDRl基因的编码区域设计了2个含19个碱基的MDR1基因特异性siRNA，脂质体介导下转染OVCAR／AR细胞。RT—PCR分析MDR1 mRNA的表达；流式细胞术（FCM）检测P-糖蛋白（P-gp）的表达；MTT法检测OVCAR／AR细胞的多药耐药性。结果MDR1特异性siRNA转染后，OVCAR／AR细胞MDR1 mRNA和P-gp的表达减少，分别以转染后48h和72h下降最著；转染mdr1a和mdr1b siRNA可不同程度地逆转OVCAR／AR细胞对阿霉素、泰素的耐药性，但对非P-gp介导耐药的顺铂无影响。结论阿霉素所致的卵巢癌细胞多药耐药与MDR1基因过度表达有关，体外实验中应用MDR1特异性siRNA能部分逆转OVCAR／AR细胞的多药耐药。     

胚胎干细胞体外分化为生殖细胞的研究进展

鼠胚胎干细胞体外已成功诱导分化为生殖细胞和配子,人胚胎干细胞也表现出相似的分化能力。本文重点综述了原始生殖细胞(PGC)的起源和发育、PGC发育的相关因素、体外胚胎干细胞分化为原始生殖细胞和配子的过程及其影响因素、多能成体干细胞分化为生殖细胞等方面。     

转基因RNA干扰动物研究进展

RNA干扰现象自从被发现以来,广泛应用于基因功能方面的研究。应用转基因技术,将表达shRNA的"表达元件"整合到动物基因组中,产生转基因RNA干扰动物,该动物模型体内将不同程度地减少甚至缺失目的基因的表达,为基因功能研究、疾病模型构建以及基因治疗提供了新的平台。本文综述了构建转基因RNA干扰动物的方法,构建条件转基因RNA干扰动物的载体系统以及转基因RNA干扰动物的应用前景。     

RNA干扰技术抑制Her2基因表达对卵巢上皮性癌细胞生物学特性的影响

目的 应用RNA干扰技术,观察稳定转染Her2基因的短发夹状RNA(shRNA)对不同恶性程度的卵巢上皮性癌(卵巢癌)SKOV3和SKOV3.ipl细胞Her2基因表达及细胞生物学特性的影响.方法 将表达Her2的质粒pHer2 shRNA分别转染SKOV3和SKOV3.ipl细胞,经抗性筛选获得稳定转染的细胞系.RT-PCR技术、蛋白印迹法检测转染前后细胞Her2 mRNA和蛋白的表达,体外侵袭实验观察转染前后细胞侵袭能力的改变,裸鼠接种肿瘤细胞观察转染前后细胞成瘤能力的改变.结果 转染前后SKOV3.ipl、SKOV3细胞的Her2 mRNA表达量分别为(99.9±1.3)%和(42.4±2.5)%、(68.0±3.1)%和(40.8±2.0)%.Her2蛋白的表达量分别为(98.2±1.7)%和(40.7±2.1)%、(72.1±3.4)%和(36.4±1.5)%,稳定转染后,两种细胞的Her2基因表达均明显下降,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).稳定转染pHer2 shRNA后,SKOV3.ipl细胞的穿膜细胞数由(36.2±9.7)个下降为(15.7±7.2)个,SKOV3的穿膜细胞数由(7.6±1.1)个下降为(1.8±0.8)个,细胞侵袭能力均显著下降,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).稳定转染pHer2 shRNA后,SKOV3.ip1和SKOV3细胞的成瘤重量分别由(1.55±0.31)g下降为(0.69±0.20)g、(1.14±0.10)g下降为(0.38±0.03)g,两种细胞的成瘤能力均显著下降,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 (1)针对Her2基因的RNA干扰技术可以显著降低卵巢癌细胞Her2基因的表达水平.(2)经RNA干扰作用降低Her2基因表达后,卵巢癌细胞的生物学特性改变,恶性度降低.     

RNA干扰技术沉默survivin基因逆转卵巢癌细胞株SKOV3/ADM耐药性的研究

目的检测survivin基因在卵巢上皮性癌(卵巢癌)耐药细胞株SKOV3/ADM及其亲本细胞株SKOV3中的表达水平,探讨以survivin基因为靶向的RNA干扰(RNA i)能否有效沉默survivin基因在SKOV3/ADM细胞中的表达,并能否有效逆转SKOV3/ADM细胞对化疗药物的耐药性。方法半定量RT-PCR、免疫荧光法检测survivin mRNA、蛋白在SKOV3/ADM及SKOV3细胞中的表达。以survivin基因为靶向的重组质粒pshRNA-survivin及紫杉醇作用于SKOV3/ADM细胞,将SKOV3/ADM细胞分为4组,即对照组、RNA i组、紫杉醇组、RNA i+紫杉醇组,RT-PCR技术检测各组细胞的survivinmRNA表达水平,吖啶橙/溴乙锭(AO/EB)荧光染色法及末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸标记法(TUNEL)检测各组细胞的凋亡情况。结果survivin mRNA在SKOV3/ADM、SKOV3细胞中的表达水平分别为99.1%、75.3%,SKOV3/ADM、SKOV3细胞的荧光细胞数分别为(59±5)、(42±3)个,两种细胞间比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。RNA i后SKOV3/ADM细胞中mRNA的表达水平由99.1%降低至7.9%。AO/EB荧光染色法、TUNEL法检测各组细胞凋亡数,紫杉醇组为(10.2±1.0)、(9.8±0.8)个,RNA i组为(48.5±4.9)、(49.5±4.3)个,RNA i+紫杉醇组为(71.5±6.8)、(68.3±5.7)个,RNA i+紫杉醇组与RNA i组比较,差异有统计学意义(P<0.05),RNA i+紫杉醇组与紫杉醇组比较,差异也有统计学意义(P<0.05)。结论survivin基因在SKOV3/ADM细胞中的表达显著高于SKOV3细胞。以survivin基因为靶向的RNA i可有效抑制SKOV3/ADM细胞中survivin基因的表达,有效增加了SKOV3/ADM细胞对化疗药物紫杉醇的敏感性,显著上调了SKOV3/ADM细胞的凋亡活性。     

人胚骨髓基质细胞饲养层对人胚胎生殖细胞生长的作用

目的:研究人胚原代骨髓基质细胞(BMSC)饲养层对人胚胎生殖细胞(hEGC)生长的支持作用。方法:以非意愿妊娠流产胎儿股骨为材料制备BMSC饲养层;同时取胎儿组织分离培养人成纤维细胞,以成纤维细胞培养液上清制备条件培养液(CM)。另取13.5d胎鼠制备原代小鼠胎儿成纤维细胞(PMEF)饲养层。分组培养人原始生殖细胞:A组(PMEF饲养层)、B组(BMSC饲养层)、C组(CM)、D组(BMSC饲养层+CM),观察不同条件下hEGC生长增殖行为。结果:D组与A组均有利于支持人胚胎生殖细胞的体外生长,并保持其不分化的状态和多分化的潜能,两组比较无明显差异。单用B组可支持人胚胎生殖细胞的体外生长,但效率低于上述两组。单用条件培养液不能获得贴壁生殖细胞克隆。结论:BMSC饲养层+CM可支持hEGC的体外培养,且无异源性蛋白的污染,更有利于临床应用。     

Edg4基因小分子干扰RNA载体的构建及其对卵巢上皮性癌细胞的沉默效应

目的构建针对Edg4基因的小分子干扰RNA（siRNA）载体,初步观察其对卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞的沉默效应。方法利用软件分析、设计针对人Edg4 mRNA的siRNA靶序列,合成发夹样DNA序列;退火成双链,克隆至真核表达载体pRNAT—U6．1质粒上,经PCR技术鉴定及DNA双向测序证实其序列无误后,用脂质体包裹并转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞,用荧光显微镜初步观察其在SKOV3细胞中的转染率。采用实时荧光定量荧光定量PCR技术检测转染前后SKOV3细胞中Edg4 mRNA的表达,生化法测定转染前后SKOV3细胞上清液中溶血磷脂酸（LPA）含量的变化,流式细胞术检测转染后SKOV3细胞的凋亡率。结果经PCR技术鉴定及DNA双向测序证实重组真核表达载体的序列无误,并将此命名为pRNAT—U6．1—siEdg4。荧光显微镜下观察,转染后SKOV3细胞内有明显绿色荧光信号,转染率为64％;实时荧光定量PCR技术检测显示,转染后SKOV3细胞的Edg4 mRNA表达水平（0．05±0．01）明显低于转染前（0．29±0．04,P〈0．05）;SKOV3细胞上清液中LPA的含量,转染后明显低于转染前[分别为（3．0±1．0）、（7．5±2．2）μmol／L;P〈0．05];流式细胞仪检测显示,转染后SKOV3细胞的凋亡率明显高于转染前（分别为53．38％、0．51％;P〈0．05）。结论本研究成功构建了针对人Edg4基因的siRNA真核表达载体,并能较高效转染SKOV3细胞,转染后能明显抑制SKOV3细胞中Edg4 mRNA的表达,诱导卵巢癌细胞凋亡。     

胚胎干细胞与雌性生殖细胞互相转化的研究进展

胚胎干细胞是全能性的干细胞,可以向3个胚层的细胞转化;雌性生殖细胞也被认为是一种"干细胞",因为其将遗传信息从一代传至下一代。两者具有相同和不同的特殊标志物,并且可以通过不同的方法互相转化,为"胚胎干细胞-卵母细胞环路"提出设想。     

小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为精原干细胞的研究

目的:初步探讨在体外条件下诱导小鼠胚胎干细胞(EGFP-mESC)分化为精原干细胞(SSC)的条件,建立有效的技术平台。方法:采用部分模拟胚胎早期发育的方法,将EGFP-mESC(XY)经体外悬滴培养,制备拟胚体(EB);使用免疫磁珠分选法从EB中分离出表达原始生殖细胞(PGC)表面标志SSEA-1的细胞;获得的细胞经2μmol/L维甲酸(RA)诱导增殖,使之向雄性生殖细胞分化。对诱导的细胞采用RT-PCR及免疫荧光检测特异性基因及蛋白的碱性磷酸酶。结果:在诱导EGFP-mESC向雄性生殖细胞分化的过程中,采用RT-PCR方法检测到了雄性生殖细胞特异表达基因Sry、fragilis、stella、Tex14等mRNA的表达;利用激光共聚焦方法检测到SSC表面标志蛋白Stra8、integrin-α6及Hsp90α的表达。结论:采用RA体外诱导EGFP-mESC定向分化为SSC是可行的。     

siRNA抑制卵巢癌SKOV3细胞EPAS1表达及细胞增殖的体外研究

目的:探讨RNA干扰对卵巢癌SKOV3细胞中缺氧诱导因子2(EPAS1)表达及细胞增殖的抑制作用。方法:合成靶向EPAS1的小干扰RNA(siRNA)并进行转染。实验分为实验组、阳性对照组、阴性对照组及空白对照组。采用RT-PCR和western blotting检测各组细胞EPAS1 mRNA和蛋白表达水平,通过MTT法检测各组细胞增殖情况。结果:应用EPAS1-siRNA转染卵巢癌SKOV3细胞后,实验组的EPAS1mRNA和蛋白表达水平明显降低,细胞增殖明显受限,与其他三组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组基因沉默效率为63.9%,蛋白抑制率为48.1%,细胞增殖抑制率为56.9%。结论:靶向EPAS1基因的siRNA可以抑制卵巢癌SKOV3细胞中EPAS1的表达,从而抑制SKOV3细胞在体外的增殖。     

APE1 siRNA增强卵巢癌细胞铂类敏感性的实验研究

目的:本研究通过观察脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1/Ref-1)小分子干扰核糖核酸(siRNA)对卵巢癌细胞中APE1表达水平及顺铂敏感性的影响,探讨以APE1为靶点的基因治疗在卵巢癌化疗增敏中的临床应用前景。方法:应用RNAi技术抑制卵巢癌顺铂敏感株A2780和顺铂耐药株A2780/CP70中APE1的表达,并用MTT法及TUNEL等技术检测APE1 siRNA对卵巢癌细胞铂类敏感性的影响。结果:MTT药物敏感试验表明,20MOI和40MOI APE1 siRNA处理后,A2780细胞顺铂IC50值由对照组的31.62μmol/L分别降低为13.38μmol/L和3.48μmol/L,有统计学差异(P<0.01)。20MOI和40MOI APE1 siRNA处理后,A2780/CP70细胞的顺铂IC50值分别为39.73μmol/L和12.43μmol/L,较对照组(64.20μmol/L)分别下降了38.12%和80.64%,有统计学差异(P<0.01)。TUNEL凋亡原位检测表明,40MOI APE1 siRNA处理后,A2780和A2780/CP70细胞的凋亡指数分别为(42.16±3.61)%和(46.11±3.81)%,分别是DDP组的3.57倍、4.94倍,有统计学差异(P<0.01)。结论:抑制APE1表达能显著增加卵巢癌细胞对顺铂的敏感性,APE1可能是逆转卵巢癌铂类耐药的有效靶点。     

醋酸棉酚对小鼠生殖细胞染色体的影响

本文报道了成熟的ICR 雄性小鼠,每日灌服醋酸棉酚0、1、2.5、5、7.5、10、20、30、40、50毫克/公斤,连续19天后,进行生殖细胞的染色体畸变和SCE 频率的观察。精原细胞的SCE 率检测结果表明,除了20—50毫克/公斤体重/日(临床剂量的50—125倍)高剂量组与对照组比较有显著差异(P<0.005)外,其他用药组与对照组之间不存在明显的差异(P>0.05)。精原细胞和精母细胞染色体异常率的检测表明,各用药组和对照组之间均无明显差异(P>0.05)。结果提示:常用的小剂量棉酚似不具有明显的生殖细胞遗传物质损伤效应。由此推断,停药恢复生殖能力后,对子代可能也不会有明显的影响,但是不可忽视高剂量棉酚引起精原细胞SCE 率的增加。     

42例卵巢恶性生殖细胞肿瘤临床特征及预后分析

目的:探讨卵巢恶性生殖细胞肿瘤的临床特征与预后的关系。方法:收集我院2006年8月至2012年2月收治的42例卵巢恶性生殖细胞肿瘤的临床资料,分析其肿瘤类型、分期、治疗方案等预后相关因素,研究其临床特征与不良预后的关系。结果:42例卵巢恶性生殖细胞肿瘤包括混合性生殖细胞肿瘤16例(38.1%)、未成熟畸胎瘤12例(28.6%)、无性细胞瘤6例(14.3%),卵黄囊瘤4例(9.5%)、绒毛膜癌1例(2.4%)及胚胎癌1例(2.4%)等。42例患者全部进行手术治疗,其中30例在初次手术中保留了生育功能,34例在术后给予BEP方案(博来霉素+依托泊苷+顺铂)或BVP方案(博来霉素+长春新碱+顺铂)化疗。2年生存率97.5%(39/40),死亡1例(Ⅳ期混合性生殖细胞肿瘤),复发率37.5%(15/40),混合性生殖细胞肿瘤复发占66.7%(10/15);5年生存率88.2%(15/17),死亡2例(均为恶性混合性生殖细胞肿瘤)。不同病理分期、肿瘤直径、肿瘤类型和手术方式的5年生存率比较,差异均无统计学意义(P0.05)。结论:保留生育功能手术及规范化的BEP或BVP方案化疗,5年总体生存率较高,但混合性生殖细胞肿瘤预后相对较差。卵巢恶性生殖细胞肿瘤的病理分期、肿瘤直径及肿瘤类型与生存率的关系还需进一步研究。     

siRNA干扰syk基因对永生化宫颈上皮细胞增殖和侵袭的影响

目的:用小干扰RNA(siRNA)干扰人永生化宫颈鳞状上皮细胞系H8中脾酪氨酸激酶(syk)的表达,观察syk表达降低对细胞增殖和侵袭能力的影响,初步探讨syk在宫颈癌侵袭转移中所起的作用及其表达改变可能影响到的下游靶基因。方法:用siRNA syk干扰永生化宫颈上皮细胞内syk的表达,并以转染control siRNA的细胞作为对照,转染48h后,分别用qRT-PCR和Western blot方法评价干扰效果;在24,48,72h用MTT法检测干扰后细胞增殖情况;Transwell检测细胞侵袭能力;并用qRT-PCR和Western blot方法检测基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达。结果:siRNA干扰syk后能显著降低永生化宫颈上皮细胞系H8内syk mRNA及蛋白的表达(P<0.01)。Syk表达降低并未影响永生化宫颈上皮细胞系H8的增殖(P>0.05),但能使永生化宫颈上皮细胞系H8的侵袭能力显著增强(侵袭细胞数115.57±10.31 vs 39.76±8.79,P<0.01),且syk表达降低后MMP-9的mRNA和蛋白表达均显著增加(P<0.01)。结论:syk表达降低导致永生化宫颈上皮细胞的侵袭能力增加,可能与其表达降低后使MMP-9表达增加相关,syk表达降低与宫颈癌的侵袭转移密切相关。     

基因芯片筛查多囊卵巢综合征来源胚胎干细胞分化的脂肪细胞中的差异基因

目的:筛选出与多囊卵巢综合症(PCOS)相关的特异表达基因,以期阐明PCOS的发病机制。方法:将本实验室自主建立的PCOS来源和非PCOS来源的人胚胎干细胞(hESCs)系定向分化成脂肪细胞,应用北京博奥生物有限公司的晶芯?人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片检测不同来源脂肪细胞中的差异基因。结果:PCOS来源和非PCOS来源的人胚胎干细胞均成功诱导分化成了脂肪细胞,共筛选出2种脂肪细胞中的差异表达基因153个,其中PCOS来源脂肪细胞上调表达91个,下调表达62个。挑选上调表达的6个基因进行Real-time PCR验证,与基因芯片检测结果一致。结论:PCOS和非PCOS来源hESCs分化的脂肪细胞在基因表达上有差异,这些差异基因很多涉及糖、脂代谢,并与甾体激素相关,进一步研究后有部分基因可作为PCOS发生、发展的候选基因。     

罗格列酮对人胚胎干细胞向脂肪细胞分化的影响

目的:探讨罗格列酮对人胚胎干细胞(hESCs)向脂肪细胞分化的作用。方法:收集常规IVF/ICSI-ET周期废弃胚胎,建立并鉴定hESCs系,扩增备用。根据基础成脂诱导分化培养基中是否添加10μmol/L罗格列酮分为实验组和对照组,采用油红-O染色测定细胞内脂滴、GPO-POD酶法测定细胞内甘油三酯和RT-PCR法测定脂肪细胞特异性基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)mRNA鉴定脂肪细胞,并进行组间比较。结果:hESCs可定向诱导分化为脂肪细胞,罗格列酮刺激组较对照组甘油三酯含量高,差异具有显著性(P<0.05)。结论:PPARγ激动剂——罗格列酮对人胚胎干细胞向脂肪细胞诱导分化有促进作用,可显著提高诱导分化效率。     

siRNA对宫颈癌细胞系 HPV16 E6基因的作用

目的 构建并筛选出最有效的HIV16 E6基因特异的小干扰RNA(amall interfering RNA，siRNA)表达载体，观察其对宫颈癌细胞中HIV16 E6基因表达的长期影响，探讨E6基因在宫颈癌发生过程中的分子作用机制，为临床HIV感染及宫颈癌治疗探索新方法。方法 构建Hairpin siRNA质粒，稳定转染宫颈癌SiHa细胞，鉴定转染细胞中的质粒DNA，通过Real-Time RT-PCR检测细胞中HPV16 E6mRNA表达，采用Westem-blot检测p53、p21等蛋白的变化。MTT法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)检测SiHa细胞转染siRNA后细胞增殖曲线。结果 HIV16 E6A hairpin siRNA表达载体转染人宫颈癌SiHa细胞，可以在细胞内长期表达siRNA，有效抑制细胞内HIV16 E6基因的表达。E6A siRNA能抑制细胞生长，作用持续达4个月以上。结论 利用siRNA表达载体抑制整合在细胞中的外源HIV E6病毒癌基因可能是治疗HIV感染和宫颈癌的一种新的理想方法。