沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR快速检测技术的建立与应用

目的建立快速同时检测沙门菌、志贺菌和副溶血弧菌的多重聚合酶链反应（PCR）技术。方法根据沙门菌hilA基因、志贺菌ipaH基因及副溶血性弧菌tdh基因序列设计引物，进行PCR扩增及电泳检测。同时优化反应体系，测定特异性和灵敏度。结果该多重PCR技术能在8h内同时检测3种目的菌，通过检测其他9种常见食源性致病菌，结果表明该方法特异性好，多重PCR检测灵敏度分别为：沙门菌10^4cfu／mL，志贺菌10^2cfu／mL，副溶血性弧菌10^4cfu／mL。并进行了人工模拟食品和粪便样品的检测。结论初步建立能在8h内快速、灵敏、特异地同时测定沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR检测技术。     

沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR快速检测技术的建立与应用

目的建立快速同时检测沙门菌、志贺菌和副溶血弧菌的多重聚合酶链反应(PCR)技术。方法根据沙门菌hilA基因、志贺菌ipaH基因及副溶血性弧菌tdh基因序列设计引物,进行PCR扩增及电泳检测。同时优化反应体系,测定特异性和灵敏度。结果该多重PCR技术能在8 h内同时检测3种目的菌,通过检测其他9种常见食源性致病菌,结果表明该方法特异性好,多重PCR检测灵敏度分别为:沙门菌104cfu/mL,志贺菌102cfu/mL,副溶血性弧菌104cfu/mL。并进行了人工模拟食品和粪便样品的检测。结论初步建立能在8h内快速、灵敏、特异地同时测定沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR检测技术。     

三种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立快速检测沙门菌、变形杆菌和金黄色葡萄球菌的多重聚合酶链反应（PCR）方法。方法本研究依据沙门菌侵袭基因正调节蛋白（hilA）基因、变形杆菌溶血素（hpmA）基因和金黄色葡萄球菌特异性pSa-442序列,运用PrimerPremier5．0分别设计3对特异性引物,预计PCR扩增的目的基因片段分别为为580bp、401bp、256bp。通过对单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及建立L16（4^3）正交试验对单管多重PCR扩增条件如引物浓度、dNTP浓度和Tm值等的优化,建立了快速同时检测3种食源性致病菌的单管多重PCR方法。结果该方法检测的灵敏度分别为：94．07pg沙门菌DNA,140．85ng变形杆菌DNA,1．41ng金黄色葡萄球菌DNA。模拟检测食品中的混合3种菌,4h培养后样品的最低检测限度分别为：沙门菌10^0菌落形成单位（CFU）／mL、变形杆菌10^1CFU／mL、金黄色葡萄球菌10^0CFU／mL。结论该方法特异性和灵敏度高,检验周期短,可用于对食品中多种致病菌的快速诊检和监控。     

多重PCR检测缺失型α地中海贫血

目的　针对中国人常见的缺失型α地中海贫血建立一种快速、简便、可靠的多重聚合酶链反应 (PCR)基因诊断技术。方法　设计 4对引物 ,利用单管多重PCR方法进行扩增 ,同时检测 3种缺失型和正常的α2 珠蛋白基因。结果　成功检测出正常人及 3种缺失型的杂合子、双重杂合子 ;正常α2 基因的扩增片段为 180 0bp ,东南亚型缺失基因的扩增片段为 70 8bp ,右侧缺失基因的扩增片段为 2 0 2 2bp ,左侧缺失基因的扩增片段为 16 2 8bp , α3 .7/ SEA双重杂合子的扩增片段为 2 0 2 2bp和 70 8bp , α4.2 / SEA双重杂合子的扩增片段为 16 2 8bp和 70 8bp。结论　 790例标本的基因检测结果分析表明 ,该法快速、准确 ,可用于常规临床标本的检测。     

三种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立快速检测沙门菌、变形杆菌和金黄色葡萄球菌的多重聚合酶链反应(PCR)方法。方法本研究依据沙门菌侵袭基因正调节蛋白(hilA)基因、变形杆菌溶血素(hpmA)基因和金黄色葡萄球菌特异性pSa-442序列,运用Primer Premier 5.0分别设计3对特异性引物,预计PCR扩增的目的基因片段分别为为580bp、401 bp、256 bp。通过对单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及建立L16(43)正交试验对单管多重PCR扩增条件如引物浓度、dNTP浓度和Tm值等的优化,建立了快速同时检测3种食源性致病菌的单管多重PCR方法。结果该方法检测的灵敏度分别为:94.07 pg沙门菌DNA,140.85 ng变形杆菌DNA,1.41 ng金黄色葡萄球菌DNA。模拟检测食品中的混合3种菌,4 h培养后样品的最低检测限度分别为:沙门菌100菌落形成单位(CFU)/mL、变形杆菌101CFU/mL、金黄色葡萄球菌100CFU/mL。结论该方法特异性和灵敏度高,检验周期短,可用于对食品中多种致病菌的快速诊检和监控。     

白色念珠菌巢式PCR法的建立和临床应用初步评价

目的建立用于临床标本中白色念珠菌快速检测的巢式聚合酶链反应。方法以念珠菌属18SrDNA上一段保守序列为通用引物(外套引物),可扩增出257bp的片段,以白色念珠菌内转录2区中选择种特异性引物(内套引物),目标碱基长度为386bp,建立巢式聚合酶联反应(nestedPCR,nPCR)。结果对白色念珠菌的实验检测表明,nPCR的特异性和重复性均达100%,敏感性为32~64cfu/ml。初步临床标本应用表明,nPCR的检测效果显著高于培养法(χ2=31.52,P<0.001)。结论采用nPCR技术,不但可对分离的白色念珠菌进行鉴定,而且可直接用于临床标本中白色念珠菌的检测。     

应用聚合酶链反应法检测食品中的沙门菌

目的建立食品中沙门菌聚合酶链反应（PCR）的快速检测方法。方法根据沙门菌invA基因序列设计引物；氯化镁孔雀绿选择性增菌0到8h后，煮沸法提取DNA，用PCR扩增电泳。结果PCR法能特异性检测出食品中的沙门菌，扩增片段为389bp，增菌前的检出限为10^2CFU／g，增菌后为2CFU／25g。结论应用PCR检测沙门菌具有快速、特异、灵敏和简便的特点。     

弥散黏附性大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立及其在感染性腹泻患者中的流行情况

目的 建立一种快速检测弥散黏附性大肠埃希菌（DAEC）的普通多重PCR方法,了解DAEC在腹泻患者中的流行情况。方法 根据DAEC黏附基因afaB、afaC、afaD、daaE及16S rRNA基因rrs,建立4重PCR反应体系,对PCR引物、反应体系和反应条件进行优化,评价敏感性和特异性,并应用于389份腹泻患者粪便标本的筛查。结果 4重PCR反应可以特异性扩增DAEC菌株afaB/C、afaD、daaE基因片段,除2株肠集聚性大肠埃希菌（EAEC）外,检测引物对其他致泻性大肠埃希菌及常见肠道病原菌均无特异性扩增,此多重PCR方法的检测下限可达3.20 101 CFU/反应（8.01 103 CFU/ml）。利用本研究建立的多重PCR方法对腹泻患者粪便标本进行检测,发现DAEC菌株分离率为6.2%（24/389）。结论 本研究建立的多重PCR方法可用于DAEC菌株的快速鉴别,也可用于人粪便标本DAEC的初步筛查。     

基于双启动寡聚核苷酸引物的沙门菌、志贺菌、弯曲杆菌、耶尔森菌多重实时荧光PCR方法的建立

目的建立多重实时荧光PCR同时检测沙门菌、志贺菌、弯曲杆菌、耶尔森菌的方法。方法通过设计针对沙门菌、志贺菌、弯曲杆菌和耶尔森菌的双寡聚核苷酸引物,来建立这4种病原体的多重PCR检测体系。结果建立的多重PCR体系可同时特异性扩增4种病原体的DNA片段。沙门菌和弯曲杆菌的特异性和敏感度都是100.0%,志贺菌和耶尔森菌的敏感度是100.0%,特异性分别是99.3%和98.6%。最低检测限均为103 copies/mL。结论该体系可快速、有效、准确检测出样品中4种病原体的存在,可用于肠胃道相关病原体感染的辅助评价。     

模拟粪便标本单增李斯特菌和伊氏李斯特菌TaqMan双重实时荧光定量-聚合酶链反应检测方法

目的建立一种TaqMan双重实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time PCR),用于模拟粪便标本中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的快速检测。方法以单增李斯特菌特异基因hly和伊氏李斯特菌特异基因smcL作为靶基因,合成2对引物和其相应的荧光探针,制作标准曲线,建立从模拟粪便标本中直接检测单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的TaqMan双重real-time PCR。利用李斯特菌属中其他种李斯特菌及常见致病菌验证引物、探针的特异性;通过制备模拟粪便标本并对其进行二次增菌后,分别提取DNA,采用TaqMan双重real-time PCR进行检测,以达到快速检测单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的目的。结果采用本研究建立的TaqMan双重real-time PCR对模拟粪便标本的检测结果显示特异性良好,与其他种李斯特菌和其他病原菌均无交叉反应。模拟粪便标本中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的检测下限分别为2.45×103cfu/g和2.92×103cfu/g;模拟粪便标本在3 h内可得出检测结果,当模拟粪便标本中单增李斯特菌含量为6 cfu/g和伊氏李斯特菌含量为5 cfu/g时,经过增菌后使用双重real-time PCR可检测出阳性结果。结论本研究建立了以单增李斯特菌的特异基因hly和伊氏李斯特菌的特异基因smcL为靶基因的TaqMan双重realtime PCR检测方法,该方法具有特异性好、敏感性高、快速易操作等优点,可用于临床、食品及环境标本的快速诊断,以及我国人群中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的携带或感染状况的调查分析。     

性病病原体多重聚合酶链反应检测方法的建立和验证

目的建立同时检测淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体和单纯疱疹病毒-2致病微生物的多重聚合酶链反应（PCR）方法,用于四种性病的诊断和治疗监测。方法根据淋球菌外膜孔蛋白基因、沙眼衣原体基因、解脲支原体尿素酶基因和单纯疱疹病毒-2的DNA聚合酶基因序列,各设计一对特异性引物,优化反应体系和条件进行多重PCR反应。结果4对引物分别扩增出327、167、426、391bp的目的条带,并且特异性强,与其他非目的病原体基因不发生反应。结论本研究建立的多重PCR方法为相关病原体的快速检测提供方法。     

白色念珠菌的快速检测技术开发

目的利用白色念珠菌单克隆抗体建立一种快速检测临床标本中白色念珠菌的方法。方法利用免疫层析技术,采用双抗夹心法制作成检测白色念珠菌的检测卡。利用标准菌株及临床标本对检测卡的最低检测限、交叉反应进行评估。与荧光PCR核酸扩增法进行试验对比,评估其灵敏度、特异度。结果该方法的最低检测限为10^4 cfu/mL,对可能造成交叉反应的临床常见的菌株,如热带念珠菌、克柔氏念珠菌、曲霉、金黄色葡萄球菌等真菌和细菌进行检测,均无交叉反应。该检测卡的灵敏度及特异度分别为80.00%和97.00%,与荧光PCR核酸扩增法进行对比,差异有统计学意义(P<0.05),Kappa值为0.737,两种方法一致性一般。结论该研究建立了一种灵敏度、特异度、准确度较高的,能快速检测临床标本中白色念珠菌的方法,对于有临床症状而快速检测结果为阴性的标本,建议进行荧光PCR核酸扩增法检测。     

基于液相芯片技术建立快速检测6 种临床常见血流感染厌氧菌的方法及评价

目的 基于液相芯片技术建立一种可同时快速检测 6种临床常见血流感染厌氧菌的方法。方法 通过 GenBank寻找脆弱拟杆菌、厌氧消化链球菌、具核梭杆菌、中间普雷沃菌、产气荚膜梭菌和痤疮丙酸杆菌的 16S rDNA基因序列,经序列比对分析,选择菌内保守菌间特异的区域作靶序列,使用 Primer 5.0软件设计特异性引物及探针,建立不对称多重 PCR扩增体系,将 PCR产物与偶联核酸探针的荧光微球混合物进行杂交,建立一种多重检测方法,并对该方法的特异度、灵敏度和重复性进行评价。收集 2020年 6月～2022年 5月东莞市厚街医院阳性血厌氧培养瓶 84例及阴性培养瓶 16例,应用建立的方法进行检测,结果与传统培养法进行比较。结果 6种厌氧菌靶基因序列经 PCR扩增后,电泳成像清晰可见 6条目标条带;经反应体系优化,生物素标记与非标记引物浓度比为 4∶1时,选择退火温度 56℃进行多重扩增,加入 5μl PCR产物, 52℃温育 20 min检测效果最佳;各目标序列荧光强度中位值（median fluorescence intensity,Mfi）＞ 1 000,无非特异性信号;最低检测限可达 103cfu/ml～104cfu/ml;当菌液浓度为 105cfu/ml时,批内及批间的变异系数分别在 7.38%和 11.10%以下; 100例临床样本中 6种厌氧菌的检测结果与培养法一致。结论 成功建立一种快速、简便、高效的液相芯片方法,可同时检测 6种常见血流感染厌氧菌。     

16S rDNA检测在临床细菌检验中的应用

目的根据细菌16S rDNA的高度保守性,设计合成所有细菌的通用引物,建立快速检测细菌的方法。方法应用PCR方法检测细菌16S rDNA基因。同时对白假丝酵母菌、人白细胞DNA和HBV-DNA阳性病人血清同法检测。结果所有检测细菌均出现特异性条带,而白假丝酵母菌、人白细胞DNA和HBV-DNA阳性病人血清阴性。结论该法快速、特异、敏感。一个样品中能同时检测多种细菌,可为实验室初步判断是否存在细菌感染提供客观依据。     

两种念珠菌DNA探针的研制及应用

目的：制备两种念珠菌DNA探针并应用于临床诊断。方法：对聚合酶链反应扩增的白色念珠菌标准株的E03基因的125bp片段，用半抗原地高辛标记；合成仪合成的E03基因中25bp特异寡核苷酸，用生物素标记。检测两种探针显色敏感度，并与23株临床分离的白色念珠菌、热带念珠菌，近平滑念珠菌、克柔念珠菌、星形念珠菌及大肠埃希菌等细菌进行斑点杂交试验。结果：Dig-125bpDNA探针显色敏感度为0.01pg，仅与白色念珠菌杂交，且对临床分离株检测的结果与传统厚膜孢子鉴定法相符。Bio-25bpDNA探针显色敏感度为20pg，与白色念珠菌、近平滑念珠菌及星形念珠菌杂交。结论：Bio-25bp DNA探针可用于念珠菌初步鉴定，而Dig-125bp DNA探针可用于白色念珠菌的鉴定。     

多重实时荧光PCR快速检测沙门菌和单增李斯特菌

目的 建立可同时检测沙门菌、单增李斯特菌的双重实时荧光PCR快速检测方法,并应用于食品样品的检测.方法 根据GenBank上下载的沙门菌invA基因、单增李斯特菌hlyA基因的保守区序列分别设计特异性引物和TaqMan探针,建立并优化双重实时荧光PCR反应体系.对该方法的特异性、敏感性和稳定性进行评估,并应用于食品标本...     

Amplification of an invA gene sequence of Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of detection of Salmonella.

Amplification of nucleotide sequences within the invA gene of Salmonella typhimurium was evaluated as a means of detecting Salmonella. A collection of 630 strains of Salmonella comprising over 100 serovars, including the 20 most prevalent serovars isolated from animals and humans in Canada, was examined. Controls consisted of 142 non-Salmonella strains comprising 21 genera of bacteria. Cultures were screened by inoculating a single colony of bacteria directly into a polymerase chain reaction (PCR) mixture which contained a pair of primers specific for the invA gene. The specific PCR product was a 284 bp DNA fragment which was visualized in 2% agarose gels. With the exception of two S. litchfield and two S. senftenberg strains, all Salmonella strains were detected. In contrast, none of the non-Salmonella strains yielded the specific amplification product. Non-specific amplification of a few non-Salmonella strains resulted in a product that was distinctly different in size from the specific 284 bp product. Specificity of amplification was further confirmed by demonstration of hybridization of a 32P-labelled invA gene fragment only to the specific 284 bp product. The detection of 99.4% of Salmonella strains tested and the failure to specifically amplify DNA from non-Salmonella strains confirm that the invA gene contains sequences unique to Salmonella and demonstrate that this gene is a suitable PCR target, with potential diagnostic applications.     

脓毒症常见病原菌多重实时PCR检测方法的建立

目的 建立可同时检测脓毒症患者血液中肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和白假丝酵母菌的多重实时PCR方法。方法 根据各病原菌基因组保守序列设计引物和探针,建立多重实时PCR检测方法。对建立的多重实时PCR检测方法进行特异性、敏感性和灵敏度分析,并使用该法对112份脓毒症血培养阳性标本进行验证。结果 成功建立脓毒症常见病原菌的多重实时PCR检测方法。此方法特异性、敏感性良好,灵敏度达10-5 ng/l,与标准检测方法（血培养加生化鉴定）相比,缩短了20 h。112份临床血培养阳性标本中,目标病原菌83例,多重实时PCR检出80例阳性;非目标病原菌29例,多重实时PCR检测均为阴性。检测结果显示,该方法特异性达100%,敏感性达96.39%。结论 该多重实时PCR检测方法具有快速、高效、灵敏、特异的优点,可用于临床重症监护室患者血液常见感染病原菌的诊断。     

Multiplex PCR amplification and immobilized capture probes for detection of bacterial pathogens and indicators in water

Detection of pathogens (Legionella species) and indicator bacteria (coliform bacteria) was achieved by multiplex (simultaneous) PCR amplification of diagnostic gene sequences and by hybridization to immobilized poly-dT-tailed capture probes using a dot- or slot-blot approach. Complex manipulations of primer concentrations and staggered additions of primers were required in order to achieve equal amplification of multiple genes. Multiplex PCR amplification of two different Legionella genes, one specific for L. pneumophila (mip) and the other for the genus Legionella (5S rRNA), was achieved by staggered amplification. Multiplex PCR amplification using differing amounts of primers specific for lacZ and lamB genes permitted the detection of coliform bacteria and those associated with human faecal contamination, including the indicator bacterial species E. coli and enteric pathogens Salmonella and Shigella. Hybridization of biotin-labelled amplified DNA, in which the biotin was incorporated during PCR amplification from biotinylated-dUTP, to immobilized 400-dT-tailed capture probes permitted specific and sensitive detection of target gene sequences. The sensitivity of colorimetric detection achieved by PCR amplification of target DNA was at a level equivalent to 1-2 bacterial cells, which is the same level of sensitivity obtained with radioactive detection. The simultaneous amplification of several genes and hybridization to immobilized capture probes with colorimetric detection is an effective, efficient and rapid detection method for various human bacterial pathogens.     

Application of a convenient DNA extraction method and multiplex PCR for the direct detection of Staphylococcus aureus and Yersinia enterocolitica in milk samples

The application of PCR for the direct and sensitive detection of food-borne pathogens is largely affected by the quality of the template DNA prepared from food samples. In the present study, a chemical extraction method of bacterial DNA from spiked milk samples for the direct detection of Staphylococcus aureus and Yersinia enterocolitica was evaluated by PCR. Gene specific primers were designed to target the nuclease (nuc) and the attachment invasion locus (ail) genes of S. aureus and Y. enterocolitica, respectively and used in PCR. A combination of organic solvents, detergents and alkali in the DNA extraction method permitted a detection limit of 10 cfu ml(-1) milk for both the pathogens. When equal numbers of S. aureus and Y. enterocolitica were spiked in milk samples, the individual detection limit was determined to be 10(3) cfu ml(-1) milk. Simultaneous amplification of 482 and 359 bp fragments of the nuc and ail genes was obtained using the primer pairs in a single reaction. Multiplex PCR enabled the detection of 10(4) cfu ml(-1) milk of S. aureus and Y. enterocolitica without any pre-enrichment step. A combination of conventional isolation technique and PCR using DNA extracted by the proposed method was used to test raw milk samples for possible contamination with S. aureus and Y. enterocolitica. The presence of S. aureus in the tested samples was indicated by both the methods while Y. enterocolitica could not be detected in any of the samples. The template DNA extraction method developed in this study is rapid, sensitive and avoids interference from potential PCR inhibitors and demonstrates the potential of detecting multiple pathogens in milk samples without any enrichment.