内皮-单核细胞激活多肽对人U118胶质瘤细胞自噬的影响及机制

目的研究内皮-单核细胞激活多肽(EMAP-Ⅱ)对人U118脑胶质瘤细胞自噬的影响及可能机制。方法 EMAP-Ⅱ处理人U118胶质瘤细胞后,采用MTT检测细胞活力;用免疫荧光法检测自噬标记物微管相关蛋白轻链-3(LC3)在U118细胞的分布;Western blot方法检测LC3-Ⅱ、自噬降解底物p62/SQSTM1和自噬相关蛋白Beclin1的蛋白表达水平。结果与EMAP-Ⅱ0 h组相比,0.05 nmol.L-1剂量以上的EMAP-Ⅱ可明显抑制人U118胶质瘤细胞的活力,降低线粒体膜电位(MMP),在EMAP-Ⅱ作用0.5 h时效果最明显;自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)能够阻断EMAP-Ⅱ的作用,使细胞活力和线粒体膜电位基本恢复;EMAP-Ⅱ作用0.5 h后自噬标记物LC3在胞质内呈点状分布,荧光表达明显增强,并且LC3-Ⅱ的蛋白表达水平明显上调;同时伴有自噬降解底物p62/SQSTM1的表达下降;此外,自噬相关蛋白Beclin1的蛋白表达水平明显上调。结论 EMAP-Ⅱ能明显抑制人U118胶质瘤细胞活力,诱导U118细胞发生自噬,其机制可能与自噬相关蛋白Beclin1上调有关。     

微小RNA-375调控自噬抑制肝癌细胞SMMC-7721增殖和转移

目的 探讨微小 RNA-375（miR-375）通过调控自噬相关蛋白（Atg）14 介导的自噬对肝癌细胞（SMMC-7721）增殖和转移能力的影响。方法 将SMMC-7721细胞分别用miR-375模拟物、抑制物以及Atg14的干扰RNA处理,并建立缺氧1 h复氧6 h的模型,分为miR-375 NC组、miR-375 mimics组、miR-375 inhibitor组以及siRNA NC组、Atg14 siRNA 组、miR-375+Atg14 siRNA 组。TargetScan 预测 miR-375 与 Atg14 基因相关性。荧光实时定量 PCR（qRT-PCR）检测miR-375 NC组、miR-375 mimics组、miR-375 inhibitor组miR-375、Atg14 mRNA相对表达量。免疫细胞化学染色检测3组细胞内N-钙黏素（N-Cadherin）和β-连环蛋白（β-catenin）表达分布情况。绿色荧光蛋白-红 色荧光蛋白-轻链（mGFP-RFP-LC3）自噬双标腺病毒转染3组细胞,荧光显微镜下观察自噬体形成情况。平板克隆检测肝癌细胞增殖情况。Western blot 检测Atg14、泛素结合蛋白（P62）、轻链3Ⅰ（LC3Ⅰ）、轻链3Ⅱ（LC3Ⅱ）、酵母Atg6同源物（Beclin1）、N-Cadherin、β-catenin和波形蛋白（Vimentin）表达情况。结果 miR-375与Atg14基因相关性较高,qRT-PCR显示过表达miR-375能抑制Atg14 mRNA表达;反之能促进Atg14 mRNA表达。过表达miR-375能抑制肝癌细胞内N-Cadherin表达、提高β-catenin表达水平,抑制肝癌细胞增殖能力（P＜0.01）;而抑制miR-375表达能促进N-Cadherin表达、降低β-catenin表达水平,提高肝癌细胞增殖能力（P＜0.01）。过表达miR-375能抑制Atg14、LC3Ⅱ、Beclin1表达,促进P62表达（P＜0.01）;反之能促进Atg14、LC3Ⅱ、Beclin1表达,抑制P62表达（P＜0.01）。荧 光显微镜下观察到过表达 miR-375 可抑制自噬体形成,而抑制 miR-375 表达能促进自噬体形成（P＜0.01）。干扰Atg14表达后可增强miR-375对肝癌细胞增殖、转移能力的抑制作用（P＜0.01）。结论 激活miR-375能抑制肝癌细胞增殖和转移,而抑制miR-375能促进肝癌细胞增殖和转移,其机制可能与miR-375通过靶向调控Atg14抑制自噬,从而抑制SMMC-7721肝癌细胞增殖和转移有关。     

自噬在人肝癌细胞Huh7对仑伐替尼耐药中的调节作用

目的 研究自噬在人肝癌细胞Huh7对仑伐替尼耐药中的调节作用。方法 以人肝癌细胞Huh7为对象,采用低浓度逐渐递增联合长期给药的方式构建仑伐替尼耐药细胞模型Huh7-LR,以CCK-8实验和流式细胞术检测亲本细胞Huh7及耐药细胞Huh7-LR对仑伐替尼的敏感性,以Western blot实验和GFP-mCherry-LC3质粒转染实验分别检测细胞中自噬效应蛋白Beclin-1、自噬接头蛋白sequestosome 1（又名p62）、微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达水平和细胞自噬水平。通过饥饿诱导构建自噬激活细胞模型,以Western blot实验和GFP-mCherry-LC3质粒转染实验分别检测细胞中p62蛋白表达水平和细胞自噬水平,以流式细胞术检测自噬激活对仑伐替尼敏感性的影响。结果 与亲本细胞相比,Huh7-LR细胞的耐药指数为6.2,其p62蛋白的表达水平显著升高,凋亡率、Beclin-1蛋白的表达水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均显著降低（P<0.05或P<0.01）,自噬水平有所下降。自噬激活可显著升高Huh7-LR细胞中p62蛋白的表达水平（P<0.0...     

羰基氰氯苯腙调节非经典自噬的机制研究

目的探讨可以调控羰基氰氯苯腙(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone,CCCP)诱导的不依赖自噬关键基因的非经典自噬的影响因素。方法分别将野生型细胞和自噬关键基因敲除/敲低的细胞(Atg5-KO MEF,FIP-200 KO MEF,ULK1-KO MEF,Beclin 1-KO U251)用CCCP处理,观察GFP-LC3的分布聚集情况和LC3蛋白水平的表达。荧光定量PCR检测CCCP处理后LC3B mRNA水平变化。Western blot检测FIP200-KO MEF中CCCP处理时,水通道蛋白抑制剂对LC3蛋白水平的影响。结果在Atg5-KO MEF细胞中,和对照组相比,CCCP处理组免疫荧光实验不能产生GFP-LC3自噬斑点,Western blot结果显示LC3-I型不能转变为LC3-II。而在ULK1-KO MEF,FIP200-KO MEF,及Beclin1-KD U251细胞中,CCCP处理组免疫荧光实验能产生GFP-LC3自噬斑点,同时LC3-I型也能转变为LC3-II型。但CCCP处理不影响LC3B的mRNA水平。CCCP诱导的非经典自噬能被水通道蛋白抑制剂所抑制。结论 CCCP诱导的非经典自噬需要自噬关键基因Atg5参与,但不需要Beclin 1,ULK1,FIP200的参与,不影响LC3B的转录调控。渗透压不平衡可以调节CCCP诱导的自噬。     

DAPT对慢性社会挫败应激诱导小鼠抑郁样行为的作用及机制北大核心CSCD

目的探究DAPT对慢性应激诱导的小鼠抑郁样行为的作用及机制。方法C57BL/6J小鼠给予慢性社会挫败应激(chronic social defeat stress,CSDS)处理10 d以建立抑郁模型,药物处理组小鼠每天腹腔注射DAPT 5 mg·kg^(-1)。通过社会接触、糖水偏爱、旷场、强迫游泳和悬尾实验来评价小鼠的抑郁样行为;采用Western blot检测小鼠海马NLRP3、ASC、caspase-1、TNF-α、p62、Atg7、Atg5和Beclin1蛋白的表达,运用ELISA检测小鼠海马IL-1β和IL-18的表达水平。结果CSDS诱导小鼠出现明显的抑郁样行为,同时增加了小鼠海马NLRP3、ASC、caspase-1的表达和炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-18的水平,另外,CSDS处理小鼠海马自噬相关蛋白Atg7、Atg5和Beclin1表达明显减少,而p62的表达则明显增加。DAPT处理能明显改善CSDS诱导的小鼠抑郁样行为,并能抑制NLRP3、ASC、caspase-1、TNF-α、IL-1β、IL-18以及p62蛋白表达的增加和Atg7、Atg5和Beclin1蛋白表达的减少。结论DAPT能够改善慢性应激诱导的小鼠抑郁样行为,其机制可能与其抑制NLRP3炎症小体激活和上调自噬功能有关。     

自噬在米诺环素保护PC12细胞氧糖剥夺-复糖复氧中的作用

目的:探讨自噬在米诺环素保护PC12细胞氧糖剥夺-复糖复氧中的作用。方法:构建PC12细胞氧糖剥夺-复糖复氧模型,采用米诺环素(MC,1、10、100μmol/L)或3-甲基腺嘌呤(3-MA,5mmol/L)进行干预,MTT检测细胞活力,单丹磺酰戊二胺(MDC)染色观察自噬泡,Western blot检测自噬相关蛋白Beclin1、微管相关蛋白轻链3(LC3Ⅱ)、泛素结合蛋白P62/SQSTM l的表达。结果:氧糖剥夺处理后,1μmol/L和10μmol/L的MC能显著提高PC12细胞的存活率,而100μmol/L则会加重细胞的损伤。蛋白LC3Ⅱ和Beclin1的表达与MC的浓度呈正相关性,自噬抑制剂3-MA能够降低LC3Ⅱ和Beclin1,增加P62/SQSTM l的表达逆转MC的保护作用。结论:低剂量(1、10μmol/L)MC能够通过增加LC3Ⅱ和Beclin1的表达,诱导PC12细胞产生自噬从而保护氧糖剥夺-复糖复氧处理后的PC12细胞。     

1,8-桉叶油素调节自噬改善高糖诱导的内皮细胞损伤

目的探讨1,8-桉叶油素(1,8-Cineole)通过调节自噬来改善高糖(HG)诱导人主动脉内皮细胞(HAECs)损伤的保护作用。方法采用HG作用HAECs 60 h,不同剂量的1,8-Cineole进行干预,运用噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力,乳酸脱氢酶(LDH)检测细胞毒性,Western blot法检测Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62、caspase-3和caspase-9的蛋白表达,及使用自噬抑制剂氯喹(CQ)作用HAECs后,检测Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62、caspase-3和caspase-9的表达情况。结果1,8-Cineole提高细胞活力,减少LDH含量,激活自噬和抑制细胞凋亡。与空白组比较,CQ组的Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62、caspase-3和caspase-9表达增加,同时观察到CQ+HG+CH组与CQ+HG组比较时,以上蛋白差异均无统计学意义。结论1,8-Cineole对高糖诱导HAECs损伤具有保护作用,其作用与改善自噬流相关。     

雷公藤甲素诱导自噬促进人肾小管上皮HK-2细胞凋亡

目的 研究自噬在雷公藤甲素(triptolide, TP)诱导人肾近端小管上皮HK-2细胞凋亡中的作用。方法 以HK-2细胞为研究对象,CCK-8法检测细胞存活率;倒置荧光显微镜观察细胞形态变化;流式细胞术检测细胞凋亡率和线粒体膜电位MMP变化;激光扫描共聚焦显微镜观察细胞内LC3荧光强度变化;Western blot检测细胞凋亡及自噬相关蛋白cleaved caspase 9、caspase 9、Bax、Bcl-2、LC3、p62和Beclin 1的表达;采用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)和自噬激动剂雷帕霉素(rapamycin, Rap)研究自噬对TP诱导HK-2细胞凋亡的影响。结果 TP降低HK-2细胞存活率,诱导细胞凋亡和自噬,降低MMP水平,增加胞内LC3Ⅱ荧光强度,上调Beclin 1表达,下调p62表达,升高cleaved caspase 9/caspase 9、Bax/Bcl-2和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值。此外,与TP组相比,3-MA+TP组细胞内LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和cleaved caspase 9/caspase 9比值降低,p...     

自噬参与神经细胞中过表达tau和异常磷酸化tau蛋白的降解

目的观察自噬对神经细胞内源性tau、过表达tau和异常磷酸化tau蛋白水平的影响,探讨不同形式tau蛋白降解的可能机制。方法体外培养小鼠神经瘤母细胞株N2a和敲除Atg5基因的小鼠胚胎成纤维细胞株MEF,分别转染GFP-tau质粒,并用蛋白磷酸酯酶抑制剂冈田酸(okadaic acid,OA)诱导tau蛋白过度磷酸化,自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin)和溶酶体抑制剂氯化铵(NH4Cl)处理细胞,Western blot法检测tau、磷酸化tau以及自噬相关蛋白LC3和p62的表达;放线菌酮(cycloheximide,CHX)示踪法观察tau和磷酸化tau的降解;GFP-tau和RFP-Lamp1质粒共转染N2a细胞,观察tau和溶酶体的定位;免疫荧光染色和DAB染色观察自噬抑制对表达tau细胞形态的影响。结果与溶媒对照组相比,NH4Cl和rapamycin处理组细胞内源性tau蛋白水平无明显变化;过表达tau的细胞中,NH4Cl能增加tau和OA诱导的磷酸化tau蛋白水平,而rapamycin处理组细胞中tau和磷酸化tau水平降低,尤其是高分子量的磷酸化tau寡聚体明显减少;CHX实验证明自噬抑制能减缓tau和磷酸化tau的降解;tau和溶酶体在细胞内存在共定位;过表达tau的N2a细胞经NH4Cl处理后,胞质中出现大量tau聚集体,细胞核变小、固缩甚至消失。结论自噬参与神经细胞中过表达tau和异常磷酸化tau蛋白的降解,抑制自噬能增加tau的细胞毒作用。     

Gadd45g基因对垂体瘤AtT-20细胞的增殖、凋亡和自噬的影响

目的 探讨生长阻滞及DNA损伤诱导基因45g(Gadd45g)过表达及靶向沉默对垂体瘤AtT-20细胞及小鼠原代星型胶质细胞的增殖、凋亡及自噬等影响.方法 构建 Gadd45g 基因的CDS区序列克隆至真核表达质粒 p3XFLAG-Gadd45g及其shRNA真核表达质粒pLKO .1-sh-Gadd45g ,将p3XFLAG-Gadd45g转染至小鼠垂体瘤AtT-20细胞中.其shRNA真核表达质粒pLKO .1-puro-sh-Gadd45g进行慢病毒包装,病毒感染小鼠星形胶质细胞;Western blot检测FLAG-Gadd45g融合蛋白的表达及RT-PCR检测shRNA沉默效率,CCK-8检测细胞增殖活力 ,Western blot检测其对凋亡蛋白、自噬蛋白的影响.结果 Gadd45g及其特异性shRNA真核表达质粒构建成功.构建的p3XFLAG-Gadd45g质粒在垂体瘤AtT-20细胞中能够表达;Gadd45g shRNA具有沉默效率.在垂体瘤AtT-20细胞中过表达Gadd45g ,可明显抑制细胞增殖 ,并能诱导Caspase-3表达,降低Beclin 1表达及LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值(P＜0 .05).与之相反,在原代培养的星形胶质细胞中,shRNA干扰Gadd45g表达,可促进细胞增殖,并降低Caspase-3表达,而增加Beclin 1表达及LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值(P＜0 .05).结论 垂体瘤中Gadd45g的表达缺失可能使得垂体瘤A t T-20细胞凋亡受阻及自噬作用增强 ,从而促进垂体瘤的发生、发展.恢复垂体瘤细胞中Gadd45g的表达及抑制垂体瘤细胞自噬作用有望成为垂体瘤治疗的新方法.     

自噬促进IL-1β诱导的大鼠INS-1胰岛β细胞凋亡

目的观察自噬在IL-1β促进INS-1胰岛β细胞凋亡中的作用。方法体外培养大鼠INS-1胰岛β细胞株,给予不同浓度IL-1β干预,用CCK-8法检测在不同作用时间点INS-1细胞的存活率;用Western blot技术检测不同IL-1β浓度下自噬相关蛋白LC3、Beclin1、P62的表达水平;Western blot法和流式细胞术检测INS-1细胞的凋亡水平。结果 IL-1β可以降低INS-1细胞的存活率,且呈浓度及时间依赖性(P<0.05,P<0.01)。与对照组相比,随着IL-1β浓度的增高,INS-1细胞凋亡水平逐渐升高(P<0.05),且细胞自噬水平也随着IL-1β浓度的增高而逐渐增高(自噬相关蛋白LC3、Beclin1表达上升,P62降低,P<0.05)。采用自噬激动剂雷帕霉素预处理细胞上调自噬可进一步增加IL-1β诱导的细胞凋亡,而用自噬抑制剂3-MA预处理抑制细胞自噬后则可逆转IL-1β诱导的INS-1胰岛细胞凋亡。结论 IL-1β通过诱导自噬增加促进INS-1胰岛β细胞凋亡。     

miR-149-3p调控JNK/p38 MAPK信号通路对髓核细胞凋亡、自噬和炎性反应的影响

目的 探讨miR-149-3p通过调控JNK/p38 MAPK信号通路对髓核细胞凋亡、自噬和炎症反应的影响。方法 体外分离大鼠髓核细胞,用IL-1β浓度为10 ng/ml建立模型组,细胞分为Con组(空白对照)、IL-1β组(IL-1β处理)、IL-1β+miR-NC组(IL-1β处理,转染miR-NC)、IL-1β+miR-149-3p组(IL-1β处理,转染miR-149-3p)、IL-1β+miR-149-3p+Anisomycin组(IL-1β和通路激活剂Anisomycin处理,转染miR-149-3p)。采用qRT-PCR检测miR-149-3p相对表达水平;MTT、流式细胞术实验检测细胞增殖和凋亡;Western blot检测Bax、Bcl-2、Beclin 1、LC3II/LC3I、JNK/p38 MAPK信号通路相关蛋白表达;ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-8表达水平。结果 IL-1β组内miR-149-3p相对表达量、细胞活性、Bcl-2蛋白表达明显低于Con组,凋亡率、Bax、Beclin 1、LC3II/LC3I蛋白表达、TNF-α、IL-6、IL-8...     

HCV Core基因真核表达载体构建及其对HeLa细胞自噬的影响

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白（Core）真核表达载体,并研究其对人宫颈癌 HeLa细胞自噬功能的影响。方法 以 HCV复制子质粒 pJFH1为模板,PCR法扩增 HCV Core 基因片段,经纯化回收后与 PLVX-IRESZsGreen1载体用同源重组法相连,构建 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒,并经测序验证其序列的正确性。转染宫颈癌 HeLa细胞,并设 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒转染组、PLVX-IRES-ZsGreen1空载体转染对照组以及未转染质粒空白对照组,通过免疫印迹法验证 HCV Core蛋白在 HeLa细胞中的表达,并用免疫荧光（IF）和免疫印迹检测自噬生物标记物微管相关蛋白 1轻链 3（LC3）的表达水平。结果 获得 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒,测序结果表明构建的重组质粒序列完全正确,HCV Core重组蛋白可在 HeLa细胞中有效表达;免疫荧光和免疫印迹结果表明,HCV Core过表达细胞 LC3焦点和 LC3 Ⅱ蛋白表达水平明显增多,PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒转染组的细胞 LC3 Ⅱ水平（1.069±0.049）高于 PLVX-IRES-ZsGreen1空载体转染对照组（0.776±0.047）,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 成功构建了 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core 重组质粒,HCV Core 蛋白过表达可诱导 HeLa 细胞自噬。     

SAHA-CTSV轴通过诱导过度自噬抑制乳腺癌MCF-7细胞的生长

目的研究SAHA-CTSV轴通过诱导过度自噬抑制乳腺癌MCF-7细胞生长的作用和机制。方法以人乳腺癌MCF-7细胞为研究目标,Muse细胞分析仪检测SAHA对细胞活力的作用;Real-time PCR和Western blot检测SAHA对CTSV的mRNA及蛋白表达的影响,同时检测利用siRNA干扰技术敲除CTSV后的细胞CTSV表达水平;细胞免疫荧光法检测SAHA对LC3II分子的作用;Real-time PCR和Western blot检测SAHA诱导自噬过程中相关ATG分子和LC3的mRNA和蛋白的变化;Bafilomycin A1抑制自噬,随后利用Western blot和Muse细胞分析仪分别检测p62蛋白水平和SAHA作用后的细胞活力。结果SAHA可以抑制MCF-7细胞的增殖,并促进CTSV的表达。CTSV-siRNA转染细胞后,CTSV的mRNA和蛋白水平均显著性降低。SAHA增加了LC3免疫荧光点的分布,与CTSV-siRNA共同作用可恢复由CTSV-siRNA敲减引起的细胞自噬减弱。SAHA在增强ATG4C和Beclin1表达的同时,LC3B也随之升高而mTOR则下降。抑制CTSV表达后也同时逆转了SAHA的效应。Bafilomycin A1阻断自噬后,被SAHA抑制的p62蛋白的表达和细胞活力显著增强。结论SAHA-CTSV轴通过诱导过度自噬抑制乳腺癌MCF-7细胞的生长。     

乳腺癌组织miR-20a的表达及其对乳腺癌细胞自噬的影响

目的 探究乳腺癌患者肿瘤组织中miR-20a的表达情况及其对乳腺癌细胞自噬功能的作用。 方法 收集芜湖市第一人民医院2016年1月至2017年12月间收治的接受手术治疗的乳腺癌患者56例,逆转录实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测肿瘤组织与癌旁组织miR-20a与自噬相关基因Beclin1、LC3、ATG5及ATG7 mRNA的表达水平。脂质体法转染pcDNA3/pri-miR-20a质粒至MCF7细胞,免疫蛋白印记实验检测Beclin 1与饥饿条件下LC3Ⅱ表达水平,免疫荧光实验检测自噬斑点。 结果 肿瘤组织miR-20a的平均表达水平为211.35±67.43,癌旁组织miR-20a的平均表达水平为126.72±24.37,差异有统计学意义(P<0.05)。此外,肿瘤组织较癌旁组织Beclin1 mRNA表达量降低(P<0.05),ATG5、ATG7与ATG12 mRNA的表达量差异无统计学意义 (P>0.05)。过表达miR-20a后MCF7细胞Beclin1蛋白表达量降低,饥饿刺激下LC3Ⅱ表达水平降低且自噬斑点减少。 结论 乳腺癌组织中miR-20a呈高表达,并且降低自噬调节蛋白Beclin1的表达以抑制自噬活化。     

维生素K_3通过下调mTOR信号途径而诱导HeLa细胞自噬

目的观察VitK3(维生素K3,vitaminK3)对HeLa细胞损伤过程中的自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ表达的影响。方法以HeLa细胞为研究对象,采用MTT检测细胞存活率,用Western blot方法检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ表达的变化和蛋白激酶B(PKB,Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化-Akt/mTOR表达的变化。结果30μmol·L-1剂量以上的VitK3可明显抑制HeLa细胞的增殖(P<0.05)。VitK3作用12h后增加Beclin1和LC3-Ⅱ的蛋白表达水平(P<0.05),降低磷酸化的Akt/mTOR的蛋白表达水平(P<0.05)。结论VitK3能明显抑制HeLa细胞增殖并具有诱导HeLa细胞发生自噬的作用,其机制可能与下调mTOR信号有关。     

MicroRNA-30a-5p靶向Beclin1抑制自噬减轻牛胆酸钠诱导的胰腺泡细胞损伤

目的探究微小型RNA-30a-5p(MicroRNA-30a-5p,miR-30a-5p)对胰腺泡细胞损伤的影响及作用机制。方法不同浓度牛胆酸钠诱导AR42J细胞损伤,取最佳用药浓度,建立胰腺泡损伤模型。细胞分为Control组、Model组、mimic mock组及miR-30a-5p mimic组,牛胆酸钠及miR-30a-5p mimic处理细胞后,RT-PCR检测miR-30a-5p mRNA水平,MTT检测细胞存活,Hoechst检测细胞凋亡,试剂盒检测脂肪酶及淀粉酶活性,ELISA检测多种炎症因子的浓度,免疫印记检测自噬相关蛋白及PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达。生物信息预测miR-30a-5p和Beclin1的靶向关系,通过荧光素酶报告实验验证。pcDNA Beclin1(pc-Beclin1)及miR-30a-5p mimic转染经牛胆酸钠处理的AR42J细胞,检测细胞存活、凋亡、脂肪酶淀粉酶活性、自噬相关蛋白表达及炎症因子浓度。结果 500μmol/L牛胆酸钠处理AR42J细胞。miR-30a-5p mimic可显著提高Model组AR42J细胞中miR-30a-5p的mRNA水平及细胞存活率,降低凋亡细胞百分比、脂肪酶淀粉酶活性及细胞培养上清中炎症因子的浓度。同时,miR-30a-5p mimic可显著降低Model组AR42J细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及Beclin1表达,提高p62、p-P13K、p-Akt及p-mTOR表达。miR-30a-5p mimic显著降低Beclin1wt的荧光酶活性。pc-Beclin1显著上调Beclin1,提高LC3表达,并显著减弱miR-30a-5p mimic对AR42J细胞的促增殖抗凋亡作用及对炎症反应的抑制作用。结论 miR-30a-5p通过靶向下调Beclin1,减轻牛胆酸钠诱导的胰腺泡细胞损伤。     

二甲双胍通过自噬缓解氨诱导的星形胶质细胞老化

目的确定二甲双胍对氨致星形胶质细胞老化的保护作用,并从自噬角度探讨其抗老化机理。方法将星形胶质细胞分为对照组、氯化铵组、二甲双胍(250、500μmol·L~(-1))组。细胞先以二甲双胍预处理30 min,随后加入3 mmol·L~(-1)氯化铵共同作用72 h。以BeyoClick~(TM) EdU-488细胞增殖检测试剂盒检测DNA合成情况;以蛋白质免疫印迹法检测自噬和老化标志蛋白的表达。结果 3 mmol·L~(-1)氯化铵明显增加自噬蛋白LC3II、Beclin1和p62的表达。在Bafilomycin存在的情况下,氨可进一步诱导LC3Ⅱ表达的上调。二甲双胍预处理进一步增加氨诱导的LC3 II上调,但抑制氨诱导的p62增加。二甲双胍预处理缓解氨诱导的星形胶质细胞增殖抑制和p16蛋白的过表达。结论二甲双胍可通过促进细胞自噬缓解氨诱导的星形胶质细胞老化。     

养血安胎方对复发性自然流产小鼠胎盘血管生成与自噬的调控作用研究

目的 探讨养血安胎方治疗复发性自然流产（RSA）的分子机制。方法 构建肾虚血瘀型RSA小鼠模型,养血安胎方干预后收集小鼠胎盘,苏木素伊红（HE）染色、马松（Masson）染色观察小鼠胎盘病理变化、免疫组化法测定小鼠胎盘增殖细胞核抗原（PCNA）、纤维蛋白原（Fibrinogen）及CD34蛋白的表达,Western blot法测定小鼠胎盘血管内皮生长因子（VEGF）、血管内皮细胞生长因子受体2(p-VEGFR2)、p62,Beclin 1,LC3Ⅰ和LC3Ⅱ的蛋白表达,透射电镜观察小鼠胎盘的超微结构。结果 与RSA组比较,RSA+养血安胎组小鼠取材时体重显著增加,胚胎吸收率显著降低;HE染色、Masson染色及PCNA、Fibrinogen蛋白表达显示小鼠胎盘发育状况明显改善,透射电镜结果与p62、Beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白表达显示小鼠胎盘自噬水平明显降低,CD34、VEGFA和p-VEGFR2蛋白表达显示胎盘血管生成明显增加。结论 养血安胎方能够改善RSA小鼠的胎盘发育状况,促进胎盘血管生成,其方式可能与抑制自噬体与溶酶体的融合,从而抑制自噬有关。     

养血安胎方调节自噬治疗复发性自然流产小鼠的机制研究

目的 探讨养血安胎方调节自噬影响胎盘血管生成进而治疗复发性自然流产（RSA）的机制。方法 对妊娠小鼠分别使用雷帕霉素、3-甲基腺嘌呤及养血安胎方进行干预,收集小鼠胎盘,苏木素伊红（HE）染色、马松（Masson）染色观察妊娠小鼠的病理改变,免疫组化法测定增殖细胞核抗原（PCNA）、Fibrinogen及CD34蛋白的表达,Western blot法测定血管内皮生长因子（VEGF）、血管内皮细胞生长因子受体2(p-VEGFR2)、p62、Beclin1、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ蛋白的表达,透射电镜观察胎盘的超微结构。结果 与正常妊娠组比较,雷帕霉素（Rapa）组小鼠取材时体重明显减轻,胚胎吸收率明显增加,HE染色、Masson染色及PCNA与Fibrinogen蛋白表达显示小鼠胎盘发育变差;透射电镜结果与p62、Beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达显示小鼠胎盘自噬水平明显增加;CD34、VEGFA和p-VEGFR2蛋白表达显示胎盘血管生成异常;与Rapa组比较,Rapa+养血安胎组小鼠取材时体重明显增加,胚胎吸收率明显降低,HE染色、Masson染色及PCNA与Fibrinogen蛋白表...