基于Oct4基因启动子活性的高通量药物筛选细胞模型的构建及应用

目的 以人源Oct4基因启动子为靶点构建双荧光素酶报告基因载体,建立高通量药物筛选细胞模型,筛选能显著上调Oct4基因启动子活性的海洋来源微生物次级代谢产物; 方法 将人源Oct4基因启动子序列克隆至萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL6-TA,构建重组质粒pGL6-TA-Oct4-luc并与内参质粒pRL-SV40-C瞬时共转染293T细胞,以OAC1作为激活剂,建立双荧光素酶报告基因筛选系统,通过检测相对荧光素酶表达水平的变化反映Oct4基因启动子活性,对309份海洋来源微生物发酵粗提物样品进行活性筛选;CCK-8法检测粗提物对间充质干细胞活力的影响; 结果 双酶切和基因测序法证实重组质粒构建正确;将质粒转染293T细胞后,与空载pGL6-TA相比较,重组质粒pGL6-TA-Oct4-luc具有显著启动子活性（P＜0.05）;与0 μmol／L相比较,粗提物Z-179-1处理细胞24 h后Oct4基因启动子活性明显升高（P＜0.05）,作用浓度为10 μg/mL时效果最为显著;CCK-8法检测结果显示Z-179-1显著促进间充质干细胞的增殖,且呈剂量依赖性; 结论 成功建立了靶向人源Oct4基因启动子的药物高通量筛选细胞模型,并筛选出海洋来源微生物发酵粗提物Z-179-1能显著活化Oct4基因启动子,其活性成分值得开展进一步化学研究。     

基于双荧光素酶报告基因系统的人源SREBP1基因启动子的活性研究

目的 构建固醇调节元件结合蛋白 1（SREBP1）启动子双荧光素酶报告基因表达载体,为研究针对 SREBP1靶点的天然活性抑制剂筛选奠定基础。方法 利用生物信息学软件,对SREBP1基因5′端上游5 000 bp序 列进行启动子预测与分析。应用 Gibson Assembly 方法构建启动子双荧光素酶载体,并将构建成功的 pGL3- SREBP1-pro重组质粒和内参质粒pRL-SV40共转染肝癌HepG2细胞并给予天然抑制剂大黄素,检测SREBP1转录活 性的抑制效果。结果 SREBP1基因5′端上游2 000 bp区域内有启动子特征序列,存在转录因子结合位点;重组质粒 经酶切及测序鉴定证实为阳性克隆,瞬时转染肝癌HepG2细胞后经双荧光素酶报告基因系统检测,所克隆的片段序 列具有启动子活性,该活性可被大黄素所抑制。结论 成功构建了pGL3-SREBP1-pro双荧光素酶报告基因表达载 体,并证实其活性,可为进一步用于针对SREBP1靶点的天然活性抑制剂筛选奠定     

人中脑星形胶质来源的神经营养因子基因启动子区域的克隆及活性检测

目的克隆人中脑星形胶质来源的神经营养因子MANF(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophie factor)基因的启动子区域,并鉴定其转录活性。方法利用TESS在线软件分析MANF基因上游序列中潜在的顺时作用元件。以HepG2细胞的总基因组为模板,通过PCR反应扩增了MANF基因5'非翻译区1 415 bp片段,并将此片段插入到不含有启动子的pEGFP-1载体中构建了pEGFP-1-MANF-5F重组质粒。用脂质体介导的方法将pEGFP-1-MANF-5F质粒转染到293T细胞,在倒置显微镜下观察绿色荧光的表达。同时,将上述MANF基因5'非翻译区1 415 bp片段插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中,以构建质粒pGL3-MANF-5F,并通过共转染内参质粒pRL-TK到N2 A细胞中,24 h后检测双荧光素酶的表达。结果重组质粒pEGFP-1-MANF-5F转染293T细胞后,在细胞中可见绿色荧光蛋白;pGL3-MANF-5F重组质粒在N2 A细胞中检测到双荧光素酶的活性,且在Tunicamycin诱导时表达明显升高;结论已成功克隆了MANF基因的5'端非翻译区,并证实该区域具有启动子活性,且内质网应激可调节MANF的启动子活性,这为进一步研究MANF基因在疾病中的表达调控机制奠定了基础。     

以人载脂蛋白B为靶点的基因表达下调剂筛选模型的建立与应用

摘要：目的 构建以人ApoB为靶点的基因表达调节剂的高通量筛选模型,筛选apoB基因表达下调剂。方法 以人基因组 DNA为模板,通过PCR扩增apoB基因上游的启动子序列,将扩增的DNA片段克隆至荧光素酶报告基因质粒pGL4.17,采用脂质 体介导的方法将重组质粒转染人肝癌细胞HepG2,经G418抗性筛选,获得稳定转染细胞株。应用槲皮素对筛选模型进行评价, 进而基于检测荧光素酶的表达活性变化筛选人apoB基因表达下调剂。结果 PCR扩增得到人apoB基因上游的启动子序列,构建 完成相应的重组荧光素酶报告基因质粒pGL4-apoB-P,建立了稳定转染细胞株ApoB-Luc HepG2。以槲皮素为阳性化合物进行模 型评价,Z'因子为0.77,符合高通量筛选的要求。应用该模型对5688个微生物发酵液粗提物进行筛选,获得了2株阳性菌株。 结 论 建立了人apoB基因表达下调剂筛选模型,并应用于微生物来源样品的筛选。     

雌激素对载脂蛋白AⅠ基因启动子不同区域转录活性的影响

目的:探讨雌激素对载脂蛋白(Apo)AⅠ基因启动子不同区域转录调节活性的影响。方法:利用含荧光素酶报告基因的表达载体pGL2构建携带ApoAⅠ基因启动子不同区域片段的重组质粒和同时携带ApoCⅢ/AⅣ基因片段的重组质粒。阳离子脂质体法将重组质粒与pRL-null内参质粒共转染HepG2细胞,加入10μmol/L雌激素刺激24h检测细胞荧光素酶报告基因的荧光强度,以反映ApoAⅠ的转录水平。结果:pGL2/-256AⅠ,pGL2/-2500AⅠ,pGL2/-256AⅠCⅢAⅣ及pGL2/-2500AⅠCⅢAⅣ转染后雌激素组荧光素酶相对活性明显高于对照组(P<0.05);而pGL2/-41AⅠ及pGL2/-41AⅠCⅢAⅣ质粒转染后雌激素组与对照组荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论:ApoAⅠ启动子-256~-41区域可能包含与雌激素作用相关的反应元件,受雌激素刺激后转录活性增强。     

三联组氨酸核苷酸结合蛋白2启动子报告基因质粒的构建和活性鉴定

目的 三联组氨酸核苷酸结合蛋白2(Hint2,histidine triad nucleotide binding protein 2)在肝癌组织中低表达并与临床病理分期和病人预后密切相关,为研究Hint2的基因表达调控,构建人Hint2启动子荧光素酶报告基因质粒并鉴定活性.方法 提取人基因组DNA,以其为模板,将含有Hint2启动子的不同长度的片段插入荧光素酶质粒pGL3-basic,后与β-半乳糖苷酶共转染HeLa细胞,转染后24h通过β-半乳糖苷酶实验检测转染效率,通过荧光素酶实验检测转录活性.结果 质粒pGL3-h1(-6--463,457bp),pGL3-h2(-6--1255,1249bp)构建成功后,与 β-半乳糖苷酶共转染人子宫颈癌HeLa细胞.转录活性=荧光素酶值/β-半乳糖苷酶值,结果 显示pGL3-basic荧光素酶值/β-半乳糖苷酶值为147.3272,而pGL3-h1为67936,pGL3-h2为64234.19.空质粒与pGL3-h1,pGL3-h2之间差异具有统计学意义,而pGL3-h1,pGL3-h2之间差异不具有统计学意义.结论 Hint2位于转录起始位点上游-6至--463之间的启动子区域具有强转录活性.     

-514bp及-250bp位点基因多态性对肝脂酶转录活性的影响

目的:探讨同时含肝脂酶(HL)启动子-514 bp和-250 bp多态位点的野生型及变异纯合子型的荧光素酶表达质粒对HL转录活性的影响.方法:PCR法扩增含不同目的基因的DNA片段,将目的基因插入到pUCm-T质粒中,获取含SacⅠ及BglⅡ酶切位点的目的基因,将该基因与含荧光素报告基因的pGL2质粒相连,构建pGL2-HL/-514T+ -250A变异纯合型以及pGL2-HL/-514C+ -250G野生型荧光素酶表达质粒,转染至HepG2细胞内表达,双荧光素酶检测系统检测不同重组质粒荧光素酶报告基因的活性.结果:(1)实验成功构建了同时含HL启动子部位-514/-250位点的野生型和变异纯合型的荧光素酶表达质粒.(2) pGL2-HL/-514T+ -250A变异纯合型的荧光素酶相对表达活性明显低于野生型荧光素酶表达活性(P＜0.01).结论:HL启动子-514及-250位置基因的联合变异可直接影响HL的转录活性.     

小鼠干扰素调节因子3启动子质粒的构建及其启动子活性分析

目的构建包含小鼠干扰素调节因子3(mIRF-3)基因启动子的质粒,并评价其启动子活性。方法以小鼠全血细胞总DNA为模板,PCR扩增mIRF-3目的片段,亚克隆此片段至pGL3-basic荧光素酶报告基因的多克隆位点,构建含mIRF-3启动子的重组报告质粒pmIRF-3。将pmIRF-3、pGL3-basic和pGL3-control质粒分别转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3后,行荧光素酶活性检测,计算相对活性单位(RLU)。生物信息学分析转录因子结合位点。结果成功构建了重组报告质粒pmIRF-3。与pGL3-basic组相比,pmIRF-3、pGL3-control组RLU明显增加(0.443±0.113vs.18.907±3.335、25.704±5.850)(P<0.01)。mIRF-3启动子区域内存在AML-1a、E2F、MZF1、CdxA、OCT-x等多个转录因子结合位点。结论 mIRF-3转录起始位点附近1479bp序列在NIH3T3细胞中具有较强的启动子活性。     

Construction of plasmid containing promoter of mouse interferon regulatory factor 3 and analysis of its promoter activity

目的 构建包含小鼠干扰素调节因子3(mIRF-3)基因启动子的质粒,并评价其启动子活性.方法 以小鼠全血细胞总DNA为模板,PCR扩增mIRF-3目的片段,亚克隆此片段至pGL3-basic荧光素酶报告基因的多克隆位点,构建含mIRF-3启动子的重组报告质粒pmIRF-3.将pmIRF-3、pGL3-basic和pGL3-control质粒分别转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3后,行荧光素酶 活性检测,计算相对活性单位(RLU).生物信息学分析转录因子结合位点.结果 成功构建了重组报告质粒pmIRF-3.与pGL3-basic组相比,pmIRF-3、pGL3-control组RLU明显增加(0.443±0.113vs.18.907±3.335、25.704±5.850) (P＜0.01).mIRF-3启动子区域内存在AML-1a、E2F、MZF1、CdxA、OCT-x等多个转录因子结合位点.结论 mIRF-3转录起始位点附近1479 bp序列在NIH3T3细胞中具有较强的启动子活性.     

载脂蛋白M基因启动子克隆及功能初步研究

目的克隆apoM基因的上游启动子序列,构建启动子不同截短片段的荧光素酶报告基因,并观察其不同截短片段的启动子活性,为进一步研究apoM基因的表达调控机制奠定基础。方法在对apoM基因生物信息分析的基础上,采用5’RACE确定了apoM基因的转录起始点,构建了6种不同长度apoM基因启动子序列的荧光素酶报告基因表达质粒pGL3-Basic(A-F),将它们瞬时转染HepG2细胞,并检测其荧光素酶活性。结果 pGL3-Basic-C的荧光素酶活性最高。结论 -401～-621bp可能是apoM的核心启动子区。