真核表达质粒pEGFP-N1-Bex2的构建及其在U251细胞中的表达

目的 构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒,并探索其在U251神经胶质瘤细胞中的表达.方法 以正常人脑组织总RNA为模板,采用RT-PCR法获得Bex2的cDNA,并与pEGFP-N1载体连接,构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒.对pEGFP-N1-Bex2重组质粒的菌液行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定.在U251细胞中用脂质体转染法转染pEGFP-N1-Bex2真核表达载体过表达Bex2,分别于转染后12、24、48、72 h收集细胞,用Western blot检测Bex2基因的表达情况.结果 真核表达质粒pEGFP-N1-Bex2经PCR及双酶切鉴定,均可见387 bp的目的基因条带,并单倍正向克隆至质粒中.转染质粒pEGFP-N1-Bex2后荧光显微镜下观察U251细胞内有绿色荧光蛋白表达,Western blot检测见47 KD和26 KD分别有清晰的外源性Bex2-GFP融合蛋白和GFP蛋白的表达.pEGFP-N1-Bex2在转染U251细胞后12h即有表达,48 h达到高峰.结论 成功构建pEGFP-N1-Bex2真核表达质粒,瞬时转染后在U251细胞中顺利表达.     

FAM3B基因cDNA克隆及其在胃癌细胞系BGC-823的表达

目的克隆FAM3B cDNA,构建FAM3B重组表达载体并在胃癌细胞系BGC-823中表达,观察其对细胞系的影响,探索新的肿瘤治疗途径。方法构建pEGFP-N2-FAM3B真核表达质粒,将pEGFP-N2-FAM3B转染人胃癌细胞系BGC-823,研究其对胃癌细胞产生的作用。结果重组pEGFP-N2-FAM3B真核表达质粒构建成功,经pEGFP-N2-FAM3B转染后,荧光显微镜下可见转染的BGC-823细胞有绿色荧光蛋白的表达,转染后的BGC-823细胞生长减慢。结论构建完成真核表达载体pEGFP-N2-FAM3B,重组pEGFP-N2-FAM3B质粒在胃癌细胞系BGC-823细胞内成功表达。     

脂质体介导的肝细胞生长因子基因在脐静脉内皮细胞中的表达与鉴定

目的构建含肝细胞生长因子(HGF)基因真核表达载体pEGFP-N1-HGF,观察HGF基因在人脐静脉内皮细胞中的表达。方法由重组质粒pRc/CMV-HGF中扩增出HGF基因,将其克隆到含增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-N1中,应用脂质体将重组质粒pEGFP-N1-HGF转染到人脐静脉细胞株ECV304中,G418筛选获得稳定表达克隆,采用荧光显微镜观察、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫细胞化学方法鉴定。结果经G418筛选后可形成抗性细胞克隆;荧光显微镜下观察到有绿色荧光;RT-PCR能扩增出HGFmRNA预期的699bp片段;免疫细胞化学证实转染HGF基因的细胞有HGF蛋白的表达。结论重组质粒pEGFP-N1-HGF能够在细胞株ECV304转录、表达。     

组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体的构建和鉴定

目的利用pEGFP-N1真核表达载体构建组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体pEGFP-Hdac3,并鉴定其在大鼠肝癌细胞系CBRH-7919中的表达。方法利用大鼠肝脏cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)获取目的基因Hdac3;用HindⅢ、BamH I双酶切真核表达载体pEGFP-N1和目的基因Hdac3,用T4 DNA连接酶连接纯化后的酶切产物;连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆,并通过PCR、双酶切、DNA测序鉴定构建的重组质粒。利用测序正确的重组体转染CBRH-7919细胞,检测Hdac3和PPAR-γ的mRNA表达。结果利用基因克隆技术获得组蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3重组质粒。PCR,双酶切,DNA测序证实目的基因H-dac3已成功插入pEGFP载体中。用重组质粒转染大鼠肝癌细胞系CBRH-7919后Hdac3 mRNA表达显著升高、而PPAR-γmRNA表达明显降低。结论本研究成功构建了蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3。     

人胰岛素样生长因子Ⅰ基因对兔关节软骨细胞的有效转染及表达

目的 研究人胰岛素样生长因子Ⅰ(hIGF-Ⅰ)基因构建的真核表达载体质粒对兔关节软骨细胞的有效转染和表达.方法 将hIGF-Ⅰ基因构建在pcDNA 3.1质粒上,经FuGENE 6介导转入兔关节软骨细胞;设未转hIGF-Ⅰ基因软骨细胞作对照.转染后第3天用RT-PCR技术检测hIGF-Ⅰ、Ⅱ型胶原和聚合素在mRNA水平的表达,用细胞爬片免疫组织化学和Western blot测定hIGF-Ⅰ在蛋白水平的表达.结果 RT-PCR显示hIGF-Ⅰ在转染组中琼脂糖电泳318 bp处见到相应的目的 条带,而对照组未出现目的 条带;Ⅱ型胶原和聚合素在转染和对照组中以β-actin为参照半定量检测分别增加到1.3倍和1.4倍(P<0.05).免疫组织化学显示转染组细胞爬片有hIGF-Ⅰ表达的棕黄色颗粒,对照组胞浆中未见棕黄色颗粒,转染组胞浆中出现大量的Ⅱ型胶原棕黄色颗粒.Western blot显示转染组细胞在7.6 KDa标记处有hIGF-Ⅰ的蛋白条带出现对照组则没有.结论 FuGENE 6介导的重组hIGF-Ⅰ基因真核表达载体质粒可有效转染兔关节软骨细胞,在mRNA和蛋白水平上有效表达hIGF-Ⅰ及Ⅱ型胶原,表达的hIGF-Ⅰ能在mRNA水平上增加Ⅱ型胶原和聚合素的合成,保持软骨细胞表型的稳定.     

天然型网孔羟基磷灰石复合BMP基因质粒直接盖髓的实验研究

目的观察以质粒为BMP基因转移载体以羟基磷灰石为支架的缓释系统(HAP-BMPcDNA)促进修复性牙本质形成的情况。方法将编码骨形成蛋白的cDNA克隆至真核表达质粒,然后将其与网孔羟基磷灰石复合导植到狗牙露髓处,同时用BMP组和氢氧化钙组做实验对照,进行组织学观察。结果HAP-BMPcDNA组可有效促进修复性牙本质的形成,效果明显优于BMP组和氢氧化钙组。结论质粒为BMP基因转移载体羟基磷灰石为支架的缓释系统(HAP-BMPcDNA)作用于促进修复性牙本质(reparative dentinogenesis.RD)形成的方法,不仅可有效增强牙齿露髓时RD的形成、克服在露髓处单纯放置BMP不能为成牙本质细胞样细胞提供足够刺激的不足;而且还可避免因用重组病毒作为载体可能诱发牙髓组织免疫损伤的发生。     

Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白 ROP16的基因克隆表达及生物信息学分析

目的：构建弓形虫Chinese 1基因型TgCtWh3（以后均简称Wh3）株棒状体蛋白（ rhoptry protein ,ROPs）16的原核和真核重组表达质粒及其3D结构。方法参照ROP16序列分别设计引物,采用PCR从弓形虫Chinese 1基因型Wh3株基因组DNA中扩增出编码ROP16的基因片段,克隆至pMD18-T载体;经PCR及测序分析鉴定;阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2,分别转化大肠杆菌BL21和DH5α,PCR和酶切鉴定转化菌落插入的序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达;将构建的真核重组质粒经脂质体转染293T细胞,观察其在细胞中表达;采用生物信息学方法分析构建了蛋白的3 D结构。结果各组均PCR扩增出约2．1 kb ROP16基因的特异片段,序列检测结果均正确;分别亚克隆到原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2中,成功构建了Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白ROP16的原核表达质粒和真核表达质粒;原核表达质粒在大肠杆菌中表达了ROP16的融合蛋白;真核表达质粒在293T细胞中成功表达,成功构建出ROP16基因的3D结构图。结论以pET-28a和pEGFP-C2为载体,分别成功构建并表达了ROP16的原核和真核重组质粒,并构建出其3D结构图。     

BMP2重组慢病毒转染兔BMSCs后细胞矿化的实验研究

目的 探讨骨形态发生蛋白2(BMP2)重组慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化后细胞矿化的能力。方法 密度梯度离心及贴壁培养法获取第5代兔BMSCs，流式细胞仪检测细胞表面标记。将BMSCs分为空白对照组(未转染)、Lv-EGFP组[转染仅携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒]和Lv-BMP2/EGFP组(转染携带BMP2和EGFP基因的慢病毒)。免疫组织化学染色、RT-PCR、Western blot检测BMP2蛋白和基因表达情况；SP法检测Ⅰ型胶原蛋白表达；茜素红染色法检测矿化结节形成；于转染第7、14、21天检测细胞碱性磷酸酶(ALP)水平；通过扫描电镜和能谱分析进一步观测矿化结节表面微观形貌及其主要元素构成。结果 流式细胞仪检测显示第5代BMSCs的细胞表面CD44、CD29表达呈阳性，CD45表达呈阴性；免疫组织化学染色、RT-PCR、Western blot显示Lv-BMP2/EGFP组较Lv-EGFP组及空白对照组能高效表达BMP2目的蛋白和基因，转染第7、14、21天ALP水平较其余2组升高，Ⅰ型胶原染色及茜素红染色均呈阳性，扫描电镜下见矿化结节散...     

Notch1(NICD)过表达真核载体构建及对大鼠BMSCs增殖分化的影响

目的 构建Notch1(NICD)过表达真核载体,探讨其对大鼠骨髓间充质干细胞（bone mesenehymal stem cells,BMSCs）增殖分化的影响。方法 以大鼠BMSCs为研究对象,构建Notch1(NICD)过表达真核载体,将pEGFP-N1-NICD质粒转染BMSCs,实验分为空白对照CON组、空载体组和转染组,转染48h后观察细胞一般形态,Realtime PCR和Western blotting检测NSE、GFAP 和Notch1基因和蛋白表达,流式检测转染后细胞凋亡和细胞周期情况;MTT检测增殖情况。结果 经DNA测序结果,重组质粒pEGFP-N1-NICD编码序列与设计完全一致,转染48h后转染组和空载体组的BMSCs均可表达绿色荧光。转染组Notch1、GFAP基因相对表达量显著高于空载体组和CON组（P＜0.05）,Western blotting检测结果与之类似。转染48h后,转染组活细胞比率及早期凋亡率、晚期凋亡率与CON组和空载体组比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）;空载体组与CON组晚期凋亡率比较差异具有统计学意义（P＜0.05）,转染组细胞处于G1/G0细胞比例显著高于CON组和空载体组（P＜0.01）,而处于S和G2/M期细胞比例显著低于CON组和空载体组（P＜0.01）,转染组增殖曲线值随时间逐渐低于CON组和空载体组,到第4d时显著低于CON组和空载体组（P＜0.05）。结论Notch1(NICD)过表达真核载体构建成功,高表达Notch1(NICD)基因可能在一定程度上诱导BMSCs凋亡、抑制其增殖,且表现诱导向神经胶质样细胞分化。     

ADAM28基因对人牙囊细胞生物学特性的影响

目的探讨ADAM28基因对人牙囊细胞(HDFC)增殖、分化等生物学特性的影响及可能的作用机制。方法应用基因重组技术、细胞培养、基因转染、四唑盐比色法(MTT)、流式细胞术(FCM)和酶动力学方法探讨ADAM28基因对HDFC生物学特性的影响。结果成功构建并转染ADAM28真核质粒,系列检测显示:真核质粒转染组HDFC的增殖活性、增殖指数、ALP分泌活性明显高于空载体组及未转染组(P<0.01)。结论ADAM28可显著促进HDFC的增殖和ALP的分泌,并可能同时激活Notch信号途径,参与调控HDFC的增殖、分化和矿化。     

FABP3基因荧光载体构建及其蛋白的亚细胞定位

目的构建脂肪酸结合蛋白3(FABP3)基因的荧光表达载体FABP3-pEGFP-N2,并应用绿荧光融合蛋白技术检测FABP3蛋白的亚细胞定位。方法 RT-PCR法获得FABP3基因编码框,克隆到pEGFP-N2载体中,利用脂质体将构建的表达载体转染P19细胞后,荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察细胞内FABP3蛋白定位。结果成功克隆FABP3基因片段,并将其重组到pEGFP-N2载体中。荧光显微镜和激光共聚焦显微镜显示,FABP3蛋白主要分布于P19细胞的胞浆和胞核中。结论成功构建了FABP3-pEGFP-N2真核表达载体,FABP3在P19细胞的胞浆和胞核中呈弥漫分布特点。     

含绿色荧光蛋白及人胰岛素基因的真核表达载体的构建

目的构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因与人胰岛素基因的重组真核表达载体。方法将人胰岛素基因插入到真核表达载体pIRES2-EGFP的EcoRⅠ和BamHⅠ位点中,构建重组质粒pIRES2-EGFP-INS。酶切鉴定,测序证实。结果重组真核表达载体pIRES2-EGFP-INS经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,电泳后显示360bp的INS的目的片段和5.3kb的pIRES2-EGFP载体片段,进一步测序并证明重组质粒连接正确。结论成功构建了pIRES2-EGFP-INS重组质粒,为简便快速了解胰岛素基因的转染效率奠定了基础。     

真核表达载体pEGFP-N1-kin17的构建及其在Zmpste24-/-小鼠胚胎成纤维细胞内的表达

目的：构建人kin17基因真核表达载体pEGFP-N1-kin17,将载体转染至野生型及Zmpste24基因缺失的小鼠胚胎成纤维上皮细胞,荧光显微镜观察kin17蛋白表达情况。方法用高保真DNA 聚合酶,从pCMV-kin17载体中扩增获取人kin17 cDNA编码序列,将其克隆至pEGFP-N1载体中,经酶切、连接、转化后,挑取阳性克隆进行菌液进行PCR、菌液质粒双酶切及测序鉴定;将成功构建的GFP-kin17表达载体转染Zmpste24-/- MEFs,荧光显微镜观察kin17蛋白的核定位情况。结果 pEGFP-N1-kin17转化细菌克隆测序结果完全正确;将载体转入MEFs后,可以通过荧光显微镜观察到kin17蛋白的表达。结论成功构建GFP融合的kin17真核表达载体,该载体为kin17蛋白的研究提供工具。本实验中载体pEGFP-N1-kin17在野生型和Zmpste24-/- MEFs中均成功表达。     

重组大鼠pEGFP-N1-IGF-1基因表达质粒的构建

目的构建胰岛素样生长因子1基因的真核表达质粒(pEGFP-N1IGF-1),为基因治疗脊髓损伤(SCI)提供前提。方法应用反转录聚合酶链反应(RTPCR)方法从大鼠肝脏组织总RNA中提取并扩增胰岛素样生长因子1(IGF1)基因的全长cDNA,并将该基因连接克隆到含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体pEGFPN1上,以构建重组质粒pEGFPN1IGF1。结果实验从大鼠肝脏组织中提取总RNA,以RTPCR方法获取编码IGF1基因的全序列cDNA。构建IGF1cDNA真核表达质粒时将能发出绿色荧光的EGFP报告基因融合在IGF1基因,并经酶切后DNA电泳鉴定及DNA测序证实结果。结论构建重组质粒pEGFPN1IGF1成功,实验中将能发出绿色荧光的EGFP报告基因融合在IGF1基因的3′端,并以编码柔软肽段的核苷酸连接,既保留了IGF1的神经营养活性,又便于基因治疗中可检测到蛋白表达。     

pEGFP-N1-PEDF重组质粒的构建和鉴定

目的：构建 pEGFP-N1-PEDF真核表达质粒,并进行鉴定。方法利用RT-PCR方法从组织中提取PEDF的基因片段,与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-PEDF重组质粒,酶切后与pEGFP-N1真核表达载体连接,构建pEGFP-N1-PEDF真核表达质粒,进行测序、酶切鉴定,表明质粒构建成功。结果本实验成功构建了pEGFP-N1-PEDF真核表达质粒。结论为进一步研究利用PEDF基因治疗皮肤肿瘤提供实验基础。     

基因1b型不同准种株HCV核心蛋白真核表达质粒的构建及表达

目的 构建基因1b型丙型肝炎病毒(HCV)不同准种株截短片段核心蛋白(CP)绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白表达质粒.方法 用聚合酶链反应(PCR)扩增获得等长度片段的CP基因:氨基酸(aa)长度为癌中心株(T)∶T∶1-172 aa、癌旁株(NT)∶1-172 aa及C191(HCV-J6)∶1-172 aa,扩增产物用Nhe I及EcoR I双酶切后将其插入到真核表达质粒pEGFP-N1中,转染不同细胞系,用荧光显微镜及流式细胞仪观察GFP的表达.结果 PCR扩增、序列分析验证,T、NT及C191截短片段CP基因均成功克隆到pEGFP-N1中,在转染HepG2、chang-liver 48h后,用荧光显微镜及流式细胞仪均观察到GFP的表达.结论 构建基因1b型HCV不同准种株截短片段CP的真核表达质粒获得成功,可用于不同准种株CP的功能研究.