稻黑孢霉A8及其诱导的人工沉香次生代谢产物分析

目的:分析稻黑孢霉(Nigrospora oryzae)A8及其诱导的人工沉香次生代谢产物。方法:三氯甲烷萃取白木香内生真菌及其诱导的人工沉香,气相-质谱联用法(GC-MS)分析代谢产物,自动质谱退卷积定性系统(AMDIS)结合保留指数(RI)法鉴定挥发性成分。结果:N.oryzae A8发酵液共检出58个色谱峰,鉴定其中30种化合物,检出相对含量最高的化合物是β-苯乙醇;N.oryzae A8人工诱导白木香生产的3批沉香药材共鉴定出38种化合物,主要为倍半萜类、芳香族类、2-(2-苯乙基)色酮类等沉香特征性成分。结论:N.oryzae A8发酵液可高效诱导白木香结香,其次生代谢产物可能参与沉香形成过程。     

真菌诱导白木香产生沉香的野外实验与分析

 目的 采用野外小规模实验和室内分析相结合的方法验证3株真菌YNAS04、YNAS06和YNAS08诱导白木香产生沉香的可行性。方法 采用真菌诱导法诱导白木香产生沉香,利用气相-质谱联用技术（GC-MS）对诱导结香材料挥发油成分中的化合物进行检测,通过比对诱导材料高频菌与原接入菌的形态及核糖体基因内部转录间隔区序列（internal transcribed spacer,ITS）一致性来验证接入菌的有效性。结果 3株真菌定植于白木香6个月,YNAS04、YNAS06和YNAS08诱导产生材料的重量分别为（1.786±0.473）,（2.964±0.492）和（3.615±0.591） g,高于空白对照（1.325±0.407） g和阴性对照（1.462±0.417） g。GC-MS检测到3株活性真菌诱导材料含有代表沉香品质的主要化学成分倍半萜类化合物和色原酮类似物。菌种验证结果表明,3株活性真菌在诱导材料中为优势菌,分别占分离菌种的90.0%,97.5%和91.25%。结论 利用3株活性真菌诱导白木香产生沉香可以应用于实际生产,是可持续、高效生产沉香的良好方法。     

白木香中色酮类化合物的形成

瑞香科植物白木香是我国生产沉香的唯一植物资源。沉香是我国、日本、印度及其它东南亚国家的传统名贵药材和天然香料。沉香是由于白木香木材组织受伤或感染真菌后形成的。 1 976年 ,华南植物研究所发现黄绿墨耳真菌感染白木香木材伤口后能加速沉香的形成 [1]。在沉香中存在两种主要的成分 ,倍半萜类化合物和色酮类化合物。沉香的品质主要由这两类化合物决定。本文采用 HPLC法检测色酮类化合物 ,探讨白木香受真菌感染后 ,色酮类化合物的形成规律 ,为进一步研究色酮类化合物在白木香中的生物合成提供理论依据。并为评价沉香药材的品质提供…     

筛选诱导白木香产生沉香的真菌的研究

 目的 筛选诱导白木香产生沉香的活性真菌。 方法 野外条件下用真菌接种白木香,利用光学显微镜和扫描电子显微镜分别观察真菌诱导白木香树产生沉香过程中的真菌侵染、定植、真菌与植物的互作情况;用GC-MS检测诱导产生沉香材料中挥发油的主要成分。结果 筛选到三株具有诱导白木香产生沉香的活性真菌,这些真菌的诱导效果尚属首次报道。真菌菌丝能够侵入白木香组织细胞,诱导白木香产生的沉香与天然沉香的化学成分类似。结论 利用本实验得到的3株真菌诱导白木香结香具有重要的理论意义和实际应用价值。
     

氯化钠诱导白木香悬浮细胞合成苯乙基色酮类成分的LC-MS分析

采用超高效液相色谱-串联四极杆静电场轨道阱质谱(UPLC-Q-Exactive-MS)结合超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱(UPLC-QQQ-MS/MS)对氯化钠诱导的白木香悬浮细胞中苯乙基色酮类成分进行定性和定量分析。UPLC-Q-Exactive-MS和UPLC-QQQ-MS/MS均采用Waters T3色谱柱(2.1 mm×50 mm, 1.8μm),以0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相分别进行梯度洗脱色谱分离,质谱分析均采用电喷雾正离子模式采集。利用UPLC-Q-Exactive-MS从氯化钠诱导的白木香悬浮细胞样品中鉴定出苯乙基色酮类化合物47个,其中简单苯乙基色酮及其苷22个、四羟基四氢苯乙基色酮10个、三元氧环四氢苯乙基色酮15个。通过UPLC-QQQ-MS/MS技术对氯化钠诱导处理后白木香悬浮细胞中25个苯乙基色酮进行了定量。通过2种液质联用技术快速、高效地对氯化钠诱导白木香悬浮细胞中苯乙基色酮类成分进行定性、定量分析,为利用体外培养等生物技术制备沉香中主要的药效和香味物质苯乙基色酮提供重要参考。     

可可毛色二孢菌对白木香产生倍半萜诱导作用

为了明确可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae对白木香产生倍半萜的诱导作用。采用气质联用（GC-MS）对可可毛色二孢菌PDA发酵液进行检测,发酵液中检测到茉莉酸类化合物（jasmonates,JAs）。利用固相微萃取-气质联用（SPME-GC-MS）检测发酵液处理后白木香愈伤中沉香倍半萜成分,发现其能够诱导白木香愈伤产生α-愈创木烯（α-guaiene）,δ-愈创木烯（δ-guaiene）,α-蛇麻烯（α-humulene）3种沉香倍半萜。推测可可毛色二孢菌可产生茉莉酸类物质,其作为伤害信号分子诱导白木香产生倍半萜。     

厚叶沉香与白木香生药学特征对比研究

目的:对厚叶沉香进行系统的生药学特征研究并与白木香的生药学特征进行对比。方法:采用植物形态鉴别、性状鉴别、显微鉴别等方法(撕片、徒手切片、石蜡切片)研究厚叶沉香与白木香的生药学特征。结果:1.厚叶沉香每朵花序上的小花数明显少于白木香,且小花花梗较白木香短,厚叶沉香花序有苞片1,白木香无;厚叶沉香的果实圆润而短,白木香果实尖而长。2.在显微鉴别特征方面的区别主要在小枝粉末显微中,(1)白木香小枝中含有多细胞非腺毛与单细胞非腺毛,而厚叶沉香中只含有单细胞非腺毛;(2)纤维纹孔上,厚叶沉香小枝粉末具三角形及圆形纹孔,白木香具半圆形及圆形纹孔。3.药材方面,厚叶沉香油脂部分偏黑色且有油亮;而白木香油脂部分色灰黄。结论:该研究可为厚叶沉香的品种鉴别、生药学研究及进一步开发利用提供一定的参考。     

白木香枝枯病病原菌的鉴定

目的:明确白木香枝枯病的病原菌,确定其是否能够诱导白木香产生沉香.方法:通过形态特征观察、rDNA-ITS序列测定分析、柯赫氏法则验证确定病原菌及其分类地位.结果:分析结果表明,侵染白木香Aquilaria sinensis的病原菌为可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae,该菌可诱导沉香产生.结论:首次明确白木香枝枯病的病原菌为可可毛色二孢,为利用真菌诱导白木香结香研究提供理论基础.     

3种不同方法形成的沉香药材色酮含量测定

目的建立沉香药材中色酮类成分含量测定方法,考察不同白木香结香方法的药材质量,为评价沉香质量提供实验依据。方法采用可见分光光度法(VS)以磷钨酸钼-硫酸锂为显色剂,以Aquilarone E色酮作为对照品溶液,在760 nm波长下测定沉香药材试液中沉香总色酮的含量。HPLC法测定沉香5种色酮含量,采用Waters Symmetry Shield C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水(B),流速1m L·min-1,检测波长为252 nm,柱温30℃。结果所建立的可见分光光度法在5 h内稳定性良好,加样回收率为96.71%(RSD=2.12%)。HPLC法测定5种色酮含量在进样量0.1432~7.16、0.00884~0.442、0.01536~0.768、0.01264~0.632、0.0154~0.77μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。5种色酮平均加样回收率分别为96.98%、97.19%、96.19%、96.52%及95.69%。不同批次沉香含量差异显著,与自然结香组(对照)比较,差异有统计学意义(P0.05,P0.01),人工诱导组白木香的结香质量优于传统火烫法,与结香周期较长的自然结香组相近。结论两种检测方法均简便、快速、准确,重复性好,可用于沉香中色酮类成分含量测定。人工诱导白木香快速结香可作为进一步开发利用其资源的重要方法。     

生物诱导法所产不同部位沉香挥发油成分分析

目的评价生物诱导法刺激白木香所产不同部位沉香质量。方法以乙醚冷浸法对提取诱导6个月后所得沉香挥发油,采用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对其挥发油进行分析。结果共鉴定出159个成分,包括白木香木质部外侧黑色结香部分(B部分)86个成分,内侧棕色初结香部分(Z部分)73个成分;B部分以色酮类、芳香族类、倍半萜类等沉香特征性成分为主,Z部分以直链烷烃类为主。结论生物诱导法首先影响到的木质部外层(B部位)已含有丰富的沉香特征性成分,而后期影响到的木质部内层(Z部分)鲜见沉香特征性成分,说明该法是从外及内逐步影响白木香木质部,所形成的沉香质量也有显著差异。     

白木香AOX基因特征及其对伤害胁迫的响应

白木香Aquilaria sinensis是典型的诱导型药用植物,只有在伤害胁迫下才能产生名贵南药沉香,前期研究表明,伤害可刺激信号分子H2O2爆发,进而诱导白木香产生沉香类物质,但其代谢和调控机制还不清楚。交替氧化酶(alternative oxidase,AOX)是植物交替呼吸途径的末端氧化酶,在抗氧化胁迫过程中起着重要的作用。为了揭示AOX基因在伤害胁迫诱导白木香结香过程中的生理功能,该文在转录组数据的基础上,对白木香中AOX基因进行克隆和鉴定,同时利用qRT-PCR技术检测AOX基因在不同组织和伤害胁迫下的表达特性。该文首次从白木香中克隆获得了3个AOX基因,分别为AsAOX1a,AsAOX1d,AsAOX2,其中AsAOX1a主要在茎和种子中表达,AsAOX1d,AsAOX2基因主要在果肉和茎中表达;这3个基因都受切割伤害的诱导,其中AsAOX1a,AsAOX2在1 h时达到最高表达水平,AsAOX1d在24 h时达到最高表达水平。此外H2O2处理对伤害诱导AsAOX1a,AsAOX2的表达具有一定的抑制作用,而AsA处理对其有明显的促进作用。研究结果为揭示AOX基因在伤害诱导白木香形成沉香过程中的作用,进一步解析AOX基因与H2O2信号分子之间的关系提供了基础数据。     

白木香内生真菌的分离鉴定及诱导结香作用研究

目的 分离、纯化经通体结香技术诱导的白木香木质部真菌,筛选能够高效促进白木香产生优质沉香的菌株。方法 采用组织块分离法分离、纯化菌株,通过形态学特征结合内转录间隔区（ITS）序列分析鉴定真菌;将真菌菌液接种到白木香树4个月后进行功能验证;依据《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版沉香项下薄层色谱、浸出物含量测定、沉香四醇含量测定及特征图谱方法分析菌株诱导效果。结果 从白木香木质部中分离出48株真菌,优势菌株为镰刀菌;经刺盘孢菌属（Colletotrichum sp.）、黑曲霉Aspergillus niger、渐进绿木霉Trichoderma paraviridescens诱导的沉香薄层色谱斑点与对照药材一致;经镰刀菌属（Fusarium sp.）、黑曲霉、渐进绿木霉诱导的沉香浸出物质量分数均大于10%,与对照组差异有统计学意义（P<0.05）;经可可毛二孢菌Lasiodiplodia theobromae、黑曲霉、渐进绿木霉等6株菌诱导的沉香特征图谱与对照药材一致,沉香四醇质量分数均大于0.1%,与对照组差异有统计学意义（P<0.05）。结论 从白木香木质部分离出的内生真菌可诱导沉香形成,其中黑曲霉和渐进绿木霉能够较快速诱导白木香结香,结香所得的树脂品质符合《中国药典》2020年版标准。     

结香与未结香白木香内生细菌群落结构及变化

研究采用不依赖培养方法T-RFLP,比较结香和非结香的白木香内生细菌的群落结构及变化,研究发现结香后内生细菌的T-RFs、香农多样性指数有增加的趋势,各样品间差异的T-RFs片段数占总T-RFs片段数60%以上,说明结香前后白木香内生细菌的种类发生显著变化。在非结香样品中,内生细菌的优势菌群是Anoxybacillus, Clostridium, Candidatus endobugula, Lysinibacillus,结香样品中内生细菌的优势菌群为Clostridium,Lysinibacillus,Luteimonas,phytoplasma。另外,在结香和非结香样品中都出现一些特异的T-RFs片段,这些明显的变化使得样品聚类分析时,结香样品内生细菌群落结构相似性比较高聚在一起,非结香样品聚在一起,说明结香前后白木香内生细菌发生显著的、有规律的变化。研究旨在利用不依赖培养的方法首次探讨白木香内生细菌的群落结构及结香中的变化,为合理利用白木香内生细菌资源提供科学依据。     

结合非靶向代谢组学和指纹图谱对通体结香技术产沉香与野生沉香化学成分的比较分析

目的 系统全面分析比较通体结香技术产沉香（简称通体香）与野生沉香化学成分,为通体结香技术进一步的应用和推广提供科学可靠的依据。方法 采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱（UPLC-Q/TOF-MS）和气相色谱-质谱（GC-MS）结合非靶向代谢组学和指纹图谱,对通体香与野生沉香的乙醇提取物和挥发性成分进行分析。结果 16批通体香与16批野生沉香的共有成分相同,但通体香指纹图谱相似度较高,且4个倍半萜、3个小分子芳香物质和8个2-(2-苯乙基)色酮等共17个共有成分在通体香中含量较高。结论 通体香和野生沉香主要化学成分组成相同,但不同批次间通体香的质量更稳定。     

Temporal characteristics of agarwood formation in Aquilaria sinensis after applying whole-tree agarwood-inducing technique

Objective: Agarwood—a resinous wood produced by Aquilaria plants in response to injury or artificial induction—is a valuable medicinal and fragrance resource. Whole-Tree Agarwood-Inducing Technique (Agar-WIT) has been widely used to produce agarwood. However, the time-dependent characteristics of agarwood formation induced by Agar-WIT are yet to be clarified. To promote technologically efficient utilization and upgradation of Agar-WIT, the dynamic process and mechanism of agarwood formation were analyzed for one year. Methods: Agarwood formation percentage, barrier layer microscopic properties, extract levels, compound level, and characteristic chromatograms of agarwood were examined by referring to the Chinese Pharmacopeia (2020 version). Results: Agar-WIT could maintain a high percentage of agarwood formation over one year compared with that of healthy plants. Alcohol-soluble extract and agarotetrol levels showed fluctuating cyclic changes with peaks occurring first during the fifth and sixth months, and subsequently in the 11th month. Aquilaria trees subjected to Agar-WIT treatment for 1?12 months showed significant characteristics of a dynamic agarwood formation process. The barrier layer began to appear in the fourth month after treatment. Alcohol-soluble extractive levels in agarwood formed in the second month, and thereafter, exceeded 10.0%, and agarotetrol in agarwood produced after four months or later, exceeded 0.10%. Conclusion: According to the Chinese Pharmacopoeia, alcohol-soluble extractive levels in agarwood should not be less than 10.0% and agarotetrol level should exceed 0.10%. After four months of Agar-WIT treatment, the formed agarwood theoretically met these standards and was suitable for developed and utilization. However, the optimal harvest time was found to be the 11th month, followed by the sixth month after Agar-WIT treatment. Therefore, Agar-WIT resulted in swift agarwood formation and stable accumulation of alcohol-soluble extracts and agarotetrol. Thus, this method is efficient for large-scale cultivation of Aquilaria sinensis to produce agarwood and provide raw materials for the agarwood medicinal industry.     

A Review of Quality Assessment and Grading for Agarwood

Agarwood is an important non-timber forest product widely used in religious and cultural activities as perfume and fragrance and as traditional medicine in Asia. The high value of agarwood and the inflated consuming market have led to constant rising of the prices. In general, the price of the agarwood is determined according to its quality, which can be divided into different grades. But up to now, there is not any standard quality grading system which could be used overwhelmingly throughout the agarwood producing, commerce and consumption. Therefore, we reviewed agarwood in diversified grading indexes, systems and methods.     

通体结香技术处理30 d产沉香的品质监测

目的：研究通体结香技术诱导沉香形成的作用过程。方法：根据《中华人民共和国药典》 2020年版沉香质量标准,对通体结香技术处理30 d内产生的沉香样品进行性状、沉香四醇质量分数、结香面积比率、特征图谱分析,并对部分特征型倍半萜类和芳香类化合物进行含量测定。结果：通体结香技术处理白木香第4～5天,木间韧皮部和射线细胞出现树脂类物质,形成环形沉香层,沉香结香率由4.31%急剧上升至8.11%。结香30 d可形成明显的沉香层结构,薄层色谱和特征图谱结果与对照药材一致。沉香四醇质量分数在结香30 d内由0.001%增长至0.034%,整体呈上升趋势。部分芳香类化合物和沉香特征性倍半萜类化合物分别在第1～8天和第9～16天开始产生并累积。结论：通体结香技术处理30 d能够诱导沉香快速形成和稳定积累。     

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??OBJECTIVE To explore the expression of sesquiterpene synthase (gene sesqui-TPS) and dynamic change of sesquiterpene content in the resin-deposited parts of the trunk of Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg. induced by Fusarium sp. A2. METHODS Artificial agarwoods from Aquilaria sinensis were induced by Fusarium sp. A2 using pinhole instillation. The heartwood of Aquilaria sinensis without or with resin were extracted before induction and at 7 time points within one year after induction. The expression of sesqui-TPS was detected by quantitative Real-time PCR. And then the dynamic change of sesquiterpene content in the tissues were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). RESULTS The relative expression of sesqui-TPS gene in the artificial agarwoods induced by Fusarium sp. A2 from 2 to 12 months were 10.85,0.793 1,6.484,611.4,5 800,and 4 211 respectively. Sesquiterpene secondary metabolites were not detected in the trunk at 2 months before artificial induction. Fourteen sesquiterpene were detected from 4 to 12 months, with relative percentages of 21.40%, 25.52%, 36.44%, 32.40% and 55.70% at each time point. CONCLUSION Sesqui-TPS gene is extremely sensitive to Fusarium sp.A2 treatment and responds to late damage. The expression of sesqui-TPS gene lags behind the accumulation of sesquiterpene component, which would provide a foundation for studies on regulation action of function gene for sesquiterpene biosynthase pathway during the formation of agarwood resin in A. sinensis.
     

沉香结香方法的历史记载、现代研究及通体结香技术

沉香为传统名贵巾药,临床使用广泛,具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘的功效,同时沉香也是一种名贵香料.沉香属植物中国沉香的唯一来源植物是白木香Aquilaria sinensis.自然条件下,健康白木香树并不产生沉香,只有受到外界伤害或真菌侵染时才能合成、积累沉香树脂.结香过程往往需要十几年、几十年甚至上百年时间,因此天然沉香远远不能满足市场需求.通过对沉香结香方法的历史记载以及现代结香方法作一综述,以期为大规模生产沉香提供依据和参考.     

高压输液法沉香通体结香技术的结香效果及所产沉香品质分析

目的：评价高压输液法用于通体结香技术的可行性。方法：分别在常压和10、20、30 MPa压力下采用通体结香技术处理白木香,记录输液时间,筛选最佳高压输液压力;在晴天、夜晚、雨天和低温4种不同结香环境条件下采用常压和高压输液处理,记录输液时间,根据《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》） 2020年版沉香质量标准,对处理6个月的沉香样品进行性状、显微观察,浸出物、结香率、沉香四醇质量分数、特征图谱分析。结果：20 MPa为高压输液法通体结香技术最佳输液压力,可显著缩短通体结香技术不同结香环境条件下的输液时间,输液效率提高129%～497%。20 MPa压力下通体香品质均符合《中国药典》 2020年版标准,沉香层呈棕黑色,环形沉香层外有棕色星点状沉香外溢现象;平均结香率、浸出物平均质量分数和沉香四醇平均质量分数分别为11.69%、15.14%和0.45%,与常压差异无统计学意义;薄层色谱和特征图谱检测结果与对照药材一致。结论：高压输液法通体结香技术能明显提高该技术的输液效率,既不受天气和气候影响,也不降低结香品质。该技术具有较强的可行性,可在实际生产中推广应用。