核心结合因子α1过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建含人CBFα1/RUNX2基因的过表达慢病毒载体。方法采用PCR技术体外扩增人CBFα1/RUNX2,将扩增产物与慢病毒载体pGC-FU连接,构建重组质粒pGC-FU-hCBFα1/RUNX2,并进行酶切及测序鉴定。鉴定正确的克隆转染293T细胞,经荧光显微镜观察和Western Blot检测hCBFα1/RUNX2基因在293T细胞内的瞬时表达。再利用脂质体转染法将pGC-FU-hCBFα1/RUNX2、pHelper1.0和pHelper2.0三质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒,并通过实时荧光定量PCR检测病毒滴度。结果重组质粒经测序证实,插入片段与人CBFα1/RUNX2基因序列完全一致。荧光显微镜观察以及Western Blot印迹均证实pGC-FU-hCBFα1/RUNX2中携有正确的hCBFα1/RUNX2基因,并能在293T细胞中瞬时表达。包装慢病毒后实时荧光定量PCR检测病毒滴度为(2.00×108)TU/mL。结论成功构建了携带hCBFα1/RUNX2基因的重组慢病毒载体,为进一步研究其在牙周组织再生中的生物学功能奠定了基础。     

核心结合因子α1在成牙本质细胞样细胞MDPC-23中的表达

目的：观察核心结合因子α1（cbfα1）在成牙本质细胞样细胞MDPC-23中的表达情况，为进一步研究cbfα1在牙胚发育，尤其是成牙本质细胞分化过程中的作用奠定基础。方法：通过瞬时转染、免疫荧光染色、Western blot等方法，研究转染或BMP-2刺激时，cbfα1在MDPC-23细胞中的表达情况。结果：在普通MDPC-23细胞中未发现cbfα1的表达；转染pcDNA3．cbfα148h后，cbfα1表达量最高；加入骨形态发生蛋白-2（BMP-2）刺激，可诱导内源性cbfα1的表达，但表达量小于pcDNA3-cbfα1组；而pcDNA3-cbfα1组和BMP-2＋pcDNA3-cbfα1组的cbfα1表达量差异无显著性意义（P〉0．05）。结论：转染pcDNA3-cbfα148h后，cbfα1表达量最高，可作为今后研究的观测点。     

HIF-1α基因慢病毒载体的构建和鉴定

[目的]构建带有大鼠HIF-1α基因的慢病毒表达载体,并进行病毒颗粒的包装与对293T的转染.[方法]从pEGFP-N1-HIF-1α载体中扩增出HIF-1α基因片段,将目的基因与pLenti6.3-MCS-RES2-EGFP载体连接,获得慢病毒表达载体pLenti6.3-HIF-1 α-IRES2-EGFP,并用磷酸钙转染法将其与慢病毒包装系统共同转染到293T细胞内进行病毒包装,48h后收集上清液并过滤,按不同感染复数感染293T细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达来测定病毒滴度和感染效率.[结果]构建了共表达HIF-1α基因和EGFP基因的重组慢病毒载体pLenti6.3-HIF-1 α-IRES2-EGFP,经PCR及测序结果证实,并对其成功包装出慢病毒,病毒滴度为4×106TU/ml.[结论]成功构建出HIF-1α基因重组慢病毒载体pLenti6.3-HIF-1 α-IRES2-EGFP并能有效的包装出慢病毒.     

Cofilin-1慢病毒载体的构建及其在Huh-7中的过表达

目的 构建Cofilin-1过表达的Huh-7细胞株. 方法 应用RT-PCR克隆出Cofilin-1的完整编码序列,将其亚克隆到慢病毒载体pWPT中,构建慢病毒载体表达质粒pWPT-Cofilin-1;将慢病毒表达质粒pWPT-Cofilin-1或pWPT-GFP与慢病毒包装质粒pMD2.G、psPAX2共转染293T细胞,获得携带Cofilin-1完整编码序列的慢病毒和携带GFP基因的慢病毒,将两种慢病毒分别感染Huh-7细胞;通过Real-Time PCR和Western blot检测Huh-7细胞中的Cofilin-1的过表达情况. 结果 测序结果显示成功构建重组慢病毒表达质粒pWPT-Cofilin-1;慢病毒有效感染Huh-7细胞,依据GFP绿色荧光可测定感染有效率超过95％;Cofilin-1在Huh-7细胞中的mRNA量和蛋白水平都成功的过表达. 结论 本实验的完成,为进一步研究Cofilin-1基因在肝癌中的生物功能和作用机制奠定了基础.     

HIF-1α基因慢病毒载体的构建及其转染骨髓间充质干细胞后的表达

目的 构建携带缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的慢病毒载体p LVX-HIF-1α-IRES-Zs Green1,并转染骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived stem cells,BMSCs),检测该慢病毒载体在BMSCs的表达。方法 从Puc-57-HIF-1α载体中扩增出HIF-1α基因片段,将HIF-1α基因片段与载体连接,获得慢病毒载体p LVXHIF-1α-IRES-Zs Green1,将其与慢病毒包装系统共同转染到293T细胞内进行病毒包装,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达来测定病毒滴度。将p LVX-HIF-1α-IRES-Zs Green1转染到BMSCs细胞内,通过Real-Time PCR和CCK-8法分别检测HIF-1αmRNA表达及BMSCs增殖能力。结果 PCR及测序结果显示慢病毒载体p LVX-HIF-1α-IRES-ZsGreen1构建正确,病毒滴度为3×108TU/m L。p LVX-HIF-1α-IRES-Zs Green1转染BMSCs后,BMSCs中HIF-1αmRNA表达水平及BMSCs细胞增殖能力明显高于非转染组(P<0.05)。结论 成功构建HIF-1α基因慢病毒载体p LVX-HIF-1α-IRES-Zs Green1,该慢病毒载体可以介导HIF-1α基因在BMSCs中稳定表达,并提高BMSCs增殖能力     

慢病毒载体介导HIF1α稳定表达A549细胞系构建

目的 利用慢病毒载体系统构建稳定表达HIF1α的A549细胞系.方法 以NCBI人HIF1α基因编码序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增HIF1α.酶切回收的HIF1α片段与制备的慢病毒载体HBLV-RFP-Puro重组反应.PCR和基因测序鉴定重组质粒.重组质粒和辅助质粒共转染293T细胞.包装好的病毒经过滤、浓缩后,利用稀释计数法测定病毒滴度.制备好的慢病毒感染A549细胞,采用药物筛选稳定转染细胞系.荧光显微镜及Western blot检测观察转染及筛选效果.结果 PCR扩增HIF1α片段经鉴定成功,重组质粒经PCR、基因测序鉴定构建成功.成功包装获得高滴度LV-HIF1α.LV-HIF1α感染A549细胞后经药物筛选,荧光显微镜下细胞带有红色荧光,Western blot结果显示LV-HIF1α组HIF1α的表达水平明显高于对照组.结论 慢病毒载体介导HIF1α稳定表达的A549细胞系构建成功.     

大鼠Tmub1基因过表达慢病毒载体的构建

目的 构建Tmub1基因的过表达慢病毒载体(LV-Tmub1),为研究Tmub1蛋白在肝细胞增殖过程中的作用提供实验材料.方法 化学合成Tmub1基因序列,用BamHI/AgeI酶切化学合成含有目的基因的质粒及GV287载体,PCR产物连接入线性化表达的载体.PCR鉴定引物,再对PCR鉴定阳性的克隆进行DNA测序和比对分析.使用构建的LV-Tmnb1,转染293T细胞,荧光法检测构建的慢病毒滴度.结果 成功构建了LV-Tmub1,并获得相应的病毒,病毒滴度为2×108 TU/mL.结论 LV-Tmub1为进一步研究Tmub1蛋白在肝细胞增殖中的作用提供了实验基础.     

慢病毒-绿色荧光蛋白载体转染人眼睑成纤维细胞的研究

目的 将慢病毒-绿色荧光蛋白载体感染人眼睑成纤维细胞,为诱导性多潜能干细胞研究奠定基础.方法 采用0.25% dispeasⅡ酶冷消化联合组织块贴壁法培养人眼睑成纤维细胞,免疫组化SP法鉴定细胞种类,将慢病毒-绿色荧光蛋白载体以不同的感染复数(MOI值)感染细胞,并于感染48 h后流式细胞仪检测感染效率.结果 该实验方法 能获得大量的成纤维细胞,并且纯度高,当MOI值为40时,其感染效率为95.37%.结论 慢病毒-绿色荧光蛋白载体能够高效稳定感染人眼睑成纤维细胞表达绿色荧光蛋白,是诱导性多潜能干细胞技术研究的理想种子细胞.     

携带人Oct4和EGFP基因慢病毒表达载体构建

目的 构建携带人Oct4和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUOGW.方法 Sac Ⅱ线性化pLentiEF1a-Oct4-IRES-EGFP,回收片段并补平Sac Ⅱ切口,接着BamH Ⅰ酶切该片段,回收2.565 kb片段而获连接用Oct4-IRES-EGFP;EcoR Ⅰ线性化pFUGW,回收并补平EcoR Ⅰ切口,然后BamH Ⅰ酶切该片段,回收9.174 kb片段获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒(TaKaRa)中的Solution Ⅰ将其与连接用Oct4-IRES-EGFP连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,提取质粒并行酶切鉴定.所构建载体命名为pFUOGW.获pFUOGW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带Oct4和EGFP基因的慢病毒感染293FF细胞和鼻咽癌细胞株C666-1、CNEI和6-10B以建立相应病毒感染体系.结果 酶切鉴定证实成功构建了pFUOGW,按标准程序生产的携带Oct4和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和6-10B.结论 成功构建携带人Oct4和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUOGW,为相关后续的研究打下良好的基础.     

携带人Sox2和EGFP基因慢病毒表达载体构建

目的 构建携带人Sox2和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUSGW.方法 Xho Ⅰ线性化pLentiEF1a-SOx2-IRES-EGFP,回收片段并补平Xho Ⅰ切口,接着BamH Ⅰ酶切该片段,回收2.356 kb片段而获连接用Sox2-IRES-EGFP;EcoR Ⅰ线性化pFUGW,回收并补平EcoR Ⅰ切口,然后BamH Ⅰ酶切该片段,回收9.174 kb片段获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒(TaKaRa)中的Solution Ⅰ将其与连接用Sox2-IRES-EGFP连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,提取质粒并行酶切鉴定.所构建载体命名为pFUSGW.获pFUSGW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带Sox2和EGFP基因的慢病毒感染小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)、人胚肺成纤维细胞(HLFs)和人神经胶质瘤细胞(U87)以建立相应病毒感染体系.结果 酶切证实成功构建了pFUSGW,按标准程序生产的携带SOx2和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染MEFs、HLFs及U87.结论 成功构建携带人Sox2和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUSGW,为相关后续的研究打下了良好的基础.     

突变型HIF-1α慢病毒载体的构建及其在常氧条件下的抗降解作用

目的构建点突变型低氧诱导因子-1α（HIF-1α）慢病毒载体,并检测其在常氧条件下的抗降解作用。方法根据人的HIF-1α基因（NM₀01530）,对其全长编码区序列进行如下定点突变:803位天冬酰胺突变成丙氨酸,564位脯氨酸突变成丙氨酸,402位脯氨酸突变成丙氨酸。设计并合成3对引物用以导入变异点。PCR扩增序列片段,然后将目的基因PCR产物连接到载体pEGFP-N1上,构建真核表达载体pEGFP-N1-mutant/HIF-1α。PacI和AscI酶切鉴定后,用LR重组系统将目的序列重组到慢病毒载体plenti6.3V5-DEST上,构建慢病毒载体Lenti-MT（突变型HIF-1α）及Lenti-WT（野生型HIF-1α）。将Lenti-MT、Lenti-WT及Lenti-LacZ（对照组）转染293T细胞后,采用qPCR检测目的基因的表达。转染后的细胞在低氧条件下（2%O2）培养48 h,然后常氧条件下培养48 h,采用Western blot检测HIF-1α蛋白在不同氧浓度条件下的表达情况。结果与WT测序结果对比表明MT已被完成。酶切结果证明已成功构建pEGFP-N1-mutant/HIF-1α。qPCR结果显示Lenti-MT组目的基因表达高于Lenti-WT组,且差异具有统计学意义。低氧条件下,HIF-1α在WT组和MT组中的蛋白表达差异无统计学意义。但常氧条件下培养48 h后,WT组目的蛋白的表达显著下降,而MT组变化不大。上述结果表明MT具有明显的抗降解作用。结论成功构建了突变型HIF-1α,慢病毒载体在常氧条件下,Lenti-MT具有显著的抗降解作用。     

Purα基因过表达和RNAi慢病毒载体的构建及应用

目的 构建Purα基因过表达以及SiRNA慢病毒表达载体,通过包装病毒,以用于神经系统细胞感染及原代培养神经元的基因操作.方法 1）过表达载体的构建：本实验使用pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒载体,PCR扩增Purα全长基因,然后亚克隆到pCDH载体相应的多克隆位点之中,进行酶切和测序鉴定;2）ShRNA慢病毒表达载体的构建：根据shRNA的特征,设计shR-NA的DNA序列以及其反向互补序列,然后合成并克隆到慢病毒载体pLKO.1-puro的相应位点中.3）慢病毒包装和滴度测定：将克隆好的pCDH-Purα和pLKO.1-puro-shRNA载体和病毒包装质粒pCMV-VSV-G、pCMV-dR8.2 dvpr按相应的比例转染到293FT细胞中,48h后收集上清液,纯化、浓缩,进行滴度测定.结果 测序结果证实所插入片段相位正确,转染后通过RT-PCR和Western blot证实过表达组Purα基因表达增高,而沉寂组的Purα表达抑制,达到实验设计要求,可以用于实验研究.结论 利用本方法可以快速地进行目的基因的基因操作,省时、节约,与同类型的方法比较,具有较大的优越性,可以在实验中推广应用.     

SOX9慢病毒表达载体的构建及其在LNcap细胞中的稳定表达

目的 构建SOX9基因慢病毒表达载体, 建立稳定表达SOX9的LNCa P细胞株.方法 PCR扩增SOX9基因, 将其克隆到慢病毒表达载体p LVX-IRES-Puro中, 双酶切和测序鉴定重组质粒.用HEK293细胞包装重组病毒颗粒并感染LNcap细胞, 经puromycin筛选获得稳定转染细胞株.q RT-PCR和Western Blot分别检测SOX9 m RNA水平及蛋白表达.结果 经双酶切和测序鉴定证实目的片段已插入到慢病毒表达载体上.重组质粒转入LNCa P细胞后经puromycin抗性筛获得稳定表达的细胞株, q RT-PCR检测到SOX9基因在转录水平的表达, Western blot分析显示SOX9蛋白高表达.结论 慢病毒表达载体p LVX-IRES-FLAG-SOX9构建成功, 实现了SOX9在LNcap细胞中的外源性表达.     

人TNF-α重组慢病毒载体构建及其脐血间质干细胞表达

目的构建带有人TNF-α基因的慢病毒载体,并且观察该基因在体外人脐血间质干细胞中的表达。方法通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从PCD DNA-TNF-α质粒中获得人TNF-α基因,利用Infusion技术重组构建慢病毒载体穿梭质粒pGC-FU-TNF-α,在脂质体Lipofectamine 2000介导下与结构质粒pHelper 1.0和包膜质粒pHelper 2.0共转染293T细胞包装生产慢病毒。将人脐血间质干细胞分为实验组(pGC-FU-TNF-α)、空载体对照组(pGC-FU-EGFP)及空白组(脐血间质干细胞),分别用重组慢病毒、空载慢病毒、PBS感染后,采用RT-PCR以及ELISA方法检测TNF-α表达。结果所获TNF-α基因测序证明与GenBank中序列一致;重组慢病毒载体质粒pGC-FU-TNF-α经鉴定正确;三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为2×107TU/L,感染脐血间质干细胞后RT-PCR、ELISA检测3组细胞均有TNF-α表达,其中实验组大量表达TNF-α,与其余两组比较差异有显著性(F=11.677、21.321,P<0.01)。结论成功构建带有TNF-α基因的慢病毒载体并实现在脐血间质干细胞中的表达,为脐血间质干细胞转基因治疗胃癌的应用奠定基础。     

TAP1基因慢病毒载体的构建

目的:构建TAP1基因慢病毒过表达载体及检测其过表达效率,为制备前列腺癌的免疫细胞疫苗提供基础。方法:将pDONR223-TAP1质粒和pLenti6.3-IRES-EGFP构建形成pLenti6.3-TAP1-IRES-EGFP表达质粒,采用慢病毒包装试剂盒包装产生慢病毒;感染293T细胞后RT-PCR检测目的基因TAP1的表达;采用荧光FACS计算病毒活性滴度。RT-PCR检测转染PC-3细胞后TAP1表达。结果:PCR和测序证实pLenti6.3-TAP1-IRES-EGFP慢病毒质粒构建成功;包装纯化后收集的病毒液滴度经流式细胞仪检测滴度为2.87×107 TU/ml;转染后的PC-3后,TAP1转染组TAP1的表达量显著高于对照组。结论:成功构建人TAP1基因慢病毒过表达载体,可以上调PC-3细胞TAP1的表达。     

CXCL1基因重组慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：采用第2代慢病毒表达载体系统,构建CXCL1基因的慢病毒表达载体,摸索出较传统转染方法更为高效、可靠的转基因方法,为今后进一步的基因靶向治疗研究打下良好的基础。方法：首先扩增CXCL1全长序列,将其与慢病毒载体pWPI连接后测序,通过BLAST检索,鉴定慢病毒表达载体构建成功。将重组慢病毒质粒转染293T细胞,48h后荧光显微镜鉴定,慢病毒转染并包装成功。结果：重组慢病毒质粒CXCL1-pWPI测序结果经BLAST对比分析,与CXCL1基因的同源性达100％。结论：成功的构建了CXCLl基因的重组慢病毒表达系统。     

大鼠BMP-7基因慢病毒载体构建及其在肝星状细胞中的表达

目的 构建携带大鼠BMP-7基因的慢病毒载体并实现该基因在肝星状细胞株HSC-T6中的稳定高表达,为进一步研究BMP-7的抗肝纤维化功能奠定基础。方法 从大鼠细胞基因中提取并用PCR方法扩增BMP-7目的基因,构建BMP-7重组表达载体Lenti-copGFP/puro-BMP7,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染293TN工具细胞,包装产生慢病毒颗粒。慢病毒感染H1299细胞,根据细胞绿色荧光蛋白（GFP）的表达水平测定病毒滴度。将HSC-T6细胞分为空白组、空病毒对照组及BMP-7慢病毒感染组,分别用Real-Time PCR和Western blotting方法检测BMP-7 mRNA和蛋白的表达。结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,成功构建大鼠BMP-7基因重组慢病毒载体。倒置荧光显微镜下观察可见,H1299细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为1×104 ifμ/μL。重组慢病毒感染HSC-T6后,Real-time PCR和Western blotting方法分别检测到BMP-7 mRNA和蛋白均稳定高表达。BMP-7慢病毒感染组与空病毒对照组比较,差异有统计学意义（P<0.01）;空病毒对照组与空白组比较,差异无统计学意义（P<0.05）。结论 成功构建了带有大鼠BMP-7基因的慢病毒载体,并实现其在HSC-T6的稳定高表达。     

SUMF2基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建硫酸酯酶修饰因子2(SUMF2)基因过表达慢病毒载体,以便进一步研究SUMF2功能。方法 针对人SUMF2 DNA序列设计带酶切位点的引物,PCR法获得目的基因片段;用AgeⅠ和NheⅠ酶双酶切SUMF2基因片段及PLJM1-EGFP载体。用T4连接酶对两种酶切产物进行连接、PCR鉴定、测序。将阳性克隆质粒与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染293T细胞,并荧光显微镜观察EGFP的表达。结果 PCR和测序证实成功构建了SUMF2的慢病毒表达载体,病毒效价为1×10⁸ TU/ml。结论 成功构建SUMF2-PLJM1-EGFP慢病毒载体,并在293T细胞中得到表达。     

基因组不稳定肝细胞CDT1基因过表达和RNAi慢病毒载体的构建

目的构建基因组不稳定细胞CDT1基因过表达和RNAi模型,为进一步探讨该基因在辐射诱发基因组不稳定的功能提供研究工具。方法根据CDT1基因信息,以慢病毒载体GV218设计合成两种重组质粒,分别包含CDT1基因全长序列以及阴性对照序列;以慢病毒载体GV248设计合成两种重组质粒,分别包含CDT1基因的小干扰序列以及用于干扰对照的阴性序列。利用Western blot和qPCR进行过表达和RNAi重组质粒表达的检测。通过转染293T细胞进行慢病毒的包装。利用ELISA和荧光法分别进行滴度的检测。再用包装好的慢病毒感染辐射诱导基因组不稳定性HL-7702肝细胞,利用qPCR检测CDT1表达量。结果测序结果表明重组质粒构建成功,并能够有效转染293T。过表达病毒滴度为4.3×108TU/ml;RNAi病毒滴度为2.0×108TU/ml。过表达慢病毒能有效上调CDT1的表达,过表达效率为65%。RNAi干扰慢病毒能够有效抑制CDT1的表达,抑制效率为88%。结论成功构建基因组不稳定肝细胞CDT1基因过表达和RNAi模型,为进一步研究CDT1在辐射诱发基因组不稳定细胞中的功能提供了有效的研究工具。     

叉头状转录因子O1基因过表达慢病毒载体构建及其大鼠系膜细胞株的建立

目的构建含组成性激活突变型Fox O(CA-Fox O1 1)基因的过表达慢病毒载体,并建立其过表达的大鼠肾小球系膜细胞株。方法通过四质粒合成法构建包含CA-Fox O1编码序列的过表达慢病毒载体(LV-CA-Fox O1)。实验分为3组:空白对照组(NC组)、空慢病毒载体阴性对照组(LV-empty-Fox O1组)和过表达慢病毒载体组(LV-CA-Fox O1组)。培养系膜细胞(RMCs)72 h后,用流式细胞仪检测RMCs中绿色荧光蛋白(GFP)阳性率,并采用实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法检测Fox O1的m RNA及蛋白表达情况。结果成功构建LV-CA-Fox O1,其病毒滴度为1×108TU/ml。LV-empty-Fox O1组和LV-CA-Fox O1组GFP阳性率分别为84.5%和81.4%;与NC组相比,LV-CA-Fox O1组Fox O1的m RNA与蛋白表达量相当于NC组的27.92倍与5.41倍(均P<0.05);而NC组与LV-empty-Fox O1组Fox O1的m RNA及蛋白表达量差异均无统计学意义。结论成功构建了大鼠Fox O1基因的过表达慢病毒载体,并建立了稳定过表达Fox O1的大鼠肾小球系膜细胞株,为进一步研究Fox O1的功能和作用机制奠定了研究基础。