兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及冻存研究

目的:寻求体外培养、冻存、复苏兔骨髓间充质干细胞(mensechymalstemcells,MSCs)的方法,为兔MSCs进一步的实验研究打下基础。方法:取新西兰白兔胫骨穿刺获取骨髓液,以贴壁筛选法分离、纯化、培养和扩增获得MSCs,并行液氮冻存,通过倒置显微镜观察其生物学表现。结果:MSCs为贴壁生长,形态为均匀成纤维细胞样,增殖能力强,传代及冻存后细胞仍然保持其生物学特性。结论:MSCs可采取贴壁筛选法进行较好的纯化和扩增,并可长期保存于液氮中,在一定的条件下可复苏存活。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养纯化及冻存

目的:建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离培养及冻存的方法。方法:用密度梯度离心法及贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSCs,并对其形态学特征进行观察,比较两种分离培养法的细胞生长增殖情况。大鼠MSCs在12.5%二甲亚砜(DMSO)保护下放入液氮冻存,6个月后复苏,测其成活率及观察生长增殖情况。结果:用密度梯度离心法及贴壁培养法均能有效地分离大鼠骨髓MSCs,细胞活力好,增殖能力强。大鼠MSCs可用液氮保存,且复苏后细胞生长增殖旺盛,形态无明显的变化。结论:采用密度梯度离心法及贴壁培养法成功地建立了大鼠骨髓MSCs体外分离和培养体系;采用液氮冻存大鼠MSCs的方法十分有效可行。     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学特性

目的:观察成人骨髓间充质干细胞体外分离培养方法及其生物学特性,为骨髓间充质干细胞的临床应用奠定技术基础。方法:实验于2005-12在吉林省四平市中心医院中心实验室进行。实验材料:人骨髓间充质干细胞,Ficoll淋巴细胞分离液,胎牛血清,牛血清白蛋白,α-MEM培养基,胰蛋白酶,FITC标记的CD44和CD90。实验方法:①人骨髓间充质干细胞的分离与培养:采集成人骨髓,密度梯度法分离单个核细胞,条件培养基培养和扩增,倒置光学显微镜下观察细胞形态及生长情况。②人骨髓间充质干细胞生长曲线的测定:取生长良好的P1,P5,P10细胞,用胰酶消化,接种于24孔板培养,每天各取3孔消化计数细胞,取平均值,连续培养7d,绘制生长曲线。③人骨髓间充质干细胞表面标志的测定:取生长良好P5细胞进行免疫荧光染色鉴定(CD44,CD90并设同型对照)。④人骨髓间充质干细胞的冻存及复苏:收集生长良好细胞,计数细胞密度及冻前存活率。将细胞加入到细胞冻存液中液氮冷冻保存。30d后复苏细胞,每日倒置光学显微镜下观察细胞生长状况。结果:①倒置显微镜下观察细胞形态:倒置显微镜下观察细胞呈纤维形,漩涡状生长。②人骨髓间充质干细胞的生长曲线分析:传代的细胞生长较原代要快,从第10代开始细胞生长开始出现缓慢征象。③细胞表面标记检测结果:免疫荧光染色后细胞膜着色明显,CD44,CD90阳性率均大于90%。④细胞冻存及复苏生长特性分析:椎虫蓝计数细胞存活率90%以上,增殖能力强,和未冻存过的传代细胞具有同样的生长特性。结论:应用密度梯度法分离法能获得较高纯度的骨髓间充质干细胞,能在体外长期培养,在传代培养5代内生长旺盛且生物学特性稳定。     

分离培养方法及冻存技术对犬骨髓间充质干细胞生长和增殖的影响

背景：骨髓间充质干细胞在体外长期培养易发生自发分化，而失去多分化潜能，因此必须对培养的细胞及时冻存，需要时再进行复苏。目的：建立犬骨髓间充质干细胞体外分离、培养、增殖、冻存的方法。设计、时间及地点：对照观察细胞学实验，于2005-06／2008—06在浙江中医药大学附属第一医院骨伤研究所完成。材料：健康成年雄性Beagle犬用于骨髓间充质干细胞的提取。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化骨髓间充质干细胞，并进行传代扩增培养。将第2代骨髓间充质干细胞与12．5％DMSO混匀置于冻存管中，采用慢冻快融法进行冻存和复苏：将冻存管置于-4℃冰箱2h，然后移入-30℃冰箱2h，再置于厚壁塑料泡沫盒中，扎紧密封，置-80℃冰箱过夜后，取出冻存管直接放入液氮中保存，或放入-80℃冰箱保存。复苏时将冻存管从液氮或80℃冰箱中取出，立即置37℃水浴并轻轻摇动，1-2min内迅速解冻。主要观察指标：复苏前后细胞成生长活性及形态变化。结果：分离的骨髓间充质干细胞为以均一的梭形的成纤维细胞样贴壁生长，贴壁及增殖能力强，传代细胞贴壁较快。经过液氮长期冻存后，将复苏后的骨髓间充质干细胞再培养，细胞形态及生长状态与冻存前无差异，均呈长梭形均匀分布生长，细胞生长增殖旺盛。结论：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法町获得犬骨髓间充质干细胞，应用慢冻快融技术进行冻存和复苏，较好的保持了冻存细胞的活力和功能。     

建立大鼠骨髓间充质干细胞稳定分离培养体系与鉴定

背景:骨髓间充质干细胞作为种子细胞存组织工程等领域应用广泛,建立稳定的分离培养体系和统一鉴定标准尤为重要.目的:以不同方法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测.设计、时间及地点:细胞学体外对比观察,于2005-08/12在暨南大学完成.材料:SPF级3月龄SD雌性大鼠5只,由中山大学实验动物中心提供.方法:无菌条件下分离大鼠双下肢,低糖DMEM培养液冲出骨髓,分别运用全骨髓贴壁法和密度梯度离心法体外分离骨髓间充质干细胞.利用差速贴肇原理对细胞进行纯化扩增.取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞,分别加入成骨、成脂、成软骨诱导培养基,培养14d.主要观察指标:倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞的生长状态,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,采用碱性磷酸酶染色鉴定成骨能力,以油红○染色鉴定成脂能力,以甲苯胺蓝染色鉴定成软骨能力.结果:与密度梯度离心法相比,全骨髓贴肇法分离获得的骨髓间充质干细胞贴壁时间短,增殖快,经传代后能够纯化.第3代骨髓间充质干细胞形态单一均匀,呈典型的极性漩涡状生长,不表达造血前体细胞标志抗原CD34和白细胞标志抗原CD45,表达整合索家族成员CD29和黏附分子CD44,经诱导后碱性磷酸酶染色、油红○染色和甲苯胺蓝染色均呈阳性.结论:采用全骨髓贴壁法可稳定获得均质性良好的大鼠骨髓间充质干细胞,效果优于密度梯度离心法.经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学、细胞表面标志物表达和多向分化能力方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为大鼠骨髓间充质干细胞.     

SD大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及其生物学特性鉴定

目的:探讨并优化大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs)体外分离培养方法,鉴定其生物学特性,为BMSCs应用奠定技术基础。方法:无菌条件下分离SD大鼠股、胫骨,用无血清培养液(α-MEM培养基、100U/mL青霉素,100U/mL链霉素)冲出骨髓,采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离纯化rBMSCs,通过传代培养,扩增rBMSCs。倒置光学显微镜下观察细胞形态及生长特征,绘制细胞生长曲线。免疫细胞化学染色测定rBMSCs表面标志,成骨诱导试剂盒检测rBMSCs向成骨分化的潜能。结果:镜下rBMSCs呈梭形、多角形成纤维细胞样形态,大小均一,漩涡状生长。生长曲线分析rBMSCs贴壁2d基本无增殖,处于潜伏期,对数增殖期为3～6d,第7天后进入平台期,细胞出现接触抑制现象。rBMSCs表面标志显示第3代rBMSCs纯度可达99%以上,其细胞表型CD44呈阳性表达,CD34呈阴性表达。向成骨诱导rBMSCs10d后细胞表现成骨细胞特性,碱性磷酸酶活性明显增高。结论:本实验从细胞取材、细胞接种密度、条件培养基到细胞微环境等各方面的方法进行了优化,建立了一种理想的体外分离扩增rBMSCs的培养体系。实验结果表明所分离培养的rBMSCs纯度高、扩增迅速、生物学形状稳定,可为组织工程提供比较理想的种子细胞,为进一步研究BMSCs生物学行为及临床研究和应用奠定了坚实的基础。     

人脐带间充质干细胞低温冻存后生物学鉴定

目的观察人脐带间充质干细胞(HUC-MSCs)经低温冻存复苏后的生物学特性,验证其是否仍具有间充质干细胞的基本特征。方法用胶原酶和胰蛋白酶消化脐带,分离诱导获得HUC-MSCs,传代培养,取第3代细胞加入冷冻保护剂(10%DMSO+40%FBS+50%DMEM/F12)后将其冻存于-80℃冰箱过夜,再转入液氮气相中保存1个月后复苏。采用倒置显微镜观察复苏后贴壁生长细胞的形态;台盼蓝拒染法比较冻存前后细胞活力;MTT法测定HUC-MSCs的增殖活性,比较冻存前后HUC-MSCs增殖活性的差异;流式细胞仪检测HUC-MSCs经冻存复苏后表面抗原的表达情况;复苏后HUC-MSCs进行成骨诱导分化培养,检验其是否仍具有多向分化潜能。结果 HUC-MSCs经低温保存复苏后,细胞仍保持贴壁生长等外形特征,复苏后HUC-MSCs存活率为91.17%;增殖活性与未冻存细胞比较,差异无统计学意义;细胞表面高表达CD105、CD73、CD71、CD90、CD29、CD44、CD13抗原,低表达或不表达CD34、CD133、CD45、CD14,HLA-DR、CD86、CD83、CD80、CD1α;复苏后HUC-MSCs具有向成骨细胞诱导分化能力,细胞经茜素红、ALP和Von-Kossa′s染色呈阳性反应。结论经冻存复苏后的HUC-MSCs保持了间充质干细胞的基本形态,其表型满足间充质干细胞的基本要求,仍具有向成骨细胞分化的潜能。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

背景：目前对骨髓间充质干细胞常用的分离方法有密度梯度离心法、贴壁筛选分离法。目的：联合应用密度梯度离心法和贴壁筛选分离法体外分离培养、扩增兔骨髓间充质干细胞，并对其进行鉴定。设计、时间及地点：对比观察的细胞学实验，于2007-10／2008-03在上海市第六人民医院中心实验室完成。材料：2月龄新西兰纯种大耳白兔6只用于骨髓间充质干细胞取材与原代培养，1．073kg／L的Percoll分离液。方法：实验采用Percol分离液利用密度梯度离心法及结合贴壁分离筛选法来分离、纯化骨髓间充质干细胞，在采用密度梯度离心法得到骨髓间充质干细胞后，经贴壁培养及反复换液纯化骨髓间充质干细胞。分别取第3，5，7，9代骨髓间充质干细胞，行细胞计数，绘制细胞生长曲线。主要观察指标：倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况。采用CD44及CD34抗体进行间接免疫荧光标记鉴定培养的干细胞。CD44染色呈阳性，CD34染色呈阴性，说明所提取、纯化的细胞是骨髓间充质干细胞。结果：增殖传代的骨髓间充质干细胞呈长梭形均匀分布生长，形态比原代培养的细胞更均匀，细胞生长旺盛、增殖迅速，胞核明显，核仁清晰，核浆比例大，细胞形态均匀，平行排列呈螺旋状或漩涡状，传代至第5代时无明显变化。随传代次数的增加，细胞增殖能力逐渐下降，第3～5代细胞增殖能力强。所分离培养的细胞均表达CD44，不表达CD34。结论：在体外采用密度梯度离心及贴壁培养法可获得高纯度的兔骨髓间充质干细胞。     

密度梯度离心并贴壁法分离成人骨髓间充质干细胞的成骨特性

目的:观察密度梯度离心法结合贴壁法体外分离纯化培养人骨髓间充质干细胞的效果,以及诱导后的成人骨髓间充质干细胞的成骨特性。方法:实验于2005-05/09在中国协和医科大学中国医学科学院整形外科医院进行。用密度梯度离心法结合贴壁法分离纯化成人骨髓间充质干细胞。采用倒置显微镜观察,噻唑兰法测定细胞生长曲线,免疫细胞化学鉴定骨髓间充质干细胞膜抗原和细胞基质蛋白属性。取体外扩增的第3代骨髓间充质细胞,以3.0×103/cm2的浓度接种于放置有无菌处理的盖玻片的六孔板中,每孔内加2mL含10%胎牛血清的低糖型DMEM培养基培养液。当细胞贴壁生长达到60%～70%汇合时,将培养基更换为含5%胎牛血清的低糖型DMEM培养液,其中含骨诱导剂地塞米松、抗坏血酸和β-磷酸甘油,浓度分别为:100nmol/L、0.25mmol/L、10mmol/L。间充质细胞在这样的诱导体系中进行诱导培养,对照只加培养基。在第4、8、12、16天分别观察各孔中细胞的形态学和组织化学变化。体外加成骨诱导剂后分别作碱性磷酸酶活性测定、茜素红染色和VonKossa染色,观察骨髓间充质干细胞的成骨分化结果。结果:①分离的骨髓间充质干细胞培养48h后贴壁,72h后出现纺锤状细胞,贴壁的骨髓间充质细胞平均约12d后形成克隆。②第2代骨髓间充质干细胞99%表现为CD44 、Vim 、CD34-,CD29-。细胞表型稳定。③加成骨诱导剂后碱性磷酸酶活性明显增高,钙沉积在第8d就开始出现,茜素红染色、VonKossa染色阳性。结论:密度梯度离心法结合贴壁法分离纯化的成人骨髓间充质干细胞纯度高,表型稳定,体外加成骨诱导剂培养后,符合成骨细胞的形态特征和生物学特性,具有成骨活性,可为骨组织工程和基因治疗提供比较理想的种子细胞。     

全骨髓贴壁并差速传代分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞:与密度梯度离心法的比较

背景:目前国内外分离纯化骨髓间充质干细胞有两种主要方法;密度梯度离心法及全骨髓贴壁法,前者步骤较复杂,后者简单易操作,但纯化效果不理想.目的:在全骨髓贴壁分离骨髓间充质干细胞基础上,并用差速传代消化法,建立大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养纯化方法.方法:全骨髓贴壁培养法分离并差速消化传代大鼠骨髓间充质干细胞,利用间充质干细胞在消化传代过程中较其他骨髓细胞消化悬浮速度快,以及贴壁快的特点,代替密度梯度离心操作来分离纯化间充质干细胞,对其形态学特征进行观察,并与密度梯度离心法比较两种分离培养法的细胞生长增殖情况;观察碱性磷酸酶及油红染色情况,验证骨髓间充质干细胞的分化能力;检测细胞表面标记物,验证免疫特性及检测其纯度.结果与结论:全骨髓贴壁培养法分离并差速传代大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞鉴定、成骨成脂肪培养结果显示其细胞免疫特性、纯度、分化能力与密度梯度离心法无显著差异,但细胞活力,增殖能力有明显提高.     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养纯化及生物学特性的鉴定

【目的】探讨大鼠骨髓间充质干细胞（rat bonemarrow—derived mesenchymal stem cells，rBMSCs）体外分离、培养和纯化方法，鉴定其生物学特性，为BMSCs应用奠定技术基础。【方法】采用密度梯度离心法结合贴壁分离法分离培养纯化SD大鼠BMSCs，观察其形态，测定细胞生长曲线，流式细胞仪检测细胞表面标记，成骨诱导试剂盒检测rBMSCs向成骨细胞分化的潜能。【结果】显微镜下rBMSCs呈梭形、多角形成纤维细胞样形态，大小均一，漩涡状生长。生长曲线分析rBMSCs贴壁2d基本无增殖，处于潜伏期，对数增殖期为3～7d，d8后进入平台期，细胞出现接触抑制现象。rBMSCs表面标志显示第3代rBMSCs纯度可达97％以上，CD44、CD90呈阳性表达，CD34呈阴性表达；向成骨诱导rBMSCs10d后细胞表现成骨细胞特性，碱性磷酸酶活性明显升高。【结论】本实验建立了一种理想的体外分离扩增纯化rBMSCs的培齐体系。实验结果表明所分离培养的rBMSCs纯度高、生物学特征稳定，适用于对BMSCs进一步的应用研究。     

人骨髓间充质干细胞的体外培养、鉴定及成骨分化

背景：国内外对骨髓间充质干细胞的体外成骨诱导分化研究手段、测定指标均不够全面。目的：建立并完善一整套人骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定方法,探讨其体外成骨分化能力。方法：采用密度梯度离心法分离培养人骨髓间充质干细胞,流式细胞仪鉴定细胞表面表型。传至第3代时更换成骨诱导培养基进行成骨分化诱导。结果与结论：人骨髓间充质干细胞生长旺盛,传代后增殖旺盛,第3代骨髓间充质干细胞表面表型CD44、CD73、CD90表达阳性,CD34表达阴性。诱导后的成骨细胞碱性磷酸酶活性增加,Gomori、Vonkossa、茜素红染色均阳性。RT-PCR检测诱导后细胞有Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶、骨钙素、骨唾液酸蛋白、骨桥蛋白及骨连接蛋白基因的表达,证明了人骨髓间充质干细胞成功向成骨方向分化。表明实验建立了一整套稳定、成熟的骨髓间充质干细胞分离、培养、扩增方案。     

长期培养人脐带间充质干细胞的生物活性及其限制性

背景：间充质干细胞具有多向分化能力、免疫调节能力,并可在体外进行长期培养扩增,但其体外长期培养的生物学活性变化特点及其限制性仍不十分清晰。目的：观察体外长期培养人脐带间充质干细胞的生物活性变化特点及其限制性。方法：无菌收集剖宫产新生儿脐带,经胶原酶Ⅱ消化后,用黏附生长选择法获取人脐带间充质干细胞,胰酶消化传代;取第3代细胞进行流式分析,脂肪和成骨诱导鉴定;收集不同代的细胞分别用MTT法、流式细胞仪和爬片分析法检测细胞增殖活性、细胞周期、凋亡率及黏附能力。结果与结论：人脐带间充质干细胞的细胞表型CD105＋/CD29＋/CD44＋/CD31-/CD34-/CD45-/HLADR-,可诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞;传代培养第3～23代细胞形态无明显变化,生长曲线基本一致,第28代后细胞增长缓慢;流式分析发现第33代细胞较第3代G0/G1减少17.9%、S＋G2/M增加103.4%、细胞凋亡率增加316.7%,差异均有显著性意义（P〈0.01）,第3～18代细胞间G0/G1、S＋G2/M、细胞凋亡率和黏附细胞数差异均无显著性意义（P〉0.05）。提示在体外长期培养环境中,随着传代次数的递增,人脐带间充质干细胞的增殖及黏附能力下降,细胞凋亡率增加,总的生物活性呈逐渐下降趋势,其最佳生物活性期出现在培养第3～18代之间。     

长期培养人脐带间充质干细胞的生物活性及其限制性

背景:间充质干细胞具有多向分化能力、免疫调节能力,并可在体外进行长期培养扩增,但其体外长期培养的生物学活性变化特点及其限制性仍不十分清晰。目的:观察体外长期培养人脐带间充质干细胞的生物活性变化特点及其限制性。方法:无菌收集剖宫产新生儿脐带,经胶原酶Ⅱ消化后,用黏附生长选择法获取人脐带间充质干细胞,胰酶消化传代;取第3代细胞进行流式分析,脂肪和成骨诱导鉴定;收集不同代的细胞分别用MTT法、流式细胞仪和爬片分析法检测细胞增殖活性、细胞周期、凋亡率及黏附能力。结果与结论:人脐带间充质干细胞的细胞表型CD105+/CD29+/CD44+/CD31-/CD34-/CD45-/HLADR-,可诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞;传代培养第3～23代细胞形态无明显变化,生长曲线基本一致,第28代后细胞增长缓慢;流式分析发现第33代细胞较第3代G0/G1减少17.9%、S+G2/M增加103.4%、细胞凋亡率增加316.7%,差异均有显著性意义(P<0.01),第3～18代细胞间G0/G1、S+G2/M、细胞凋亡率和黏附细胞数差异均无显著性意义(P>0.05)。提示在体外长期培养环境中,随着传代次数的递增,人脐带间充质干细胞的增殖及黏附能力下降,细胞凋亡率增加,总的生物活性呈逐渐下降趋势,其最佳生物活性期出现在培养第3～18代之间。     

兔骨髓间充质干细胞分离培养后的活力检测

背景：目前分离纯化骨髓间充质干细胞多采用单一的方法,对扩增培养过程中细胞活力的变化没有较为系统而全面的评估。目的：探索体外分离培养和纯化兔骨髓间充质干细胞的方法,并对细胞的活力进行检测。方法：采用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,从形态学、细胞表型和成骨成脂能力方面进行鉴定;并从细胞生长曲线、贴壁率和克隆形成率3个方面评估细胞活力。结果与结论：原代细胞多呈梭形和圆形,48h后大部分细胞贴壁,8-10d细胞融合达80%-90%,传代周期为3-5d;流式检测显示CD14、CD34和CD45表达阴性,CD29、CD44和CD90表达阳性;成骨诱导茜素红染色可见明显的钙结节,成脂诱导油红O染色可见大量脂肪细胞;细胞生长曲线、贴壁率及克隆形成率的结果表明第1代和第3代细胞的活力优于第5代细胞。结果说明密度梯度离心联合贴壁筛选的方法能够有效的分离纯化骨髓间充质干细胞,并能较好的保持其生物功能,在扩增传代过程中,细胞活力会有不同程度的下降。     

脂肪干细胞的三维球形培养简

背景：大多哺乳类细胞在正常生理状态下多以三维结构存在,为还原细胞本身在体内的自然状态,很多研究者开始尝试在体外对细胞进行三维培养,球形培养是一种常见的三维培养模式。目的：尝试用3种不同的方法在体外对人脂肪干细胞进行球形培养,并观察其生物学特征。 方法：对提取的脂肪来源细胞进行表面 Marker 流式检测以及成脂成骨诱导鉴定后,证实为脂肪干细胞。先后用低黏附培养法、hanging-drop培养法和Eppendorf管培养法3种方法在体外对脂肪干细胞进行球形培养,对3种方法形成球形的特点进行比较分析,并通过 Imagej 软件计算出3组多细胞球体的平均面积,利用Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Animal Live＆amp;Dead Cel s试剂盒对3组多细胞球体进行活力检测。结果与结论：①通过流式细胞术鉴定细胞表型标志物,其中CD29,CD44,CD59完全阳性,同时成脂成骨诱导也为阳性,证实提取的细胞为脂肪干细胞。3代以内脂肪干细胞多呈长梭形,并克隆状生长。②低黏附培养法、hanging-drop 培养法、Eppendorf 管培养法均可使脂肪干细胞聚集成球形生长,但所成多细胞球形有所差异。低黏附培养法所形成的细胞球形大小不一,不易控制;而hanging-drop培养法和Eppendorf管培养法均可使脂肪干细胞形成大小均一的球形,但在大小和形成时间上有所不同。③3种不同方法所形成的球形细胞均保持较好的细胞活力。     

人脂肪间充质干细胞的分离培养与生物学特性

背景：脂肪来源间充质干细胞取材于吸脂手术所获得的脂肪抽吸物,可反复取材,原料来源充足.目的：建立一种体外分离培养人脂肪来源间充质干细胞的方法,并分析其生物学特性.方法：采用胶原酶消化法分离获取人脂肪来源间充质干细胞并进行体外培养,倒置相差显微镜下观察细胞形态;观察分析传代第3,7,10 代细胞生长曲线;采用流式细胞仪检测传代第5 代细胞表面标志表达.取传代第4代细胞行体外成骨细胞诱导和成脂诱导,采用碱性磷酸酶染色及油红O染色鉴定.冻存传代细胞,分别于 2,6 个月后复苏,锥虫蓝染色计数复苏后细胞存活率.结果与结论：原代细胞3 d 贴壁,6 d 后开始快速增长并形成集落,11 d左右达80%~90%融合,多呈纤维样;传代后细胞维持纤维样形态.传代细胞潜伏期24~48 h,对数增殖期三四天,对数增殖期后第五六天进入平台期.间充质干细胞表面CD34、CD14、HLA-DR 呈阴性表达,CD44、CD105、CD13呈阳性表达,HLA-ABC呈弱阳性表达.具有向脂肪细胞、成骨细胞分化的能力,冻存复苏后细胞存活率达 90% 以上,且与未冻存传代细胞具有相同的生长特性.     

密度梯度离心与贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞及其生物学特性观察

背景：获取更大量、更高纯度、有活性的骨髓间充质干细胞是干细胞移植及组织工程研究发展的基础。目的：拟建立一套体外分离培养及大量扩增兔骨髓间充质干细胞的方法，并对细胞生物学特性进行观察。设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2006—12／2007—07在山东省烟台市莱阳中心医院骨科试验室完成。材料：清洁级1月龄雌性新西兰大白兔1只。方法：采用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合的方式，分离兔骨髓间充质干细胞，应用细胞刮收集呈长梭形的细胞，形成克隆后用胰蛋白酶＋EDTA消化，按1：3传代进行体外扩增培养。主要观察指标：倒置相差显微镜下观察细胞形态特征，免疫细胞化学SABC法鉴定CD34、CD44抗原的表达，观察细胞生长特性，测定细胞活力。结果：原代分离培养的贴壁细胞呈长梭形，漩涡状排列，约14d达90％以上融合；传代后增殖迅速，细胞为单一的梭形，排列更加有序。所培养的细胞CD44呈阳性表达，而CD34呈阴性。第1～5代细胞培养3—5d为对数生长期，第7代以后对数增长期延长。第1～5代细胞成活率均〉94％，其中第3，4代成活率高达97％；至第7代细胞活力呈明显下降趋势，细胞成活率仅为78％。结论：应用密度梯度离心结合贴壁法，可成功分离并扩增兔骨髓间充质干细胞，且细胞生长稳定，增殖力强．可作为细胞移植的种子细胞。     

全骨髓法培养C57小鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性

背景：饲养层细胞多数利用丝裂霉素C来处理,虽丝裂霉素C抑制了细胞增殖,但是细胞仍处于有分泌功能的活性状态,能够分泌不同的细胞因子。而骨髓中的非间充质骨髓细胞和血浆中的各种分泌因子,保持间充质细胞生长的微环境,提高间充质干细胞的产量。 目的：探究全骨髓培养法分离培养的小鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性。 方法：采用全骨髓贴壁法纯化扩增C57小鼠的骨髓间充质干细胞,检测细胞增殖的动力学变化、细胞表面的免疫标志物、多向分化的潜能及细胞周期的变化。 结果与结论：全骨髓培养法获得的小鼠骨髓间充质干细胞具有黏附于塑料培养器皿的能力,流式细胞仪检测表达CD45,CD105和Sca-1,不表达CD34,CD133和C-kit等间充质干细胞的表面标记特征;细胞倍增时间（57.11＆#177;1.5） h;诱导后具有向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化的能力;细胞周期分析表明64%的细胞处于G 0-G 1期。提示全骨髓培养法获取的C57小鼠骨髓间充质细胞具有间充质干细胞的生物学特征。