苯丁酸钠通过上调p21 WAF1/CIP1基因抑制白血病细胞系的细胞周期

目的研究组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂苯丁酸钠(PB)对白血病细胞系细胞周期的影响,探讨其分子机制.方法PB处理白血病细胞系Kasumi-1、U937和NB4细胞,分别于处理后24,48和72 h收集细胞.碘化丙锭DNA染色,流式细胞术分析细胞周期的变化.半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析细胞周期相关基因p21WAF1/CIP1表达的变化.在人肾上皮细胞系293T细胞用荧光素酶报告基因分析PB对p21WAF1/CIP1基因启动子活性的影响.结果PB可以抑制Kasumi-1、U937和NB4细胞的细胞周期,作用呈时间和剂量依赖关系.3 mmol/L PB作用72 h,分别使Kasumi-1、U937和NB4细胞的G0/G1期细胞比例增加42.03%、44.36%和26.82%,S期细胞比例减少31.86%、38.91%和26.77%.PB使Kasumi-1、U937和NB4细胞p21WAF1/CIP1表达增高.PB处理后,p21WAF1/CIP1的表达水平较处理前增高(2.06±0.27),(2.78±0.40)和(1.78±0.20)倍.PB可以上调p21WAF1/CIP1启动子的转录活性,且呈剂量依赖关系.3 mmol/L PB处理48 h使转录活性增高(5.74±0.93)倍.PB上调p21WAF1/CIP1启动子转录活性主要是依赖于转录起始位点上游101 bp的序列.结论PB可以抑制白血病细胞系的细胞周期,这种作用可能是通过上调细胞周期相关基因p21WAF1/CIP1的表达实现的.     

丙戊酸钠逆转Kasumi-1白血病细胞株AML1-ETO融合蛋白转录抑制的作用

本研究探讨组蛋白脱乙酰化酶抑制剂（HDAC）丙戊酸钠（VPA）逆转Kasumi-1白血病细胞株AML1-ETO融合蛋白转录抑制机制的作用。Kasumi-1细胞经不同浓度VPA处理不同时间,采用半定量RT—PCR分析AML1-ETO、AML1及cyclinD2mRNA水平的变化情况。结果表明：不同浓度VPA处理Kasumi-1不同时间,AML1-ETOmRNA水平无明显变化;1—3mmol／LVPA处理Kasumi-1细胞3天时,与对照组比较,AML1mRNA表达水平增高,呈现剂量依赖性,差别具有统计学意义。以3mmol／LVPA处理Kasumi-1细胞,与对照组比较,3mmol／LVPA组cyclinD2mRNA表达水平降低;以不同浓度VPA处理Kasumi-1细胞3天,结果发现随着VPA药物浓度加大cyclinD2mRNA表达水平降低,呈现剂量依赖性,差别具有统计学意义。结论：VPA能通过抑制HDAC的活性,消除AMLl／ETO融合蛋白的转录抑制并增加aml-1基因转录,下调aml-1靶基因cyclin D2 mRNA的表达。     

地西他滨对白血病Kasumi-1细胞的毒性作用及其机制研究

目的:探讨地西他滨对白血病Kasumi-1细胞的毒性作用及其机制。方法:应用CCK-8法检测0.5～100μmol/L地西他滨作用Kasumi-1细胞24、48、72 h后的细胞存活率,An-nexinⅤ-FITC/PI双染色法检测0.5～20μmol/L地西他滨处理Kasumi-1细胞48 h后的细胞凋亡率,流式细胞碘化丙啶单染色法观察G0/G1期、S期、G2/M期Kasumi-1细胞比例;逆转录PCR法检测p21WAF1/CIP1基因表达水平的变化。结果:0.5～100μmol/L地西他滨均可抑制Kasumi-1细胞增殖,并呈现剂量依赖性与时间依赖性,作用24、48、72 h的IC50浓度分别为6.92、5.03、4.47μmol/L;0.5～20μmol/L地西他滨诱导Kasumi-1细胞凋亡水平较低,但能以剂量依赖的方式阻滞Kasumi-1细胞G2/M期,上调p21WAF1/CIP1基因表达。结论:地西他滨对Kasumi-1细胞具有毒性作用,其机制可能与上调p21WAF1/CIP1表达以及阻滞细胞周期有关。     

肌醇5'磷酸酶基因突变对K562细胞周期蛋白和Akt磷酸化的影响

目的 从分子水平探讨肌醇5'磷酸酶(SHIP)基因突变对人白血病细胞系K562细胞周期及其相关基因表达的影响.方法 应用携带野生型和突变型SHIP及绿色荧光蛋白的慢病毒及空载体慢病毒质粒转染K562细胞,通过流式细胞术检测K562/SHIP细胞转染效率、细胞增殖指数及细胞周期变化;MTT法检测细胞增殖活性改变,实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测SHIP mRNA水平变化,Western blot检测各组K562细胞SHIP、细胞周期蛋白(cyclin)D1、p21WAF1/CIPI、P27KIP1蛋白表达水平及Akt磷酸化变化.结果 野生型SHIP基因能明显抑制K562细胞增殖,并产生明显的G0/G1期阻滞[G0/G1期细胞分别为(34.2±7.8)%和(0.7±8.3)%,P<0.01];但SHIP基因点突变并未影响K562细胞增殖及细胞周期改变[G0/G1期细胞分别为(33.4±4.2)%和(36.3±6.7)%,P>0.05].Western blot结果发现转染野生型SHIP基因后K562细胞Akt磷酸化和cyclin D1表达水平明显下降(P<0.01),p21WAF1/CIPI、p27KIP1表达增高,而突变型SHIP基因对Akt磷酸化水平和细胞周期蛋白表达几乎没有影响(P>0.05).结论 ①野生型SHIP基因通过下调K562细胞Akt磷酸化水平,进而抑制其下游cyclin D1表达,上调p21WAF1/CIPI和p27KIP1基因表达,导致细胞周期阻滞在G0/G1期,抑制K562细胞增殖;②SHIP基因突变体(TTC→CTC,Phe→Leu)丧失了对K562细胞的增殖抑制作用,提示SHIP基因对K562细胞增殖的负调控作用有赖于其基因结构和功能正常.     

丙戊酸抗裸鼠Kasumi-1细胞移植瘤血管新生的作用研究

本研究旨在探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸（VPA）体内、体外抑制急性髓系白血病血管新生及其作用机制。用不同浓度的VPA处理人t（8;21）急性白血病细胞株Kasumi-1细胞3d后用RT-PCR及Westernblot分析细胞Angl、Ang2mRNA及蛋白水平的变化;建立Kasumi-1细胞裸鼠移植瘤模型,采用RT-PCR、Westernblot的方法分析对照组和VPA治疗组瘤组织ang]、Ang2、VEGFmRNA及蛋白水平的变化,免疫组织化学的方法分析瘤组织CD34及Angl、An蛇蛋白水平的改变。结果表明,VPAl-3mmol／L处理3d能够下调Kasumi-1细胞AnglmRNA（3mmol／L组0．040±0．008,对照组O．360±0．116）、Ang2mRNA（3mmol／L组0．146±0．038,对照组0．540±0．049）及蛋白的相对表达,呈浓度依赖性;VPA500mg／kg,ip,处理14d能够明显降低裸鼠瘤组织Angl、Ang2、VEGFmRNA及蛋白的相对表达（P〈0．01）,并能明显减少荷Kasumi-1细胞裸鼠移植瘤微血管密度（8．470±0．3001352．600±O．200）。结论：VPA可能通过调节血管生成素及VEGF的表达,阻碍白血病的血管新生,从而抑制白血病细胞浸润、迁移。     

丙戊酸钠对Molt-4细胞增殖的影响及其作用途径探讨

目的 观察丙戊酸钠(VPA)对人急性T细胞白血病细胞系Molt-4细胞增殖和细胞周期的影响,并探讨其对Molt-4细胞p15INK4B基因甲基化状态的影响.方法 不同浓度VPA作用Molt-4细胞后,用MTr法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞周期的变化,半巢式甲基化特异PCR(MSP)法检测p15INK4B基因甲基化状态,RT-PCR方法检测p15基因、DNA甲基转移酶DNMT-1、DNMT3A、DNMrT3B mRNA的表达.结果 VPA可明显抑制细胞增殖,影响Molt-4细胞周期分布,5.0mmol/L VPA作用Molt-4细胞48 h,G0/G1期细胞为(66.87±3.31)%,S期细胞为(8.47±2.56)%,与未加VPA组相比,S期细胞明显下降,G0/G1期细胞明显升高(P＜0.05).经VPA作用后Molt-4细胞p15基因甲基化程度明显下降,p15基因表达水平明显增加,DNMT-1、DNMT3B mRNA表达水平下降,以DNMT-1下降较明显.结论 VPA可能通过抑制甲基转移酶DNMT-1和(或)DNMT3B表达使p15INK4B基因去甲基化,使p15基因表达上调,从而抑制Molt-4细胞增殖,使细胞周期阻滞于G0/G1期.     

组蛋白脱乙酰化酶抑制剂对Kasumi-1细胞血管新生相关因子表达的影响

目的 研究组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂丙戊酸钠(VPA)及曲古菌素(TSA)对白血病细胞系Kasumi-1细胞血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF受体(KDR或FLK-1)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的影响,探讨其抗白血病血管新生的可能机制.方法 采用RT-PCR及Western blot方法 分析不同浓度VPA、TSA处理Kasumi-1细胞3 d后VEGF及其受体KDR mRNA及蛋白水平的变化,RT-PCR检测bFGF mRNA水平的变化.结果 VPA能够下调VEGF mRNA(3 mmol/L时处理组VEGF121 0.034±0.004、VEGF165 0.015±0.001,对照组分别为0.632±0.014、0.526±0.021)、KDRmRNA(3 mmol/L组0.038±0.000对0.258±0.034)及蛋白的表达,下调bFGF mRNA(3 mmol/L组0.086±0.015对0.228±0.017)的表达;TSA对VEGF、KDR mRNA及蛋白表达的影响与VPA相似,较高浓度的TSA能够下调bFGF mRNA的表达.结论 HDAC抑制剂可能通过调节血管新生相关因子及受体的表达,阻碍白血病患者的血管新生,从而抑制白血病的进展.     

丙戊酸钠诱导Kasumi-1细胞凋亡作用的研究

目的探讨丙戊酸钠(valproic acid sodium,VPA)诱导t(8;21)急性髓系白血病细胞株Kasumi-1细胞凋亡的作用。方法不同浓度VPA处理Kasumi-l细胞后,瑞吉染色观察细胞凋亡形态学的变化,DNA凝胶电泳检测细胞的凋亡变化,分子生物学半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测半胱氨酸天冬氨酸酶7(Caspase7)mRNA表达水平的变化。结果VPA 3 mmol/L处理Kasumi-l细胞5天后,在瑞吉染色普通光学显微镜下观察,细胞出现明显的凋亡形态学变化。DNA凝胶电泳分析,出现了典型梯形DNA条带。不同浓度VPA处理Kasumi-1细胞后,凋亡相关因子Caspase 7的mRNA表达水平的增加,VPA处理3天后,随着剂量的增加,测得的相对灰度值从0.49±0.19升至1.43±0.39。3 mmol/L VPA处理组随着时间的延长,Caspase 7相对灰度值从0.41±0.17升至4.95±0.48,呈时间和剂量依赖性。结论VPA对Kasumi-1细胞有诱导凋亡作用。     

ERK和P38信号转导途径对慢性髓系白血病细胞周期的调控作用

本研究探讨ERK和P38信号转导途径对慢性髓系白血病（CML）细胞周期的调控作用。以RT-PCR、Western blot和FCM方法分别检测CML患者白血病细胞和K562细胞中ERK、p38、cyclin D2、cyclin E、p27的mRNA表达及蛋白表达（其中ERK和P38为磷酸化ERK和磷酸化P38）及细胞周期分布,并分析其相关关系。结果表明：CML患者白血病细胞和K562细胞中ERK、P38、cyclin D2、cyclin E的mRNA表达和蛋白表达增高,P27的表达降低,且cyclin D2蛋白表达与cyclin E、ERK和P38蛋白表达呈正相关（P〈0.01）,与P27蛋白表达呈负相关（P〈0.01）。G0/G1期细胞减少,S期细胞增多,与对照组相比有显著性差异。结论：CML中P38、ERK mRNA表达和活性增加,激活下游的cyclin D2、cyclin E和P27等细胞周期调控因子,致使G0/G1期缩短,细胞快速通过G1/S转换点进入S期,加速细胞周期进程和细胞增殖,导致CML的发生。     

新型青蒿素衍生物SM1044诱导Kasumi-1细胞凋亡及机制的研究

本研究探讨新型水溶性青蒿素衍生物SM1044对人急性髓系白血病M2b细胞株Kasumi-1的诱导凋亡作用及其机制。应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)还原法观察SM1044对细胞生长的抑制作用;Annexin-Ⅴ/PI双标记流式细胞术、PI单标记流式细胞术分别检测细胞凋亡和细胞周期;Western blot检测加药处理后Kasumi-1细胞凋亡相关蛋白Caspase 3、PARP以及融合蛋白AML1-ETO的变化。结果显示:青蒿素衍生物SM1044可抑制Kasumi-1细胞的增殖,其抑制作用呈时间和剂量依赖性;1μmol/L SM1044作用24小时,生长抑制率达到50%,48小时的IC50值为0.17±0.067μmol/L;SM1044通过Caspase依赖的途径诱导Kasumi-1细胞凋亡,细胞凋亡率随药物浓度的增加而增加。细胞周期测定显示,SM1044阻滞细胞周期于G0/G1期,5μmol/LSM1044作用24小时使G0/G1期细胞由(58.33±4.46)%上升为(71.75±2.24)%;Western blot测定显示SM1044促使凋亡相关蛋白cCaspase 3(cleaved Caspase 3)、cPARP(cleaved PARP)表达水平增加,同时融合蛋白AML1-ETO表达降低。结论 :SM1044可有效抑制Kasumi-1细胞增殖,诱导细胞凋亡,该过程与cCaspase 3、cPARP蛋白的表达上调有关。SM1044还能阻滞细胞周期,将Kasumi-1细胞阻滞在G0/G1期;同时SM1044能明显引起融合蛋白AML1-ETO的表达降低,可作为SM1044作用的胞内靶点。     

直流电治疗对人肝癌细胞SMMC7721凋亡的诱导作用

研究电化学治疗对人肝癌细胞系ＳＭＭＣ７７２１凋亡的诱导作用及其机制,为ＥＣＴ治疗的临床应用提供依据。方法采用体外模型研究ＥＣＴ的效应。以ＡｎｎｅｉｎＶ标记法、ＤＮＡ含量测定、电子显微镜等方法观察了ＥＣＴ对人肝癌细胞系ＳＭＭＣ７７２１凋亡的诱导作用及对细胞周期的阻滞效应。     

三丁酸甘油酯诱导白血病细胞分化及凋亡机制的研究

为了探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂三丁酸甘油酯（tributyrin,TB）诱导NB4、K562白血病细胞分化和（或）凋亡的作用机制,利用Western blot方法及逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测TB作用前后NB4、K562细胞组蛋白H3乙酰化水平以及p21^WAF1表达量的改变.结果表明：NB4（或K562）细胞经TB0.1 mmol/L（或TB 0.5 mmol/L）作用16小时后可见组蛋白H3乙酰化水平明显上升,并有剂量依赖效应.NB4、K562细胞经TB 0.1 mmol/L作用后可见p21^WAF1 mRNA表达上调,且具有剂量依赖效应.p21^WAF1 mRNA的这种上调开始于TB作用2小时后,16小时达高峰,可维持48小时.结论：TB诱导NB4、K562细胞发生分化和（或）凋亡的机制与TB引起细胞组蛋白高乙酰化和继而上调p21^WAF1表达有关.     

热休克蛋白90抑制剂诱导Kasumi-1细胞凋亡和分化的机制探讨

目的探讨热休克蛋白90（HSP 90）抑制剂17-丙烯胺-17-去甲氧格尔德霉素（17AAG）诱导白血病细胞生长抑制、分化和凋亡作用.方法应用MTT比色法观察17AAG对白血病细胞系Kasumi-1细胞的生长抑制作用,用流式细胞术分析细胞周期和分化抗原的表达,用Annexin V标记、DNA凝胶电泳和流式细胞术分析细胞凋亡,Western blot检测干细胞因子受体（KIT）蛋白水平,RT-PCR测定c-kit mRNA水平.结果17AAG明显抑制Kasumi-l细胞的生长,半数抑制浓度（IC50）为0.62 μmol/L;17AAG诱导Kasumi-1细胞凋亡呈时间、剂量依赖性,17AAG处理24 h早期凋亡细胞增加,48 h晚期凋亡细胞增加,早期凋亡细胞减少.17AAG可诱导Kasumi-1细胞髓系分化抗原CD11b及CD15表达增加,并呈剂量和时间依赖性.经17AAG作用后细胞阻滞于G0/G1期,伴有S期细胞减少.Western blot检测发现17AAG可降低KIT水平,处理2 h开始减少,处理20 h后KIT基本消失,但c-kit mRNA水平并未受影响.结论HSP 90抑制剂17AAG通过降解KIT蛋白抑制Kasumi-1细胞生长,使细胞阻滞于G0/G1期,诱导其发生凋亡及部分分化.     

三丁酸甘油酯对白血病细胞株SHI-1体外作用的研究

目的　探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂三丁酸甘油酯 (TB)体外诱导白血病细胞株SHI 1生长抑制、分化和凋亡作用 ,并对其作用机制进行初步研究。方法　应用细胞计数、锥虫蓝拒染法观察TB对细胞的生长抑制作用 ,通过细胞形态学观察、NBT还原实验、细胞表面抗原CD11b和CD14的检测、Annexin标记、DNA凝胶电泳等方法分析TB对SHI 1细胞的诱导分化及凋亡作用。通过West ernblot方法及逆转录聚合酶链反应检测TB作用前后细胞组蛋白H3乙酰化水平以及 p2 1WAF1/CIP1表达量的改变。结果　①TB可以抑制SHI 1细胞的增殖及活力 ,呈剂量 时间依赖关系。②TB 0 .1mmol/L可诱导SHI 1细胞发生部分分化 ,NBT阳性率升高 ,细胞表面CD11b、CD14表达上调。③SHI 1经TB 0 .5～ 1.0mmol/L作用 4 8h ,出现典型的凋亡形态学改变。细胞AnnexinⅤ结合力明显上升 ,并可见典型的DNA梯形条带。TB作用后SHI 1细胞组蛋白H3乙酰化水平升高以及 p2 1WAF1/CIP1表达上调。结论　TB能抑制SHI 1细胞的增殖并影响细胞活力 ,诱导SHI 1细胞分化和凋亡 ,其机制与TB引起组蛋白乙酰化水平升高、继而上调 p2 1WAF1表达有关。     

Effects of cisplatin, 5-fluorouracil, and radiation on cell cycle regulation and apoptosis in the hypopharyngeal carcinoma cell line

In head and neck cancer including hypopharyngeal cancer, cisplatin and 5-fluorouracil (5-FU) usually have been used as neoadjuvant chemotherapeutic agents. We investigated the effects of cisplatin, 5-FU and radiation on p53 protein expression and cell responses (cell cycle arrest and/or apoptosis) in the hypopharyngeal carcinoma cell line (PNUH-12; mutant type p53). PNUH-12 cells were treated with cisplatin, 5-FU and radiation. The changes in the cells were assessed by a cell cytotoxicity assay, Western blotting (p53 and p21(WAF1/CIP1) proteins), a DNA fragmentation assay, propidium iodide (PI) staining and DNA flow cytometry. The expression of p53 protein was increased after treatment with cisplatin and 5-FU, but not radiation. The expression of p21(WAF1/CIP1) protein was increased only after treatment with 5-FU, not cisplatin or radiation. With cisplatin and radiation, we observed apoptosis both by DNA fragmentation and PI staining and increased S phase in cisplatin and G2 phase in radiation by DNA flow cytometry. But, with 5-FU, we could not observe apoptosis by DNA fragmentation and PI stain but only an increased G1 phase by DNA flow cytometry. In PNUH-12, radiation induced p53-independent apoptosis and p21(WAF1/CIP1)-independent G2-phase cell cycle arrest. Cisplatin induced p53-dependent apoptosis and p21(WAF1/CIP1)-independent S-phase cell cycle arrest and 5-FU induced p53 and p21(WAF1/CIP1)-dependent G1-phase cell cycle arrest, not apoptosis. Cisplatin and 5-FU induced p53-dependent pathways, but radiation p53-independent pathway. The cell responses by cisplatin, 5-FU and radiation were all different pathways.