肠出血性大肠杆菌O157:H7 z0986-z1444双缺失突变株构建

目的 采用Red重组方法敲除肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7 z0986和z1444基因,构建双缺失突变株.方法 首先构建z0986、z1444打靶片段;其次以电击法转化感受态细胞,之后通过PCR鉴定所得菌株;最终所得阳性单克隆测定生长曲线.结果 z1444单基因缺失突变株(Δz1444/933)及z0986-z1444双基因缺失突变株(Δz0986/Δz1444/933)构建成功,其生长曲线与野生型EHEC O157:H7差异均无统计学意义.结论 z0986与z1444基因缺失对EHEC的生长无影响.构建Δz1444/933及Δz0986/Δz1444/933为深入研究z1444基因的功能及作用机制奠定了基础.     

互隔交链孢酚对NIH3T3细胞PKA-CREB信号通路的影响

目的：探讨互隔交链孢酚（Alternariol,AOH）对小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3中PKA-CREB信号通路的影响.方法：20μmol/L AOH作用NIH3T3细胞1 h,或用PKA特异性抑制剂10μmol/L H89预处理1 h,再进行20μmol/L AOH刺激实验,同时设溶剂对照组.用免疫荧光和免疫细胞化学染色法检测磷酸化PKA催化亚基表达情况,用免疫细胞化学染色法检测磷酸化CREB表达水平.结果：与溶剂对照组相比,AOH诱导NIH3T3细胞中磷酸化PKA催化亚基和磷酸化CREB水平明显增加（P〈0.05）;用PKA特异性抑制剂H89预处理,降低了AOH激活的PKA催化亚基和CREB的磷酸化水平.结论：AOH能够激活NIH3T3细胞中PKA-CREB信号转导通路,这为探讨AOH致癌的分子机制提供依据.     

烟曲霉shol基因对渗透压传导的作用和抗真菌药物敏感性的影响

目的:克隆烟曲霉shol基因,并构建烟曲霉shol基因突变株,了解该基因在烟曲霉应对环境变化中的作用.方法:通过基因同源性比对,在烟曲霉基因组中找出与酿酒酵母shol基因同源的基因,PCR扩增烟曲霉shol基因及其上、下游各约1.0 kb的DNA片段,并将其重组到质粒pDHt/SK2中,再利用pyrG作为筛选标记构建重组质粒.将重组质粒转化炯曲霉AF293.1得到烟曲霉△shol.观察烟曲霉△shol和烟曲霉AF293(野生株,wt)在MM、CM、BHI这3种培养基上的生长速度,测定烟曲霉△shol在含有氯化钠、丙三醇这两种渗透压物质培养基上的生长情况,并比较烟曲霉△shol和wt对常用抗真菌药物的敏感性.结果:烟曲霉△shol在CM、MM、BHI这3种培养基上的生长速度均慢于wt;△shol在含渗透压物质小于1 mol/L的培养基上菌落直径没有明显变化,在含渗透压物质大于1 mol/L的培养基上菌落直径明显变小;烟曲霉△shol和wt对抗真菌药物的敏感性没有差异.结论:shol基因影响炯曲霉的生长速度,与培养基类型没有明显关系.烟曲霉shol基因介导渗透压传导.shol基因对烟曲霉的抗真菌药物敏感性没有影响.     

过氧化氢诱导HUVECs氧化应激模型的构建

目的 利用过氧化氢 (H2O2) 诱导人脐静脉内皮细胞 (human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) 构建体外氧化应激细胞模型.方法 H2O2分6个浓度梯度处理HUVECs不同时间, 倒置显微镜观察细胞形态变化, CCK-8法检测细胞存活率, 流式细胞术检测细胞凋亡率, DCFH-DA荧光探针和流式细胞仪检测细胞内活性氧水平, 筛选H2O2的最佳作用浓度和时间.结果 不同浓度H2O2处理细胞不同时间, 对HUVECs均有损伤作用;400、600、800μmol/L H2O2处理HUVECs 24 h, 细胞存活率显著降低 (P<0.05) , 800μmol/L H2O2作用HUVECs不同时间, 细胞存活率随处理时间延长逐渐降低 (P<0.01) ;各组H2O2处理HUVECs 24 h, 细胞凋亡率显著增加 (1 000μmol/L除外, P<0.05) , 坏死率亦显著增加 (100μmol/L除外, P<0.05) ;800μmol/L H2O2处理HUVECs不同时间, 细胞凋亡率随处理时间延长逐渐增加, 24 h时达到最高 (P<0.05) , 细胞坏死率亦逐渐增加, 48 h时达到最高 (P<0.05) ;各组H2O2作用HUVECs 24 h, 浓度400μmol/L时, 细胞内ROS水平达到最高 (P<0.01) , 800μmol/L H2O2处理HUVECs, 胞内ROS水平随处理时间延长而递增 (P<0.01) .结论800μmol/L H2O2与HUVECs作用24 h可构建体外细胞氧化应激模型.     

烟曲霉sho1基因对渗透压传导的作用和抗真菌药物敏感性的影响

目的：克隆烟曲霉sho1基因,并构建烟曲霉sho1基因突变株,了解该基因在烟曲霉应对环境变化中的作用。方法：通过基因同源性比对,在烟曲霉基因组中找出与酿酒酵母sho1基因同源的基因,PCR扩增烟曲霉sho1基因及其上、下游各约1.0 kb的DNA片段,并将其重组到质粒pDHt/SK2中,再利用pyrG作为筛选标记构建重组质粒。将重组质粒转化烟曲霉AF293.1得到烟曲霉△sho1。观察烟曲霉△sho1和烟曲霉AF293（野生株,wt）在MM、CM、BHI这3种培养基上的生长速度,测定烟曲霉△sho1在含有氯化钠、丙三醇这两种渗透压物质培养基上的生长情况,并比较烟曲霉△sho1和wt对常用抗真菌药物的敏感性。结果：烟曲霉△sho1在CM、MM、BHI这3种培养基上的生长速度均慢于wt;△sho1在含渗透压物质小于1 mol/L的培养基上菌落直径没有明显变化,在含渗透压物质大于1 mol/L的培养基上菌落直径明显变小;烟曲霉△sho1和wt对抗真菌药物的敏感性没有差异。结论：sho1基因影响烟曲霉的生长速度,与培养基类型没有明显关系。烟曲霉sho1基因介导渗透压传导。sho1基因对烟曲霉的抗真菌药物敏感性没有影响。     

烟曲霉感染中肺泡巨噬细胞NF-κb和TNF-α的表达及相关性研究

目的 研究在烟曲霉孢子刺激下大鼠肺泡巨噬细胞(PAM)核转录因子κB(NF-κB)的表达与其释放肿瘤坏死因子α(TNF-α)的关系和意义以及TLR4在其中的作用.方法 应用体外培养的Wistar大鼠PAM,分别加以5×104,1×105和2×105的烟曲霉孢子和/或抗TLR4抗体(5μg),于刺激0.5,1和2 h后用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组中TNF-α和NF-κB的水平.结果 TNF-α仅随烟曲霉孢子的刺激剂量增加和刺激时间的延长而逐渐增高.显著高于阴性对照组(P<0.05),抗TLK4抗体可部分阻断TNF-α的释放.NF-κB在0.5h迅速活化1 h达到峰值,随之逐渐下降,呈现单峰样改变,且呈明显量效关系,抗TLK4抗体可部分阻断NF-κB活化.结论 TLK4介导的NF-κB信号转导途径在烟曲霉孢子诱导大鼠PAM释放TNF-α中起着重要作用.     

结核分支杆菌依赖链霉素的实验观察

目的:调查临床结核菌分离株对链霉素的依赖状况。方法:采用双向匡氏琼脂培养基分离痰结核菌和作结核菌依赖性测定,采用匡氏琼脂培养基检测结核菌耐药性。结果:184例临床分离结核菌株链霉素的依赖情况:含药管结核菌的生长较对照管明显粗大旺盛,且高浓度管菌落数≥低浓度管者占11.41%(21/184);含药管结核菌的生长较对照管明显粗大旺盛,且低浓度管菌落数>高浓度管者占2.72%(5/184);低浓度管结核菌的生长较对照管明显粗大旺盛,而高浓度管菌落数<对照管者占4.35%(8/184);高浓度管结核菌的生长较对照管明显粗大旺盛,而低浓度管菌落数<对照管者占4.35%(8/184)。总计,显示链霉素依赖特征的临床分离株占22.83%(42/184)。结论:约22.8%的结核菌临床分离株显示出链霉素依赖性,并具有不同的依赖特征。     

应用锁定核酸水解探针实时荧光定量PCR检测烟曲霉

目的 建立检测烟曲霉的锁定核酸(LNA)水解探针实时荧光定量PCR(qPCR)方法.方法 实验菌株来自北京同仁医院临床分离曲霉菌株,均通过形态学和DNA测序方法鉴定到种.实验组:烟曲霉48株;对照组:黄曲霉55株、杂色曲霉16株、构巢曲霉10株、聚多曲霉5株、寄生曲霉1株;l临床标本组:已经纯培养出烟曲霉的冻存临床标本,鼻窦炎鼻窦组织标本20份、肺泡灌洗液1份.提取标本的DNA,LNA水解探针qPCR检测炯曲霉特异性β-微管蛋白基因,评价此方法的分析特异性、扩增效率、线性动态范围和检测限.结果 烟曲霉特异性β-微管蛋白基因LNA水解探针qPCR检测烟曲霉方法的分析特异性为100%,扩增效率为98.2%,线性动态范围6个数量级,检测限2.5pg.结论 烟曲霉特异性β-微管蛋白基因LNA水解探针qPCR法能快速、准确地检测烟曲霉,而且此方法易操作、经济实惠,应用前景广阔.

Abstract：

Objective To evaluate the performance of locked nucleic acid(LNA)probe Real-time polymerase chain reaction(PCR)in the detection of Aspergillus fumigatus(A.fumigatus).Methods All clinically cultured isolates of Aspergillus at our hospital were identified by morphology and DNA sequencing assay.The experimental group consists of A.fumigatus(n=48)while the control group Was made up of A.flavus(n=55),A.versicolor(n=16),A.nidulans(n=10),A.sydowii(n=5)and A.parasiticus (n=1).The clinical samples consisted of A.fumigatus sinusitis tissue(n=20)and bronchoalveolar lavage fluid(n=1).DNA was extracted from all samples.A.fumigatus β-tubulin gene Was targeted with LNA probe Real-time PCR assay.LNA probe Real-time PCR was evaluated with regards to specificity,efficiency,linear dynamic range in PCR amplification and limits of detection.Results All clinical samples were positively amplified.The specificity was 100%and the PCR efficiency 98.2%.Linear dynamic range Was at least six orders of magnitude and the limit of detection 2.5 pg.Conclusion LNA probe Real-time PCR is a promisingly accurate assay of rapidly detecting A.fumigatus practically and cost-efficiently.     

三氧化二砷对心肌细胞的毒性及其机制的探讨

目的 探讨三氧化二砷(As2O3)对H9c2心肌细胞株凋亡的诱导及其机制.方法 H9c2细胞培养,不同浓度As2O3干预后,采用MTT、AO/EB染色法、CaspACE检测系统观察细胞存活率、形态并检测凋亡.结果 As2O3(2～10 μmol/L)使H9c2心肌细胞株活力下降;AO/EB染色法观察可见细胞凋亡的特征形态;Caspase-3阻断剂AcDEVD-CHO可以阻断As2O3诱导的凋亡.结论 As2O3诱导的H9c2心肌细胞株凋亡,Caspase-3的激活是其所致凋亡的机制之一.     

来曲唑对子宫肌瘤细胞增殖凋亡及cAMP-PKA信号通路的影响

目的探讨来曲唑对子宫肌瘤细胞增殖凋亡及cAMP-PKA信号通路的影响。方法分离子宫肌瘤细胞,来曲唑(10-7、10-6、10-5mol·L-1)处理48 h。采用CCK-8法检测细胞增殖能力;流式细胞技术检测细胞凋亡; RT-PCR法检测Bcl-2、caspase-3 mRNA表达; WB检测MMP-2、TIMP-2、cAMP、PKA蛋白表达量。结果来曲唑以浓度依赖的方式明显下调细胞增殖,明显增加细胞凋亡（P<0. 05）;来曲唑以浓度依赖的方式明显下调子宫肌瘤细胞bcl-2、MMP-2、cAMP、PKA表达,上调子宫肌瘤细胞caspase-3、TIMP-2表达（P <0. 05）。结论来曲唑可促进细胞凋亡、抑制细胞增殖,影响cAMP-PKA信号通路,且呈现浓度依赖性。