腺病毒载体介导EB病毒潜伏期膜蛋白2A基因转染树突状细胞对其功能的影响

目的 探讨腺病毒载体介导EB病毒（EBV）潜伏期膜蛋白2A（LMP2A）基因转染树突状细胞（DC）对其功能的影响。方法 通过同源重组法构建带有EBV－LMP2A基因的重组腺病毒Ad5-LMP2A，用不同感染滴度（MOI）的Ad5-LMP2A转染成熟的DC，用流式细胞术（FACS）检测DC的LPM 2A蛋白表达细胞百分率及用台盼蓝染色计数DC死亡百分率，选择最佳MOI；用最佳MOI的Ad5-LMP2A转染成熟的DC，FACS检测转染前后DC表面分子CD1a、CD83、CD40、CD80及HLA－DR的变化；并用^3H-TdR掺入法检测转染前后DC刺激同种淋巴细胞增殖能力及荧光定量PCR检测表达IL－12 P40 mRNA等功能的改变。结果 MOI 200为Ad5-LMP2A转染DC的最佳滴度，此时约80％的DC表达LMP2S蛋白及92％以上细胞为活细胞。Ad5-LMP2A转染成熟DC前后对细胞表面共刺激分子及特征性表面标志无影响；转染后的DC仍具有较强的刺激同种异体淋巴细胞增殖能力和表达IL－12 P40 mRNA的功能。结论 腺病毒载体能高效介导EBV LMP2A基因在DC中表达，Ad5-LMP2A转染成熟DC对其功能无明显影响，便于进一步用于EBV相关肿瘤的免疫治疗。     

重组质粒pcDNA3.1-IL-15转染对小鼠骨髓DC上表面分子的表达及功能的影响

目的: 探讨重组质粒pcDNA3. 1 IL- 15对小鼠骨髓树突状细胞(DC)表面共刺激分子的表达及免疫功能的影响。方法: 构建真核表达质粒pcDNA3. 1 IL- 15, 以其转染小鼠骨髓DC。用流式细胞仪检测转染的DC表面CD40、CD80及CD86的表达, 并分析转染的DC刺激脾淋巴细胞中CD4 、CD8 T细胞亚群的变化。用MTT比色法检测转染的DC刺激T细胞增殖的作用。用ELISA法检测T细胞产生IFN- γ的水平。结果: pcDNA3. 1- IL- 15转染的DC表面CD40、CD80及CD86的表达均有不同程度的升高。重组质粒转染的DC可诱导小鼠脾淋巴细胞中CD4 、CD8 T细胞增殖, 但CD4 /CD8 T细胞的比值降低。结论: 重组质粒pcDNA3. 1 -IL- 15转染可提高DC表面共刺激分子的表达并增强其免疫功能。     

重组质粒pchIL-18-MAGE转染树突状细胞疫苗体外杀伤肝癌细胞的研究

目的:探讨重组质粒pch IL-18-MAGE转染DC细胞在体外对肝癌细胞的杀伤作用。方法:构建共表达质粒pchIL-18-MAGE,体外培养树突状细胞,将以上重组质粒转染树突状细胞。RT-PCR和Western blot方法验证IL-18和MAGE-1基因在转染DC中的表达。应用流式细胞术检测转染后DC细胞的表型变化。以转染重组质粒DC刺激的淋巴细胞作为效应细胞,单纯淋巴细胞和未经转染DC刺激的淋巴细胞为对照,检测其对肝癌靶细胞的体外杀伤作用。ELISA法检测INF-γ的分泌。结果:pchIL-18-MAGE转染后DC细胞高表达CD83、CD1a、CD86、CD80、HLA-DR等抗原,表现为成熟DC表型特征。共表达质粒转染的DC细胞诱导的CTL对肝癌细胞杀伤作用最强(P<0.05)。结论:pchIL-18-MAGE转染DC细胞对MAGE+肝癌细胞杀伤作用明显。     

肿瘤特异性TCRαβ基因转染诱导记忆性T细胞分化及其免疫功能的研究

目的研究特异性TCR基因转染T细胞被肿瘤抗原激活后,记忆性T细胞的分化情况,并明确其表型特征和免疫功能。方法密度梯度离心法分离PBMC,重组TCR腺病毒感染T细胞,流式细胞术检测外源TCR表达效率。AFP表位肽刺激T细胞,流式细胞术检测TCR基因转染T细胞经抗原刺激后,记忆性T细胞标志分子表达。MTT法检测T细胞对不同肿瘤细胞株的杀伤活性。Annexin V-PI双染法检测靶细胞凋亡比例。ELISA法检测T细胞作用于靶细胞后IFN-γ与IL-2分泌水平。结果重组腺病毒载体感染3 d后,外源TCR表达比例接近30%。特异性TCR基因转染可有效促进T细胞识别肿瘤抗原后活化,CD45RO+细胞比例逐渐上升至接近50%。CD45RO+细胞以CD62L–CD44+表型为主。此后CD62L+细胞比例逐渐上升。最终出现分群明显的CD62L+CD44+TCM表型细胞。特异性TCR基因转染能够促进T细胞杀伤AFP+靶细胞,诱导靶细胞凋亡,并促进IFN-γ分泌。抗原预先刺激能够进一步增强TCR基因转染T细胞抗肿瘤免疫效应。结论 TCR基因转染能够有效促进T细胞识别肿瘤抗原后活化。经肿瘤抗原预先刺激的TCR基因转染T细胞将启动记忆性T细胞分化,在再次遭遇表达相同抗原的肿瘤细胞时发挥更为强烈的免疫效应。     

腺病毒介导HCN2基因转染对人脂肪干细胞生物学特性的影响

目的:研究腺病毒介导的HCN2基因(Ad.HCN2)转染对人脂肪干细胞(ADSCs)生物学特性的影响.方法:取人脂肪组织分离得到脂肪干细胞并进行体外培养,腺病毒绿色荧光蛋白转染测定最佳感染倍数(MOI)值,Ad.HCN2转染后测量HCN2表达情况,并检测转染后细胞生物学特性的变化.结果:MOI=50为最佳MOI,Ad.HCN2转染后,ADSCs可表达HCN2,且其细胞活力、细胞周期、生长曲线、表面标志及诱导分化能力无明显变化.结论:ADSCs被Ad.HCN2转染后可表达目的基因HCN2,并可保持其生物学特性.     

转染FasL基因树突状细胞诱导异基因小鼠脾脏T细胞凋亡的研究

目的 制备稳定表达FasL蛋白的小鼠骨髓源树突状细胞(dendritic cell,DC)并探讨其诱导异基因小鼠脾脏T细胞凋亡的机理.方法 采用培养基选择法体外培养小鼠骨髓源DC,脂质体法转染FasL基因至小鼠成熟DC,实时定量PCR检测转染前后FasL mRNA的表达,流式细胞仪和免疫蛋白印迹检测转染前后FasL蛋白的表达.异系小鼠静脉分别输注未转染DC、转染空质粒DC和转染FasL的DC,7 d后TdT介导的原位末端标记法(TUNEL)和流式细胞仪检测脾脏中T淋巴细胞凋亡.结果 体外培养可获得成熟的小鼠骨髓源DC,转染FasL基因的DC较未转染DC FasL mRNA和FasL蛋白表达明显升高.对脾脏中T淋巴细胞凋亡的检测发现,转染FasL的DC组凋亡指数(11.67±1.53)明显高于未转染DC组(2.67±0.58)和转染空质粒组(3.33±0.58),P＜0.01.结论 培养基选择法可收获大量骨髓源DC,脂质体转染FasL基因至小鼠骨髓源DC,可以使DC高表达FasL蛋白.转染FasL的DC输注能明显诱导异系小鼠脾脏T淋巴细胞凋亡.     

IL-12基因修饰DC中SOCS1基因沉默对体外诱导特异性CTL的影响

利用重组腺病毒载体pAd CMV/V5-DEST-IL-12转染小鼠骨髓来源的树突状细胞(IL-12/DC),探讨SOCS1基因沉默IL-12/DC在体外诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的效能,及其免疫杀伤肺癌细胞株LLC的能力。采用重组腺病毒介导IL-12基因和SOCS1SiRNA基因共同修饰C57BL/6小鼠骨髓来源的DC,经反复冻融法提取LLC抗原,致敏基因修饰的DC;用ELISA法检测各组DC分泌IL-12和IL-10的水平,及各组DC刺激后的T细胞分泌IFN-γ的水平;MTT法检测DC刺激同源小鼠T细胞的增殖能力,微量细胞毒法检测CTL的活性并收集刺激后的T细胞,流式细胞术分析CD8+/CD4+比例和CD4+CD25+Treg的水平;统计学分析各组间的差异。SOCS1SiRNA和IL-12基因共同修饰能有效下调DC中SOCS1蛋白的表达并上调IL-12蛋白的表达;IL-12的分泌水平也明显高于SOCS1SiRNA或IL-12单基因转染组;基因共同修饰的DC表型更加成熟,能明显促进CTL的增殖和活化,减少Treg的生成;CTL分泌高水平的IFN-γ,产生对LLC特异性的细胞免疫。     

CTLA4-Ig基因修饰的树突状细胞体外对Th1/Th2平衡的影响

目的:探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA4 Ig)基因修饰的树突状细胞(CTLA4 Ig-DCs)体外对Th1/Th2平衡的影响。方法:通过腺病毒载体将目的基因(CTLA4 Ig)转染至小鼠骨髓来源的树突状细胞(DC)。采用流式细胞术(FCM)检测DC表面分子和胞内CTLA4 Ig的表达;采用混合淋巴细胞反应检测DC刺激同种异体T细胞的能力,ELISA法检测DC抗原提呈反应中Th1和Th2类细胞因子IFN-γ和IL-4分泌水平。结果:CTLA4 Ig基因成功转染至DC,转染率约为80%,制备的CTLA4 Ig-DCs稳定表达CTLA4Ig,表面分子CD86呈现低表达;CTLA4 Ig-DCs可有效抑制T细胞增殖,降低抗原提呈反应上清中IFN-γ和IL-4的分泌,并增加IFN-γ/IL-4比值。结论:通过腺病毒将CTLA4 Ig转染DC并且高效表达,可有效降低DC表面CD86分子,抑制同种异体T细胞反应,并能影响体外Th1/Th2水平。     

IL-10基因修饰的大鼠树突状细胞表型分析及生物学特性的研究

目的研究IL-10基因修饰后的大鼠树突状细胞(DC)的表型及其生物学特性。方法以含IL-10基因的重组腺病毒载体体外转染大鼠骨髓来源的DC,Western blot测定转染后各组DC中IL-10蛋白的表达,流式细胞仪检测各组DC表面抗原CD83、CD86分子的表达情况,混合淋巴细胞反应法测定各组DC刺激同种异体T细胞增殖的能力。结果 IL-10基因修饰组DC可检测到IL-10高表达,表面抗原CD83、CD86低表达,其刺激T淋巴细胞增殖水平较其他各组低。结论 IL-10基因修饰的DC可有效的表达有功能的IL-10,为研究IL-10修饰的DC诱导同种异体移植免疫耐受奠定了基础。     

小鼠肝癌总RNA转染的树突状细胞体外诱导特异性细胞毒T淋巴细胞的研究

目的 :探讨小鼠骨髓树突状细胞 (dendriticcell,DC)体外经Hepa 1 6肝癌细胞株总RNA转染后 ,对特异性细胞毒T淋巴细胞 (CTL)的诱导作用。方法 :自小鼠骨髓分离DC前体细胞 ,经GM CSF IL 4培养、扩增 ;制备Hepa 1 6小鼠肝癌细胞株总RNA ,体外转染DC ,检测DC诱导同基因型小鼠T细胞增殖及其特异性CTL的反应能力。结果 :经Hepa 1 6肝癌细胞总RNA转染的DC ,其组织相容性分子 (MHC I、II)及共刺激分子 (B7 1 、B7 2 )表达明显增高 ,刺激同基因型小鼠T细胞增殖能力增强 ,且能诱导Hepa 1 6特异性CTL。结论 :以肝癌总RNA转染DC ,构造肝癌疫苗为肝癌的临床治疗提供了新的策略。