RNA干扰沉默雷帕霉素靶蛋白基因表达对血管平滑肌细胞增殖活性的影响

目的 构建靶向雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的RNA干扰表达载体，观察其对血管平滑肌细胞（VSMC）增殖活性的影响。方法 根据大鼠mTOR基因序列设计2个短发夹环RNA（shRNA）序列，化学法合成单链寡核苷酸序列，将cDNA序列插入逆转录病毒载体pLXIN，脂质体介导转染包装细胞PT67后获得mTOR的重组逆转录病毒shRNA表达载体，感染VSMC，Northern blot和Western blot法检测mTOR及其下游底物真核细胞启动子4E结合蛋白（4E-BP1）、p70s6k等表达的变化，流式细胞仪检测VSMC细胞周期的变化，噻唑蓝（MTT）法检测VSMC增殖活性的改变。结果 shRNA序列插入pLXIN载体并感染VSMC，证实其能够显著抑制mTOR的mRNA和蛋白产物表达，mTOR通路下游的核糖体蛋白S6激酶（p70s6k）表达相应减少，而4E-BP1的表达却显著增强；感染前VSMC细胞G1／Go期比例为71％，S期为15％，凋亡细胞为2％；转染后72h，G1／岛期比例为87％，S期为6％，凋亡细胞为6％（P＜0．01）；表明G0／G1→S过程受阻，VSMC的分裂、增殖受到抑制，凋亡机制启动，更多细胞停滞在G0／G1期。结论 成功构建靶向mTOR基因的shRNA表达载体，能够明显抑制VSMC分裂、分化和增殖。     

RNA干扰沉默蛋白激酶B基因表达对血管平滑肌细胞增殖活性的影响

目的 构建靶向蛋白激酶B（PKB／Akt）基因的逆转录病毒RNA干扰表达载体，观察其对血管平滑肌细胞（VSMC）增殖活性的影响。方法 针对大鼠PKB／Akt基因序列（NM_033230）设计多个短发夹环RNA（shRNA）序列，化学合成法合成单链寡核苷酸序列，pGEM—T载体克隆后双酶切，将cDNA序列插入逆转录病毒载体pLXIN，脂质体介导转染包装细胞PT67后获得PKB／Akt的重组逆转录病毒RNA干扰载体，感染血管平滑肌细胞（VSMC），Northern blot和Western blot法检测Akt及其下游底物-核糖体蛋白S6激酶（p70s6k）等表达的变化，流式细胞仪检测VSMC细胞周期的变化，噻唑盐（MTT）比色法检测VSMC增殖活性的改变。结果 shRNA序列经T载体克隆，酶切确定该片段为PKB／Akt基因shRNA序列；感染VSMC，证实其能够显著抑制PKB／Akt的mR—NA和蛋白产物表达，下游的p70s6k表达相应减少；被感染VSMC的分裂、增殖过程受阻，更多细胞停滞在C0／G1期。结论 成功构建PKB／Akt基因逆转录病毒shRNA载体，感染VSMC能够明显抑制其分裂、分化和增殖。     

雷帕霉素靶蛋白反义RNA真核表达载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的构建雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的反义RNA真核表达载体，观察其对血管平滑肌细胞（VSMC）功能的影响。方法提取人VSMC总RNA，逆转录．聚合酶链反应（RT-PCR）扩增mTOR基因cDNA序列，经pGEM-T载体克隆后双酶切，将cDNA序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGP-C1，转染VSMC，Westernblot法检测反义表达载体对mTOR蛋白表达的影响，流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果经RT-PCR获得664bp产物，T载体克隆后，酶切确定该片段为mTOR基因cDNA，进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-mTOR，测序证明序列正确后转染VSMC，证实其能够显著抑制mTOR蛋白产物表达，转染72h的mTOR蛋白产物表达抑制率达82％，S期细胞由15％降低为7％，凋亡细胞增至9％。VSMC增殖过程在Gx／Go期→S期受阻。结论成功构建mTOR基因的反义RNA真核表达载体。     

纳米粒子介导反义mTOR基因转染抑制移植静脉内膜增生

目的:观察以纳米粒子为载体的外源性反义雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因局部转染对移植静脉内膜增生的影响。方法:应用聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)和聚乙烯醇(PVA)包载mTOR基因，制备纳米级粒子混合物。建立自体静脉移植模型72只，随机分成转基因组(转染以纳米粒子为载体的反义mTOR基因)，空载体组(单纯转染纳米粒子包载的空载体)和对照组(不予特殊处理)。分别于术后3，7，14，28d取材。检测mTOR基因的mRNA及蛋白产物表达，以及血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡的动态变化。 结果:转基因组内膜中mTOR基因的mRNA及蛋白产物表达较其他两组明显减少(P<0.05)；转基因组内膜增生厚度于7，14，28d较其他组明显减少(P<0.01)；转基因组凋亡细胞较其他组明显增高(P<0.05)。结论:纳米粒子可以作为转基因载体。反义mTOR基因的表达能有效抑制自体移植静脉内膜的增生及促进VSMC凋亡。     

靶向Pik3cb RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的探讨靶向磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）p110β亚单位的短发卡RNA质粒（pU6-Pik3cb-shRNA）对大鼠胸主动脉平滑肌细胞（VSMC）增殖的影响。方法构建质粒表达载体pU6-Pik3cb-shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2,经脂质体介导转染大鼠VSMC,分7组：A组：VSMC细胞;B组：转染质粒pU6-Pik3cb-shRNA-1;C组：转染质粒pU6-Pik3cb-shRNA-2;D组：转染质粒pU6-Pik3cb-shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2各半量;E组：转染阴性对照无序质粒HK;F组：转染阴性对照空质粒;G组：阳性对照渥曼青霉素,应用荧光定量PCR检测VSMC中Pik3cb mRNA的表达, Western blot检测VSMC中PI3K下游蛋白Akt和mTOR表达的变化;CCK-8法检测pU6-Pik3cb-shRNA对大鼠VSMC增殖的影响;免疫荧光法检测各组细胞中PCNA的表达。结果48 h时B组、C组、D组中Pik3cb mRNA表达分别降低了75．5％、53．6％和65．8％,与对照组相比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。B组、C组、D组中PI3K下游分子磷酸化Akt和mTOR表达均下调,CCK-8结果显示pU6-Pik3cb-shRNA抑制VSMC的生长,免疫荧光结果显示B组、C组、D组中PCNA的表达明显下调。结论pU6-Pik3cb-shRNA能够有效下调Pik3cb mRNA和PI3K下游效应分子磷酸化Akt和mTOR的表达,抑制VSMC增殖。     

反义K-ras基因对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨反义K-ras癌基因对胰腺癌细胞增殖和凋亡及Fas/FasL、Bcl-2、Bax表达的影响.方法 将重组逆转录病毒载体pLXSN转染包装细胞PT-67,获得重组逆转录病毒.在细胞和动物水平将该重组逆转录病毒分别感染PC-3和BxPC-3胰腺癌细胞,经G418筛选获得稳定细胞系,应用MTT、流式细胞仪和免疫组化法分别研究其增殖、凋亡及其相关基因表达情况.结果 成功制备含反义K-ras基因的重组逆转录病毒.感染含反义K-ras基因重组病毒后,胰腺癌PC-3细胞和移植瘤(有K-ras基因第12密码子点突变GGT→GTT)增殖受到抑制,G<,0/1>期细胞增加而S期细胞明显减少,细胞凋亡增加.免疫组化显示含反义K-ras癌基因逆转录病毒感染后PC-3细胞Bax/Bcl-2比值升高,Fas表达上调.结论 反义K-ras基因可使胰腺癌细胞及移植瘤增殖受到抑制,并可通过上调Bax/Bcl一2比值和(或)促进Fas表达诱导细胞凋亡.     

长链非编码RNA BCAR4对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响及机制

目的:探讨长链非编码RNA BCAR4(LncRNA BCAR4)在胰腺癌细胞中的表达以及对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法:用qRT-PCR检测胰腺癌细胞系(AsPC-1、HPAC、BxPC-3、Panc-1)和正常胰腺导管上皮细胞系HPDE6-C7中LncRNA BCAR4的表达。将胰腺癌AsPC-1细胞分别转染BCAR4 siRNA序列和阴性对照siRNA序列,以无转染的AsPC-1细胞为空白对照,用CCK-8和流式细胞术检测细胞的增殖和凋亡,Western blot检测细胞中mTOR与P70S6K及磷酸化mTOR(p-mTOR)与磷酸化P70S6K(p-P70S6K)蛋白的表达。结果:LncRNA BCAR4在各胰腺癌细胞系中的相对表达量均明显高于正常胰腺导管上皮细胞系HPDE6-C7(均P0.05);AsPC-1细胞转染BCAR4 siRNA后表现为增殖能力明显降低、凋亡率明显升高、p-mTOR及p-P70S6K蛋白相对表达量明显降低(均P0.05)。结论:LncRNA BCAR4在胰腺癌细胞中表达升高,LncRNA BCAR4的高表达可促进胰腺癌细胞增殖抑制凋亡,机制可能与LncRNA BCAR4上调mTOR/P70S6K通路的磷酸化水平有关。     

反义雷帕霉素靶蛋白基因局部转染对移植静脉内膜增生的影响

目的:观察以纳米粒子为载体的反义雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因局部转染对移植静脉内膜增生的影响。方法:应用聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)和聚乙烯醇(PVA)包载mTOR基因,制备纳米级粒子混合物。检测其包埋率、体外释放情况及粒子大小。建立自体静脉移植模型,随机分成转基因组、空载体组、对照组。转基因组移植静脉转染以纳米粒子为载体的反义mTOR基因,空载体组单纯转染纳米粒子包载的空载体,对照组不予特殊处理。分别于术后3d、7d、14d、28d取材,常规HE、Verhoeff染色,RT-PCR、Westernblot检测mTOR基因的mRNA及蛋白的变化,TUNEL法观察血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡的动态变化。结果:转基因组内膜中mTOR基因的mRNA及蛋白产物表达较其他两组明显减少(P<0.05);转基因组内膜增生厚度7d、14d、28d较其他组明显减少(P<0.01);转基因组凋亡细胞较其他组明显增高(P<0.05)。结论:纳米粒子可以作为转基因载体,反义mTOR基因的表达能够有效抑制自体移植静脉内膜的增生,促进VSMC的凋亡。     

内源性转化生长因子β1对膀胱癌细胞体外生长的影响

目的：研究内源性转化生长因子β1（TGFβ1）对膀胱癌细胞增殖的影响及机制。方法：构建携TGFβ1反义RNA的复制缺陷型逆转录病毒载体pRevTβ-AS，转染膀胱癌EJ细胞株，观察抑制内源性TGFβ1表达对EJ细胞体外增殖的影响；流式细胞仪分析转染后细胞周期时相分布的改变。结果：将TGFβ1反义RNA导入EJ细胞并有效表达；抑制TGFβ1表达可以降低靶细胞的生长速度和克隆形成率，使细胞增殖指数下降12％；反义RNA转染的EJ细胞G0和G1期细胞占65．7％，高于对照组细胞，S期细胞占20．5％，低于对照组细胞。结论：内源性TGFβ1通过诱导膀胱癌细胞G1→S期转换，促进肿瘤细胞体外增殖。     

纳米粒子包载反义雷帕霉素靶蛋白基因转染对移植静脉内膜增生的影响

目的观察纳米粒子包载的反义雷帕霉素靶蛋白（mTOR）基因局部转染对移植静脉内膜增生的影响。方法应用聚乳酸聚乙醇酸共聚物（PLGA）和聚乙烯醇（PVA）包载mTOR基因。建立自体静脉移植模型，随机分成转基因组、空载体组、对照组。转基因组移植静脉转染纳米粒子包载的反义mTOR基因，空载体组单纯转染纳米粒子包载的空载体，对照组不予特殊处理。分别于移植3、7、14、28d取材，常规苏木素．伊红（HE）、Verhoeff染色，检测mTOR基因的mRNA及蛋白产物表达的变化，TUNEL法观察血管平滑肌细胞（VSMC）凋亡的动态变化。结果转基因组内膜中mTOR基因的mRNA及蛋白产物表达明显减少（P〈0．01）；转基因组内膜增生程度在术后7、14、28d较其他组明显减少（P〈0．01）；转基因组凋亡细胞明显增多（P〈0．01）。结论纳米粒子可以作为基因载体，反义mTOR基因的表达能够抑制移植静脉内膜的增生，促进VSMC凋亡。     

雷帕霉素靶蛋白及其底物在自体移植静脉中的表达及意义

目的研究雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）及其底物——核糖体蛋白s6激酶（p70s6k）、真核细胞启动子4E结合蛋白1（4E—BP1）在自体移植静脉中表达的动态变化规律,探讨其与内膜增生的关系及意义。方法Wistar大鼠64只,建立自体静脉移植模型,随机分为8组,分别在移植后6h,1、3d,1、2…468周切取移植静脉。逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）联合原位杂交方法检测移植血管中mTOR及其底物pT0s6k和4E—BPI的mRNA表达,Western蛋白印迹或免疫组化方法检测mTOR、pT0s6k和4E—BP1的蛋白产物表达,同时检测增殖细胞核抗原（PCNA）的表达。结果静脉移植1—3d即出现mTOR和pT0s6k的mRNA表达增强,3d-2周达到高峰,与其他组比较差异有统计学意义（P〈0．01）,6—8周逐渐恢复正常;而4E—BP1的mRNA表达在移植后1d开始降低,1周表达最低,之后表达开始增强,4～6周为表达高峰,与其他组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。Western蛋白印迹提示mTOR和pT0s6k蛋白产物在移植后1周表达明显增加,2～4周达到高峰,8周恢复至正常水平;而4E—BP1蛋白产物在移植后1周表达最少,4—6周增加达到高峰,8周仍维持一定的表达量。原位杂交及免疫组化结果提示阳性细胞多定位于移植静脉新生内膜和中膜血管平滑肌细胞,mTOR及其底物与PCNA分布基本一致。结论mTOR信号通路在血管移植后即被激活并与内膜增生关系密切,可能成为防治移植血管狭窄、闭塞的有效靶点。     

罗格列酮对人多囊肾囊肿衬里上皮细胞增殖的抑制作用

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）激动剂罗格列酮对常染色体显性遗传性多囊肾病（ADPKD）囊肿衬里上皮细胞增殖的抑制作用及其机制。 方法 MTT法检测罗格列酮对ADPKD囊肿衬里上皮细胞系（WT9-12）细胞增殖的作用;流式细胞术检测罗格列酮对WT9-12细胞周期及凋亡的影响;Western印迹法检测罗格列酮对哺乳类动物的雷帕霉素靶蛋白（mTOR）-p70核糖体S6激酶（p70S6K）信号通路的影响。给予PPARγ特异性抑制剂GW9662及PPARγ siRNA瞬时转染WT9-12细胞,检测罗格列酮对细胞增殖及对mTOR信号通路的作用是否为PPARγ依赖性的。 结果 罗格列酮抑制WT9-12细胞增殖,此作用在0~200 &#61549;mol/L范围内呈剂量依赖性及时间依赖性,作用72 h的50%抑制率浓度为100 &#61549;mol/L。细胞周期分析显示,罗格列酮（50、100 &#61549;mol/L）作用后,G0/G1期细胞较对照组显著增多（65.43%、64.02%比49.65%,P ＜ 0.05）。50、100 &#61549;mol/L罗格列酮对细胞凋亡影响不大,高浓度（200 &#61549;mol/L）罗格列酮可使凋亡细胞达6%（正常对照组为4%）。罗格列酮可呈时间及剂量依赖性下调WT9-12细胞p70S6K磷酸化表达,而对mTOR及其另一个下游4E结合蛋白1（4E-BP1）磷酸化水平无明显影响。加入GW9662及转染PPARγ siRNA阻断PPARγ表达后,可部分阻断罗格列酮对p70S6K磷酸化的影响（P ＜ 0.01）。 结论 罗格列酮可抑制ADPKD囊肿衬里上皮细胞增殖和阻滞细胞周期,可不依赖于mTOR途径直接下调p70S6K磷酸化表达。罗格列酮对ADPKD囊肿衬里上皮细胞p70S6K磷酸化的影响是PPARγ依赖性的。     

Significance of 4E-binding protein 1 as a therapeutic target for invasive urothelial carcinoma of the bladder

BackgroundTo evaluate the expression of multiple molecular markers involved in the mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling pathway in human muscle-invasive bladder cancer (BC) and to assess the therapeutic efficacies of mTOR inhibitors in human BC KoTCC-1 cells.MethodsExpression levels of 5 markers, including PTEN, phosphorylated (p)-Akt, p-mTOR, p-p70 ribosomal S6 kinase, and p-4E-binding protein 1 (4E-BP1), were measured in radical cystectomy specimens from 49 patients with muscle-invasive BC by immunohistochemical staining. We then analyzed the effects of treatment with temsirolimus or Ku-0063794, a dual inhibitor of mTOR complex 1 (C1) and mTOR complex 2 (C2), on changes in the growth and expression profiles of 5 mTOR-associated markers in KoTCC-1 cells.ResultsDuring the follow-up period of this study, disease recurred in 27 patients (55.1%), and of several factors examined, the expression level of p-4E-BP1 in addition to the pathological T stage was independently related to recurrence-free survival on multivariate analysis. Although the growth of KoTCC-1 cells was inhibited by both temsirolimus and Ku-0063794 in dose-dependent manners, treatment with Ku-0063794 resulted in a marked decrease in the expression of p-4E-BP1 in KoTCC-1 cells compared with that with temsirolimus. Furthermore, the growth-inhibitory effect of both mTOR inhibitors was shown to be proportional to the expression levels of p-4E-BP1.ConclusionsThe phosphorylation status of 4E-BP1 appeared to be correlated with the prognosis of patients with muscle-invasive BC following radical cystectomy as well as the sensitivities of BC cells to mTOR inhibitors; therefore, the inactivation of 4E-BP1 using Ku-0063794 may be a promising novel approach for muscle-invasive BC.     

p27kip1基因逆转录病毒载体的构建及其对人胃癌细胞系生长抑制作用的研究

目的：研究逆转录病毒介导的p27^kip1基因过度表达对细胞周期和细胞增殖的影响。方法：构建含人p27^kip1基因的逆转录病毒真核表达载体，应用脂质体介导法，将外源性p27^kip1基因转染人胃癌细胞系BGC－823，应用Western blot,FCM等方法，检测p27^kip1蛋白在胃癌细胞内的表达及其对细菌胶殖的影响。结果：获得含人p27^kip1 cDNA的重组逆转录病毒载体，外源性野生型p27^kip1基因整合于胃癌细胞并获稳定表达，细胞生长速度受抑制，同时出现G1期阻滞。结论：构建的p27^kip1重组逆转录病毒能有效介导外源性p27^kip1在人胃癌细胞系中高表达，抑制细胞增殖，为进一步研究以p27^kip1为目的基因的肿瘤基因治疗奠定了基础。