建鲤重组Cystatin蛋白的原核表达、鉴定及多克隆抗体制备

目的：对建鲤半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CPIs)Cystatin进行原核表达和纯化鉴定,并以重组Cystatin为抗原制备多克隆抗体。方法：用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导转入pET-30a-Cystatin的E.coli BL21（DE3）表达重组蛋白,经过Ni2+-NTA镍离子亲和层析纯化重组Cystatin,高效液相色谱鉴定重组Cystatin的纯度,Azocasein法测定其对木瓜蛋白酶的抑制作用。利用QuickAntibody-Mouse5W快速佐剂和纯化的重组Cystatin免疫Balb/C小鼠获得抗血清,采用夹心ELISA法鉴定抗血清的效价,Western blotting和免疫组织化学法鉴定抗血清的抗原识别特异性。结果：原核表达的目的蛋白相对分子质量约20 000;镍亲和层析纯化后重组Cystain在SDS-PAGE上显示单一条带,纯度>95%;Azocasein法检测,0.014 μg重组Cystain抑制木瓜蛋白酶活性达50%以上;ELISA夹心法检测获得的Cystatin抗血清效价达到1∶512 000;Western blotting检测,转入pET-30a空质粒的全菌蛋白中未检测到Cystatin存在,而在转入pET-30a-Cystatin的全菌蛋白及纯化各步样品中均检测到Cystatin信号,且均为单一条带;免疫组织化学检测,建鲤各组织呈现不同强度的Cystatin阳性染色,抗血清中的多克隆抗体与原核和真核表达的Cystatin均特异性结合。结论：成功表达和纯化了建鲤Cystatin;获得含高效价多克隆抗体的Cystatin抗血清,具有高特异性和灵敏性。     

大鼠神经球蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的 克隆Wistar大鼠神经球蛋白(NGB)基因,通过原核表达制备其多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础.方法 从雄性Wistar大鼠脑组织中提取总RNA,经逆转录PCR得到cDNA,测序证明该基因序列正确后,亚克隆人pET-28a( )载体中,通过双酶切和测序确定序列和阅读框正确.转化大肠杆菌BL21菌株,获得可溶性表达产物,经鉴定、纯化后免疫新西兰兔,分离血清,ELISA法测定抗体效价.结果 神经球蛋白多克隆抗体效价达1:100 000,此多抗可以与293细胞内表达的重组蛋白发生很好的抗原抗体反应.结论 成功制备了兔抗NGB的多抗,为后续研究提供了重要的实验材料.     

小鼠Foxp3蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:体外原核表达小鼠Foxp3蛋白,并以其免疫家兔,制备多克隆抗体。方法:从质粒Foxp3-pMD-18T扩增小鼠Foxp3全长基因,亚克隆至原核表达载体pET-32 a,转化E.coliBL-21;IPTG诱导表达目的蛋白,N i2 -NTA柱纯化及蛋白质印迹鉴定蛋白;纯化蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体,ELISA法检测抗体效价,蛋白质印迹检测抗体特异性。结果:成功构建了Foxp3-pET-32 a原核表达载体,表达和纯化了目的蛋白;ELISA法检测抗体效价为1∶20 000,蛋白质印迹检测结果显示抗体特异性与小鼠Foxp3蛋白结合。结论:成功表达小鼠Foxp3蛋白并制备了多克隆抗体。     

hErmin160蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的:对hErmin氨基端160个氨基酸(hErmin160)蛋白进行表达、鉴定和纯化并制备其多克隆抗体,为研究hEr-min功能奠定基础.方法:PCR扩增编码hErmin160的核苷酸序列,克隆入原核表达载体pET41-b( ),转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,诱导表达hErmin160融合蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Western Blot进行鉴定,经镍柱纯化后,免疫家兔,制备其多克隆抗体,并对免疫后抗血清进行亲和纯化,用Western-Blot检测抗体纯化的效果.结果:测序证实获得hEr-min氨基端前160个氨基酸的编码序列;SDS-PAGE分析表明,表达产物的相对分子质量为51 ku,与理论值相符;灰度扫描分析hErmin160融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的10%,纯化产物纯度达92%;Western Blot确认所表达的蛋白;抗血清和纯化后的多克隆抗体Westerm Blot反应均为阳性.结论:利用大肠杆菌融合表达系统,获得了较高纯度的可溶形式hErmin160融合蛋白,并通过亲和纯化成功制备hEr-min160多克隆抗体.     

人LINGO-1aa76-319蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的 表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的人LINGO-1胞外段(hLINGO-1_(aa76-319))融合蛋白,并制备兔源性抗hLINGO-1_(aa76-319)的多克隆抗体(pAb).方法 利用PCR从pCMV-SPORT6获得hLINGO-1_(aa76-319)编码序列,将其亚克隆至原核表达载体pET30a(+),构建重组表达质粒pET30a(+)-hLINGO-1_(aa76-319);将阳性重组质粒转化大肠杆菌,IPTG诱导表达6×His-hLINGO-1_(aa76-319)融合蛋白,经Ni-NTA螯合树脂纯化,纯化蛋白免疫新两兰大白兔制备多克隆抗血清,Protein A Sepharose柱纯化获得多抗,ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体特异性.结果 成功构建了pET30a(+)-hLINGO-1_(aa76-319)原核表达载体,原核蛋白hLINGO-1_(aa76-319)以包涵体形式在大肠杆菌高水平表达,通过复性与亲和层析获得纯度在90% 以上的hLINGO-1_(aa76-319)蛋白,蛋白浓度为4600 mg/L,制备的抗hLINGO-1_(aa76-319)多抗效价高达1:1.6×106,Western blotting鉴定其具有良好的特异性.结论 获得高纯度hLINGO-1_(aa76-319)蛋白并成功制备特异性pAb,为进一步研究LINGO-1的生物学功能提供实验基础.

Abstract：

Objective To express and purify the fusion protein of extracellular domain of human Ig domain-containing, neurite outgrowth inhibitor (Nogo) receptor-interacting protein-1 (LINGO-1_(aa76-319)) in prokaryotic cells and prepare the rabbit anti-LINGO-1 polyclonal antibody (pAb). Methods The 732 bp DNA sequence of hLINGO-1_(aa76-319), was obtained from pCMV-SPORT6 by PCR and inserted into pET30a (+) plasmid to construct the prokaryotic expression plasmid pET30a(+) -hLINGO-1_(aa76-319) which was subsequently transformed into E.coli. The target fusion protein was expressed with IPTG induction and purified by Ni~(2+)-NTA affinity chromatography column. The antiserum against hLINGO-1_(aa76-319) was obtained from the rabbits immunized with hLINGO-1 _(aa76-319), and the titer of the pAb was determined using enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and its specificity identified using Western blotting. Results The prokaryotic expression plasmid pET30a (+)-hLINGO-1_(aa76-319) was constructed successfully. Efficient expression of the target fusion protein was achieved with IPTG induction at the optimal concentration of 0.4 mmol/L and culture temperature at 37 ℃ for 2.5 h. The hLINGO-1_(aa76-319) fusion protein was effectively expressed in E.coli as inclusion bodies, and the soluble protein was obtained through denaturation and refolding procedures, and the purified fusion protein showed a purity above 90%. The titer of the anti-hLINGO-1_(aa76-319) pAb obtained by immunizing the rabbits with the purified protein reached l:1.6×10~6, and Western blotting confirmed its good specificity. Conclusion The fusion protein hLINGO-1_(aa76-319) with high purity has been obtained and the anti-hLINGO-1_(aa76-319) pAb obtained shows a high titer and good specificity, which provide important experimental basis for further functional investigation of LINGO-1.     

大鼠ANT1蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

目的：表达和纯化大鼠腺苷酸转运体（ANT1）蛋白并制备其多克隆抗体.方法：通过PCR扩增大鼠脑组织中ANT1的编码区序列,构建ANT基因重组载pET28a-ANT1,转化至E. coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达,Ni2＋-NTA离子交换树脂层析纯化;纯化的ANT1蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并亲和纯化,并通过Western Blot法鉴定其特异性.结果：成功构建重组质粒pET28a-ANT1,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达了Mr约为32×10^3的目的蛋白;亲和层析纯化后免疫的新西兰大白兔获得其多克隆抗体;曝光后胶片上均可见Mr32×10^3的阳性条带,与纯化的大鼠ANT1重组蛋白处于同一水平,表明纯化的抗ANT多克隆抗体具有高度的特异性.结论：利用基因重组技术,在大肠杆菌中成功表达了大鼠ANT1融合蛋白并制备了其多克隆抗体,为研究腺苷酸转运体蛋白在癫痫发病过程中的作用机制奠定了基础.     

Flt3的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

Flt3(fms-like receptor tyrosine kinases)又称FLK-2(foetal liver kinase2)、STK-1(stem cell tyrosine kinase 1),为Ⅲ型受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTK)成员之一,在血细胞中表达仅限于造血干/祖细胞表面,与其配体在正常造血及免疫系统发育中起重要的调节作用.     

携带跨膜信号的凋亡蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的构建携带跨膜信号序列的凋亡蛋白（apoptin）的原核表达载体PET-28a（＋）-apoptin,诱导表达并纯化重组apoptin蛋白,制备多克隆抗体。方法用多重PCR的方法扩增跨膜信号序列（PTD）及apoptin的编码序列,构建原核表达载体PET-28a（＋）-PTD-apoptin,转化大肠杆菌BL21（DE3）,低温条件下IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE方法鉴定蛋白表达,经镍亲和层析方法纯化目的蛋白后,免疫BALB／c小鼠,制备多克隆抗体。结果DNA测序鉴定表明成功构建了原核表达载体PET-28a（＋）-PTD-apoptin,该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经低温和IPTG诱导后,获得重组apoptin蛋白,制备的多克隆抗体经ELISA方法和免疫印迹法证实能特异性地识别apoptin。结论成功获得了携带跨膜信号序列的重组蛋白apoptin及其多克隆抗体,为进一步研究其特异性诱导肿瘤细胞凋亡功能及相关机制奠定了基础。     

人Tenascin-Raa454-1069蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的 表达和纯化带多聚组氨酸（6×His）标签的人Tenascin-R EGFL结构域（Tenascin-Raa454-1069）的融合蛋白,并制备相应的兔源性多克隆抗体（pAb）。方法 利用PCR从PMD18-T-TNR获得Tenascin-Raa454-1069编码序列,将其亚克隆至原核表达载体pET30a(+),构建重组表达质粒pET30a(+)-Tenascin-Raa454-1069;将阳性重组质粒转化大肠杆菌,IPTG诱导表达6×His-Tenascin-Raa454-1069融合蛋白,经Ni-NTA螯合树脂纯化,纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗血清, Protein A Sepharose柱纯化获得多抗,ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体特异性。结果 成功构建了pET30a(+)-Tenascin-Raa454-1069原核表达载体,原核蛋白Tenascin-Raa454-1069以包涵体形式在大肠杆菌高水平表达,通过复性与亲和层析获得纯度在90%以上的融合蛋白,蛋白浓度为1 600mg/L,制备的抗Tenascin-Raa454-1069多抗效价高达1∶1.6 ×106,Western blot鉴定其具有良好的特异性。结论 获得高纯度Tenascin-Raa454-1069蛋白并成功制备特异性pAb,为进一步研究Tenascin-R的生物学功能提供实验基础。     

胞嘧啶脱氨酶的原核表达和多克隆抗体的制备

目的：在原核系统中表达并纯化大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase,CD)，制备鼠抗大肠杆菌CD多克隆抗体，方法：亚克隆CD基因到原核表达载体pMAL-c2和pBV222中，并转化入大肠杆菌DH5α内，诱导表达并纯化MBP-CD和6his-CD融合蛋白，用纯化的MBP-CD融合蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。结果：通过重组质粒的酶切筛选出重组阳性克隆，成功地表达和纯化出MBP-CD和6his-CD融合蛋白，用纯化的MBP-CD成功制备了鼠抗CD多克隆抗体，并用6his-CD和GST-CD重组蛋白进行Western印迹分析，证实了抗体的正确性，结论：应用多克隆抗体可以检测体内外CD基因的表达，为临床前和临床上深入开展CD基因的生物治疗研究提供重要的实验材料。     

BTBD10基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的 克隆和表达BTBD10基因,为进一步研究BTBD 10与胰岛细胞增殖功能提供工具.方法 制备兔抗BTBD10多克隆抗体,利用PCR方法扩增BTBD10全长,经Bam H I和Sal I酶切后连接入pET32a原核表达载体,将重组表达质粒pET32a-BTBD 10转化大肠杆菌ROSSET,经IPTG诱导表达蛋白,并以亲和层析的方法进行纯化,以纯化的BTBD10蛋白免疫新两兰大白兔,制备兔抗BTBD10的多克隆抗体,利用Western blot方法分析鉴定.结果 经双酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的BTBD10读码框.SDS-PAGE电泳分析显示IPTG诱导后表达约85kU的融合蛋白,与预期结果相符.将纯化的融合蛋白免疫家兔,获得兔抗BTBD10多克隆抗体血清,Western blot结果显示该抗体特异性好,效价高,目的条带位于56kU处.结论 成功构建人BTBD10原核表达载体,并获得了高纯度BTBD10重组蛋白及兔抗BTBD10多克隆抗体.     

S100A16基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的:构建S100A16原核表达载体,制备S100A16蛋白多克隆抗体并初步鉴定?方法:RT-PCR扩增得到小鼠肝脏组织的S100A16基因,将此片段克隆到带有His标签的原核表达载体pET-28a多克隆位点,并转化大肠杆菌BL21(DE3)?IPTG诱导融合蛋白表达,以亲和层析的方法纯化His-S100A16融合蛋白?纯化蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定后,免疫新西兰白兔制备抗血清?分别采用ELISA和Western blot方法检测抗体效价和特异性?结果:经双酶切和核酸序列分析证实成功构建pET-28a-S100A16原核表达质粒?考马斯亮兰染色结果证实IPTG可有效诱导融合蛋白表达?用纯化融合蛋白免疫新西兰白兔得到的S100A16抗体血清,经ELISA和Western blot检测结果显示该抗体效价高,特异性好?结论:构建带有His标签的S100A16原核表达载体,并获得高纯度His-S100A16融合蛋白及其多克隆抗体,为进一步研究S100A16生物学功能奠定基础?     

人L-选择素的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：构建人L-选择素原核表达载体,表达并纯化人L-选择素重组蛋白,制备兔抗人L-选择素多克隆抗体。方法：利用人L-选择素cDNA的N末端胞外结构区153个氨基酸的开放阅读框架(ORF),通过PCR方法扩增出人L-选择素目的片段。将扩增的基因插入表达载体pQE40的BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点之间,再经转化使其在大肠杆菌M15中表达,产生含6-His-tag的融合蛋白。融合蛋白经Ni亲合层析柱纯化和SDS-PAGE分析后,用以免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。最后经Western blotting检测和斑点杂交（DIBA）进行抗体效价测定。结果：酶切鉴定和DNA测序显示,pQE40-L-选择素重组表达载体含有人L-选择素N末端结构区153个氨基酸的cDNA序列;通过在大肠杆菌M15中的表达和纯化分析,获得了蛋白含量为600 mg·L^-1的人L-选择素蛋白;通过免疫新西兰白兔和抗体效价测定,得到抗血清效价达1∶1 000的多克隆抗体。结论：人L-选择素蛋白可在M15大肠杆菌中高效表达,其多克隆抗体效价较高。     

人sCR1克隆、真核和原核表达纯化及其多克隆抗体制备

的：原核表达人sCR1分子胞外区及其多克隆抗体制备。方法：提取人总RNA进行RT—PCR扩增合成cDNA,以cDNA为模板,构建重组表达质粒pET28a—sCR1。转化大肠杆菌中,用IPTG诱导表达重组人sCR1融合蛋白,将其作为免疫原制备兔多抗。采用ELISA法检测抗体效价,经免疫亲和层析法纯化后,进行SDS—PAGE鉴定分析。结果：在原核细胞巾高效表达人sCR1融合蛋白,经纯化复性后作为免疫原,免疫家兔,获得了高效价及特异性的兔抗人sCR1多克隆抗体,可特异地识别人sCR1蛋白。结论：纯化复性后的sCRI融合蛋白作为抗原免疫家兔,有较好的抗原性和免疫原性,成功地制备出兔抗人sCR1多克隆抗体,为进一步大量表达纯化人sCR1融合蛋白与临床免疫学检测方法的建立,也为深入研究sCR1生物学功能奠定了基础。     

人睾丸特异表达基因PIAS-NY 原核表达 和多克隆抗体的制备

目的 构建PIAS-NY-pET30a 原核表达载体,并诱导其成功表达,经纯化后获得高浓度的可溶性融 合蛋白His-PIAS-NY,免疫小鼠获得鼠源性PIAS-NY 多克隆抗体。方法 以人精原cDNA 文库为模板,通过 聚合酶链反应（PCR）扩增PIAS-NY 开放阅读框,克隆到pET30a 表达载体中,酶切、PCR 鉴定构建重组质粒。 测序完全正确后将质粒PIAS-NY-pET30a 转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行大量扩增,异丙基-β-D- 硫 代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。超声、离心、His-Ni 柱亲和层析纯化包涵体蛋白,依次经过不同浓度尿素进 行蛋白质复性,获得高浓度的可溶性His-PIAS-NY 融合蛋白。分6 次BalB/C 小鼠腹腔注射乳化纯化蛋白。 2 个月后小鼠眼球取血,收集血清。结果 成功构建原核表达质粒PIAS-NY-pET30a ;利用终浓度1 mmol/L IPTG 37℃诱导4 h,大肠杆菌BL21 大量表达融合蛋白His-PIAS-NY,并以包涵体形式存在于菌体中;尿素 变性后His-Ni 柱纯化融合蛋白,复性后获得高浓度的可溶性蛋白His-PIAS-NY ;6 次免疫后收获存活小鼠 抗血清;酶联免疫吸附测定（ELISA）抗血清滴度达到1 ∶ 100 000 ;免疫印迹和免疫共沉淀证实PIAS-NY 抗血清能特异性识别293T 细胞和GC2 细胞中PIAS-NY 蛋白。结论 成功获得PIAS-NY 多克隆抗体,而且 具有高反应性和高特异性,PIAS-NY 在GC2 细胞和293T 细胞中表达,并且能够与RUVBL2 蛋白发生相互作用。     

转录因子Blimp-1的原核表达、纯化及抗体制备

目的获得B limp-1纯化蛋白,制备多克隆抗体,为研究浆细胞发育的调控奠定基础。方法采用PCR方法从B limp-1质粒中克隆B limp-1编码前350个氨基酸的基因片段,构建B limp-1与6个H is的融合蛋白原核表达质粒,进行原核表达与蛋白纯化后,免疫动物,制备B limp-1多抗。采用ELISA方法检测其效价,W estern检验抗体特异性及在骨髓瘤细胞株中的表达。结果构建了表达B limp-1前350个氨基酸的原核表达质粒PQE-B limp-1,经过大肠杆菌表达、镍亲和层析柱纯化,得到分子量约46×103的融合蛋白,免疫家兔后得到多抗血清。ELISA显示抗体效价达1/20 000。W esternb lot结果显示此多克隆抗体与B limp-1蛋白特异性结合,并在骨髓瘤细胞中表达。结论本研究获得B limp-1纯化蛋白,制备了B limp-1多克隆抗体,为进一步研究B limp-1的作用机制及与血液疾病间的关系奠定了基础。