不可分型流感嗜血杆菌对气管黏膜上皮细胞的作用

目的:探讨不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)与气液界面无血清培养原代兔气管黏膜上皮细胞的相互作用.方法:利用低温酶消化法分离兔气管黏膜上皮细胞,无血清培养液及胶原覆盖膜形成的气液界面培养,使上皮细胞分化成假复层黏膜纤毛上皮细胞,然后加入NTHi感染上皮细胞,通过扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)观察其形态结构变化.结果:NTHi感染24 h后,SEM示气管黏膜上皮细胞表面结构破坏,90%细胞凋亡或死亡,纤毛倒伏、断裂,细菌与非纤毛上皮细胞连接;TEM示细菌黏附在细胞表面,细胞表面有较多微绒毛,伴微绒毛延伸或伪足包绕细菌,将其吞噬胞内.结论:NTHi黏附在上皮细胞表面,上皮细胞通过伪足形成和微绒毛延伸包绕细菌,将细菌吞噬在胞内;NTHi对上皮细胞有毒性作用,致细胞变性坏死或凋亡.     

不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白的研究进展

不可分型流感嗜血杆菌(nontypeable Haemophilus influenzae,NTHi)是一种定植在人类鼻咽部常见的条件致病菌,常引起继发性感染,如支气管炎、鼻窦炎、儿童中耳炎和成人慢性阻塞性肺疾病急性加重等。研究发现该菌细胞壁外膜上表达多种具有免疫原性和抗原性的蛋白,其对该菌在宿主体内的定植、入侵和生存必不可少,有些蛋白还与该菌的耐药性和宿主免疫的清除机制有关。因此,研究外膜蛋白有利于开发有效的疫苗和抗感染药物来预防及治疗NTHi引起的感染,下面从蛋白的结构、功能及应用等方面对几种外膜蛋白作一综述。     

不可分型流感嗜血杆菌重组Hap蛋白的表达及其生物学活性分析

目的 在原核系统中表达并纯化不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)的重要粘附因子Hap蛋白,并对其免疫原性和粘附活性进行初步研究.方法 IPTG诱导重组质粒pET32a(+)-Hap在E.coli BL21中高效表达,Ni2+亲和层析柱纯化表达产物.用纯化的Hap重组蛋白进行体外竞争黏附实验,SEM观察及菌落形成单位计数法分析该重组蛋白的黏附活性.纯化蛋白与黏膜免疫佐剂CT-B联合鼻腔免疫BALB/C小鼠,ELISA检测小鼠抗Hap的IgA及IgG抗体水平.结果 纯化产物的SDS-PAGE分析显示获得单一的目的 蛋白条带,Gel analysis软件分析蛋白纯度可达85%,纯化产物超滤浓缩后,测得其蛋白浓度为3.2 g/L.体外竞争黏附实验观察到Hap重组蛋白的加入可明显抑制NTHi对胞外基质的黏附,且细菌黏附量的减少与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01).该重组蛋白与免疫佐剂CT-B联合免疫小鼠.可刺激机体产生较高水平的IgG或IgA抗体,与重组抗原单独免疫组相比,差异具有显著性(P<0.05).结论 Hap蛋白在原核系统中获得较高浓度和纯度的表达,纯化Hap重组蛋白具有良好的免疫原性和粘附活性.     

不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6基因真核质粒的构建及表达

目的:构建不可分型流感嗜血杆菌(nontypeableHaemophilus influenzae,NTHi)外膜蛋白P6(outermembrane protein P6,P6)真核表达的重组质粒,并在HeLa细胞中表达,为核酸疫苗的开发奠定基础。方法:以NTHi基因组为模板,扩增编码P6蛋白的基因片段,酶切、纯化P6基因与真核载体pcDNA3.1/HisA后进行连接,之后转化并筛选含有目的基因的重组质粒pcDNA3.1/HisA-P6;将重组子转染至HeLa细胞,荧光蛋白法检测其表达产物。结果:经质粒PCR、酶切、测序证实插入的基因片段为NTHi-P6蛋白编码基因;荧光显微镜下显示,该重组质粒能够在HeLa细胞中表达目的蛋白。结论:成功地构建了真核重组质粒pcD-NA3.1/HisA-P6,并在HeLa细胞中表达。     

不可分型流感嗜血杆菌脂肽P4诱导气道上皮细胞分泌黏蛋白的机制

目的 研究不可分型流感嗜血杆菌脂肽P4诱导气道上皮细胞分泌黏蛋白MUC5AC的作用及机制。方法培养人气道上皮细胞NCI-H292,用不同浓度的P4孵育细胞,检测粘蛋白5AC(MUC5AC)的分泌及mRNA表达、ROS的产生及肿瘤坏死因子α转化酶(TACE)的活性;分析Duox1 p47^phox和P67^phox亚基亚细胞转位和表皮生长因子受体(EGFR)的磷酸化。结果0、30、50和100 ng/mL P4作用NCI-H292细胞24 h后,可诱导其分泌MUC5AC并表达其mRNA,并促进p47^phox和P67^phox亚基转位至细胞膜、增高细胞内ROS的含量,同时可上调TACE的酶活性及诱导EGFR磷酸化。NADPH氧化酶抑制剂可抑制ROS产生;而ROS抑制剂处理则可降低TACE的酶活性;沉默TACE表达后可抑制EGFR磷酸化,而EGFR抑制剂处理可降低MUC5AC分泌。结论P4经Duox1/ROS/TACE/ EGFR诱导人NCI-H292细胞分泌MUC5AC。     

光动力学疗法影响人工菌斑生物膜形成的扫描电镜观察

目的 研究甲苯胺蓝介导的光动力学疗法对体外人工菌斑生物膜形成的影响,探讨光动力学疗法控制菌斑和防治龋病的可能机制. 方法 体外环境下,4种口腔常见致龋菌在牙釉质表面形成多细菌混合性菌斑生物膜,用光动力学疗法处理实验组菌斑生物膜,光敏剂浓度为0.1 mg/ml、光强为94.5 J/cm2;分别在生物膜形成的第1、3、7天用扫描电镜观察光动力学疗法处理对生物膜形成的影响.结果 对照组第1天可见到以链球菌为主的细菌黏附于获得性膜上;第3天各种细菌数量明显增多,形成谷穗状结构;至第7天时,生物膜形成复杂的三维立体结构,细菌表面及细菌之间可见大量基质和不定形胶状物.在第1、3、7天,光动力学疗法处理后牙釉质表面黏附的细菌显著减少,菌斑生物膜形成受阻.结论 光动力学疗法对菌斑生物膜的形成有抑制作用.     

不可分型流感嗜血杆菌诱导A549细胞分泌和表达前炎症细胞因子及机制研究

目的 探讨不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)作用于呼吸道上皮细胞株(A549),表达前炎症细胞因子的变化及其干预措施.方法 用NTHi、NTHi 红霉素(10 mg/L)、NTHi 庆大霉素(100 mg/L)、NTHi 地塞米松(100 μmol/L)分别感染A549细胞,用核因子κB(NF-κB)抑制剂二硫氨基甲酸吡啶(PDTC,200 μmol/L)预处理NTHi感染的A549细胞,24 h后观察细胞的形态学改变,并检测上清液中白细胞介素8(IL-8)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平和细胞间黏附分子1(ICAM-1)的表达.结果 NTHi作用A549细胞24 h后,引起部分上皮细胞变形、死亡.NTHi能显著诱导A549细胞株分泌IL-8、表达ICAM-1,红霉素能够抑制其诱导作用;庆大霉素具有杀灭NTHi作用,但不能抑制IL-8分泌和ICAM-1表达;地塞米松能抑制A549分泌IL-8,降低ICAM-1的表达,但不能杀灭NTHi.PDTC(200 μmol/L)能阻断A549细胞在NTHi作用后IL-8的高表达.TNF-α在各组培养上清中均不能检测到.结论 NTHi显著诱导人肺上皮细胞系表达前炎症因子,该作用可能通过NF-κB通路.红霉素在杀灭NTHi的同时还具有抗炎作用.     

屎肠球菌临床分离株生物膜形成与毒力基因及ST分型之间的关系

目的 研究临床分离屎肠球菌株生物膜形成与ST分型和毒力基因之间的关系。方法 收集深圳市南山医院2011—2017年临床分离的不重复屎肠球菌共122株,采用结晶紫染色法检测细菌生物膜形成能力,对分离株进行多位点序列分型(MLST)分析, PCR方法检测屎肠球菌临床株毒力基因表面蛋白(esp )、透明质酸酶(hyl )、表面聚集蛋白(asa1 )、明胶酶(gelE )、溶细胞素(cylA )等的分布。结果 122株屎肠球菌生物膜形成阳性率为49.2%,其生物膜形成能力主要表现为弱阳性。屎肠球菌毒力基因检测提示esp 和hyl 检出率分别为39.3%(48/122)和15.6%(19/122),所有菌株未检测到asa1 、gelE 、cylA ;其中esp 阳性与生物膜形成能力相关(P <0.05),而hyl 阳性与生物膜形成能力无相关性(P >0.05)。MLST分型提示屎肠球菌临床株主要为ST78及ST18型,分别为26株及18株,其中ST78与ST18之间生物膜形成能力差异无统计学意义(P >0.05),esp 更常见于ST78分离株。结论 临床分离屎肠球菌生物膜形成能力较弱,其毒力基因esp 阳性更容易形成生物膜,而hyl 与生物膜形成能力无明显相关性,ST78与ST18之间生物膜形成能力无明显差异,esp 更常见于ST78分离株。     

盐酸氨溴索对体外白色假丝酵母菌成熟生物膜的抑制作用及其形态学的影响

目的研究盐酸氨溴索对体外白色假丝酵母菌(Candida albicans)成熟生物膜(biofilm,BF)的影响。方法用微孔板法建立体外白色假丝酵母菌ATCC 90028 BF模型;采用甲基四氮盐(the abated tetrazolium salt,XTT)减低法定量评价盐酸氨溴索对白色假丝酵母菌成熟BF的抑制作用;银染后,倒置显微镜下观察该药对白色假丝酵母菌成熟BF的形态学影响。结果在96孔微量细胞培养板上成功建立白色假丝酵母菌BF模型;1.25、2.5、5、7.5 mg/ml的盐酸氨溴索作用白色假丝酵母菌成熟BF 12 h后,XTT减低法D(450)值分别为(0.63±0.05)、(0.52±0.08)、(0.31±0.05)和(0.11±0.03),分别与空白对照组(0.71±0.07)比较,差异有显著性(P<0.05);0.625 mg/ml的盐酸氨溴索作用白色假丝酵母菌成熟BF后,D(450)值为(0.67±0.04),与空白对照组比较,差异无显著性(P>0.05);不同浓度的盐酸氨溴索作用白色假丝酵母菌成熟BF,组间比较,均有显著性差异(P<0.05)。结论盐酸氨溴索对体外白色假丝酵母菌成熟...     

Activity of ciprofloxacin and azithromycin on biofilms produced in vitro by Haemophilus influenzae

Background It is recognized that Haemophilus influenzae isolated from patients with otitis media forms biofilms both in vitro and in vivo, suggesting that biofilm formation in vivo might play an important role in the pathogenesis and chronicity of otitis media, but the effect of antibiotics on biofilm has not been well studied. We investigated the impact of ciprofloxacin and azithromycin on bacterial biofilms formed by Haemophilus influenzae in vitro in this study. Methods Eleven strains of Haemophilus influenzae were isolated from sputum specimens collected from patients with acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary diseases. Formation of bacterial biofUm was examined by crystal violet assay and a scanning electron microscope. Alterations of biofilms were measured under varying concentrations of azithromycin and ciprofloxacin. Results Striking differences were observed among strains with regard to the ability to form biofilm. Typical membrane-like structure formed by bacterial cells and extracellular matrix was detected. Initial biofilm synthesis was inhibited by azithromycin and ciprofloxacin at concentrations higher than two-fold minimal inhibitory concentration. Disruption of mature biofilms could be achieved at relatively higher concentration, and ciprofloxacin displayed more powerful activity. Conclusions Haemophilus influenzae is capable of forming biofilm in vitro. Sufficient dosage might control early formation of biofilms. Ciprofloxacin exerts better effects on breakdown of biofilm than azithromycin at conventional concentration in clinics.     

广东省中山市406株流感嗜血杆菌的耐药性及基因分型

目的 了解中山市流感嗜血杆菌的临床分布并对其耐药性进行分析,为更好地指导临床用药提供依据。方法 选取中山大学附属中山医院2014—2017年从临床标本中分离的406株流感嗜血杆菌,用K-B法进行药敏试验,头孢硝噻吩纸片法进行β-内酰胺酶检测,用PCR 方法对分离菌株进行ftsI 基因检测。结果 在406株流感嗜血杆菌中,来源痰液标本363株,占89.4%,咽喉分泌物31株,占7.6%。科室分布中,以呼吸内科和普通儿科比例最高,呼吸内科占16.3%,普通儿科占17.2%。年龄10岁以下占22.4%,51岁以上占57.9%。性别分布上男性多于女性占68.9%。氨苄西林的耐药率逐年增高,氨苄西林/舒巴坦的耐药率远低于氨苄西林,环丙沙星、阿奇霉素、头孢泊肟、头孢曲松、左旋氧氟沙星、美洛培南未发现耐药株。在地域分布上氨苄西林的耐药率有着明显的地域差异。β-内酰胺酶阴性氨苄西林耐药的菌株（β-lactamase nonproducing-ampicillin-resistant, BLNAR）在这四年间检出率2015年最高,达21.3%,2017年降为14.4%。β-内酰胺酶阴性氨苄西林耐药的流感嗜血杆菌均检出ftsI 基因突变以Ⅲ型为主。结论 流感嗜血杆菌对氨苄西林的耐药率逐年上升,环丙沙星、阿奇霉素、头孢泊肟、头孢曲松、左旋氧氟沙星、美洛培南未发现耐药株,临床应该根据药敏结果合理使用抗生素。     

抗菌药物管理初期广州地区儿童肺炎链球菌及流感嗜血杆菌耐药性变迁

目的：为了解广州地区抗菌药物管理初期近10年下呼吸道住院病人分离的肺炎链球菌及流感嗜血杆菌耐药性的变迁。方法将3个不同时期[2003年6月—2004年12月(第1期)、2006年2月—2007年2月(第2期)、2011年1月—2012年6月(第3期)],下呼吸道感染病人痰标本进行细菌培养,用Etest检测及K-B法纸片对其中分离出的肺炎链球菌和流感嗜血杆菌进行常用抗菌药物的耐药性情况检测,分析比较3个时期的检测结果。结果3个时期肺炎链球菌培养结果分别为第1期172株,第2期79株,第3期391株;耐药性变化趋势中,青霉素、头孢呋辛、红霉素、克林霉素耐药性呈现上升趋势,且3个时期耐药性差异有统计学意义(均为P<0.001)。3个时期流感嗜血杆菌培养结果分别为第1期484株,第2期140株,第3期524株;耐药性变化趋势中,氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢克洛、头孢呋辛、阿奇霉素耐药性呈现上升趋势,且3个时期耐药差异有统计学意义(均为P<0.001);四环素、头孢曲松耐药性呈现下降趋势,且3个时期耐药差异有统计学意义(均为P<0.001)。结论近10年中,肺炎链球菌对儿科常用抗菌药物包括青霉素、头孢呋辛、红霉素、克林霉素的耐药情况仍在上升趋势中。流感嗜血杆菌对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢克洛、头孢呋辛、阿奇霉素的耐药情况也是逐年加重;对头孢曲松的耐药性呈下降趋势。     

扫描电镜观察双氢青蒿素对大鼠体内卡氏肺孢子虫表面形态的影响

目的研究双氢青蒿素对卡氏肺孢子虫表面结构的影响.方法 Wistar大鼠皮下注射地塞米松磷酸钠7周诱导建立卡氏肺孢子虫肺炎动物模型,用双氢青蒿素治疗大鼠,并用扫描电镜观察大鼠肺组织卡氏肺孢子虫表面结构的变化.结果扫描电镜下,卡氏肺孢子虫表面有密集的类似微绒毛的结构,呈念珠状或小簇状,通过其丝状伪足可与Ⅰ型肺泡上皮细胞或虫体间相粘连.经双氢青蒿素治疗后,卡氏肺孢子虫表面微绒毛脱落,残存微绒毛变形,虫体表面出现凹陷,表膜出现较大较深的缺损.结论双氢青蒿素可破坏卡氏肺孢子虫表膜.     

小鼠粒-单系祖细胞体外培养的扫描电镜观察

用液体法培养了小鼠的GFU—GM,并对培养不同时间的集落细胞进行扫描电镜观察。CFU—GM在分化成熟过程中有如下特点:(1)粒系细胞集落细胞表面由粗糙变光滑,主要变化在其表面的微绒毛。(2)单系细胞集落在培养早期成团,细胞表面光滑,4天后变粗糙,形状由规则变成多形性,由大小均匀至大小不一;培养中期有伪足形成.(3)同一集落位于中心的细胞较周边细胞幼稚.同时还发现粒细胞集落基底多存在一个贴壁细胞.     

大鼠第三、四脑室接触脑脊液神经元的扫描电镜观察

目的：研究大鼠第三脑室壁和第四脑室底接触脑脊液神经元的形态及作用。方法：用扫描电镜观察接触脑脊液神经元的形态。结果：在全部材料中的第三和第四脑室都观察到了接触脑脊液神经元呈球形膨大的树突终末和轴突终末，在少数材料中还观察到了胞体。树突终末及胞体的表面有少量成簇的纤毛，轴突表面光滑无纤毛。结论：在大鼠第三脑室的室旁器等室周器官以及第四脑室的最后区及蓝斑区等处证实有接触脑脊液神经元的存在，这些神经元可能通过脑脊液途径参与下丘脑—垂体系的神经体液调节或睡眠机制的调节。     

正常豚鼠中耳粘膜扫描电镜观察

目的观察正常豚鼠中耳粘膜的形态学特征。方法应用扫描电镜对４只（８侧）豚鼠中耳腔粘膜进行多部位观察。 结果观察发现豚鼠中耳粘膜表面有地毯样粘液层。中耳粘膜的上皮细胞可分为４种类型,即纤毛细胞、无分泌颗粒无 纤毛细胞、有分泌颗粒无纤毛细胞和扁平细胞,在中耳腔的不同部位各种细胞的多少不均。结论中耳粘膜有真性呼吸 上皮的特性。     

扫描电镜观察高功率微波辐照后大鼠小肠的形态学改变

目的：利用扫描电镜观察高功率微波（HPM）辐照后大鼠小肠形态结构的变化．方法：雄性SD大鼠35只随机分为对照组和试验组,在源距4．5m,场强100kV／m,总脉冲数40万次微波辐射后3,24,72h及7d活杀大鼠,取小肠组织;甲醛固定制备光镜标本;30mL／L戊二醛固定,进行常规扫描电镜标本制备．结果：扫描电镜观察对照组和HPM辐照后3h小肠形态基本正常,小肠绒毛排列整齐．辐照后24～72h,主要以肠黏膜破坏、肠上皮细胞水肿和分泌物增多为主．辐照后7d,分泌物减少,肠绒毛水肿减轻．结论：说明HPM辐照后扫描电镜观察大鼠小肠随作用时间的不同有不同程度的损伤．     

吡喹酮对肝片形吸虫表层损伤作用的扫描电镜观察

用扫描电镜观察了吡喹酮在体外对肝片形吸虫皮层的损伤作用。吡喹酮浓度为1、10、100μg/ml,作用时间为0.5、2、6h,对肝片形吸虫皮层表面都有损害。电镜下可见肝片形吸虫口腹吸盘肿胀,体棘变形脱落,表面糜烂剥落,随药物剂量加大及作用时间的延长,虫体皮层损害加重,范围增大。