融合蛋白TAT-EGFP的表达及其对膀胱癌细胞和组织的穿膜活性鉴定

目的构建穿膜肽-增强型绿色荧光蛋白(TAT-EGFP)融合蛋白的原核表达系统,研究该融合蛋白在体外对人膀胱癌细胞(EJ细胞)和膀胱癌组织的跨膜作用。方法以pEGFP-1载体为模板,设计包含TAT序列的引物,用PCR技术扩增TAT-EGFP基因,扩增产物插入载体pET30a,构建成重组质粒pET30a-TAT-EGFP。将重组质粒转入大肠杆菌BL21中,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达。表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,Ni-NTA Superflow Cartvidge亲和层析柱纯化融合蛋白。将融合蛋白TAT-EGFP加入培养的EJ细胞和膀胱癌组织,荧光显微镜观察TAT-EGFP融合蛋白进入EJ细胞和膀胱癌组织的情况。结果成功构建了高表达pET30a-TAT-EGFP重组子,纯化了分子质量约为31 kD的融合蛋白TAT-EGFP。不同浓度的TAT-EGFP融合蛋白对膀胱癌细胞均无明显毒性。TAT-EGFP融合蛋白具有穿过膀胱癌细胞和膀胱癌组织的作用。结论通过对TAT-EGFP融合蛋白表达纯化及活性分析,证实TAT的蛋白转导作用,为肽类及生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础。     

人Oct4与细胞穿膜肽融合蛋白的表达

目的通过原核表达获得人Oct4(hOct4)与细胞穿膜肽融合蛋白,优化其表达方法并观察其穿膜效果。方法通过基因工程手段构建了pET原核表达载体,利用BL21(DE3)和Rosetta2(DE3)蛋白表达菌表达蛋白。Ni亲和纯化方法纯化蛋白,蛋白质印迹分析检测融合蛋白组成。将融合蛋白用罗丹明染色后加入人正常皮肤成纤维细胞株BJ观察其穿膜进入细胞情况。结果构建了pET21a(+)-hOct4-11R-His和pET21a(+)-EGFP-11R-His表达载体,转入大肠杆菌中后诱导获得了hOct4-11R-His和EGFP-11R-His融合蛋白,经蛋白质印迹分析检测表明融合蛋白正确。经BJ细胞测试,观察到融合蛋白进入细胞中。结论成功获得了hOct4-11R-His和EGFP-11R-His融合蛋白,且融合蛋白能够高效进入BJ细胞并聚集于细胞核周围。     

重组人酸性成纤维细胞生长因子-穿膜肽融合蛋白的克隆表达、纯化及活性检测

目的：高效表达并纯化具有生物学活性的重组人酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)-穿膜肽(tat)融合蛋白,为进一步开发基因工程药物提供实验依据。方法:通过双酶切方法,从质粒pMD18-T-aFGF-tat中获得aFGF-tat基因片段,并将aFGF-tat融合基因与原核表达载体pET3c连接后转化到大肠杆菌BL21（DE3）宿主细胞中,通过IPTG诱导获得可溶性表达,将融合蛋白经CM离子交换层析与肝素亲和层析纯化,MTT法检测aFGF-tat融合蛋白对NIH 3T3细的促增殖作用。结果:经酶切和基因测序证实获得的重组人aFGF-tat基因序列与GenBank报道的完全一致,构建的pET3c-aFGF-tat表达载体在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达aFGF-tat融合蛋白,蛋白表达量在15%以上,经SDS-PAGE证实其相对分子质量与理论预期值相符,经CM离子交换层析与肝素亲和层析纯化后蛋白纯度高于95%,Western blotting分析表达产物与人aFGF多克隆抗体具有特异结合能力,并能够促进NIH 3T3细胞增殖。结论:成功表达重组人aFGF-tat融合蛋白工程菌,获得aFGF-tat纯蛋白,并证实aFGF-tat融合蛋白具有促细胞增殖活性。     

PTD-Calbindin D28K融合蛋白的表达、纯化及其穿膜功能的鉴定

目的 构建融合蛋白PTD－Calbindin D28K(CaBP28)的表达质粒，并进行诱导表达、纯化，在体外初步鉴定其跨膜转运功能。方法提取大鼠脑组织总RNA，反转录后用聚合酶链反应(PCR)法扩增编码CaBP28的全长cDNA序列，重组入pET-32a及含有PTD的pTrans Vector表达载体中，测序鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3)，构建重组体的表达菌株。IPTG诱导表达后，以NTA-Ni亲和层析柱进行分离纯化，SDS-PAGE以及Western blot鉴定。纯化的CaBP28及PTD-CaBP28用FITC标记，分别以一定的浓度孵育体外培养的cos7细胞，最后荧光显微镜下观察两者在细胞中的分布情况，并用流式细胞仪(FCM)做定量分析。结果成功地构建了含有及不含有PTD的CaBP28表达载体，插入片断。783bp，表达产物相对分子质量分别约30000、50000，经Wetern blot鉴定，与抗CaBPD28K抗体均有特异性反应。孵育培养的cos7细胞后，CaBP28-FITC仅少量吸附于细胞膜表面，而PTD-CaBP28-FITC则分布于胞质内；FCM定量分析发现，细胞荧光强度随着目的蛋白的孵育浓度或孵育时间增加而增加，并且孵育时间为1h时荧光达到最强。结论重组PTD-CaBP28具有良好的细胞穿膜功能。     

MPP—hPER1融合蛋白穿膜的实验研究

本课题研究了MPP－hPER1融合蛋白对多种细胞的穿膜性。在分析MPPs家族分子组成特点的基础上，合成了PLNG活性肽。并且应用重组技术构建了MPP－hPER1融合蛋白表达体系，通过细胞培养、转染、免疫荧光染色等手段，观察了不同作用时间、不同温度、不同细胞系的条件下，PLNG及MPP－hPER1融合蛋白对细胞膜的穿透能力。结果显示：PLNG及MPP－hPER1融合蛋白穿透细胞膜是非能量依赖型、非时间依赖型和非细胞种系依赖型。提示生物体中有一类特殊的生物大分子，按照非经典途径进入细胞发挥生物学活性作用。实验结果提示，PLNG可以作为一种特殊的生物分子载体，介导功能分子进入细胞，在基因治疗及细胞治疗领域发挥作用。     

MPP-hPER1融合蛋白穿膜的实验研究

本课题研究了MPP-hPER1融合蛋白对多种细胞的穿膜性.在分析MPPs家族分子组成特点的基础上,合成了PLNG活性肽.并且应用重组技术构建了MPP-hPER1融合蛋白表达体系,通过细胞培养、转染、免疫荧光染色等手段,观察了不同作用时间、不同温度、不同细胞系的条件下,PLNG及MPP-hPER1融合蛋白对细胞膜的穿透能力.结果显示PLNG及MPP-hPER1融合蛋白穿透细胞膜是非能量依赖型、非时间依赖型和非细胞种系依赖型.提示生物体中有一类特殊的生物大分子,按照非经典途径进入细胞发挥生物学活性作用.实验结果提示,PLNG可以作为一种特殊的生物分子载体,介导功能分子进入细胞,在基因治疗及细胞治疗领域发挥作用.     

穿膜肽TAT-p38αG融合基因的构建、表达及穿膜特性的鉴定

目的 构建穿膜肽TAT-p38αG融合基因,进行原核表达及穿膜特性鉴定.方法 提取人EVC304细胞总RNA,巢式PCR扩增p38αG基因片段,T-A克隆,测序证实片段无误后,将p38αG基因片段亚克隆入原核表达载体pTAT-HA,获得pTAT-p38αG融合基因表达载体.将表达载体转化大肠杆菌,IPTG诱导表达获得TAT-p38αG融合蛋白,并行Ni-NTA柱过柱和超滤纯化,抗His抗体免疫印迹法鉴定.采用荧光素FITC体外标记TAT-p38αG融合蛋白,与EVC304细胞共培养,荧光显微镜下观察其穿膜特性.结果 成功构建了融合基因原核表达载体pTAT-p38αG,并表达出大小约30×103的蛋白产物,与融合蛋白TAT-p38αG理论计算值相符.细胞实验结果显示,TAT-p38αG能呈浓度依赖性方式转导进入EVC304细胞.结论 TAT-p38αG融合蛋白具有良好的穿膜特性,研究为下一步鉴定TAT-p38αG融合蛋白对p38α激酶的抑制作用奠定了良好的实验基础.     

TAT-N24穿膜融合多肽的表达与鉴定

目的 表达并纯化TAT-N24穿膜融合多肽,初步探讨其生物学活性.方法 构建pTAT-HA-N24原核表达载体,在BL21大肠埃希菌中表达并纯化TAT-N24融合多肽,利用SDS凝胶电泳检测纯化蛋白的纯度,利用免疫细胞化学和流式细胞术检测TAT-N24融合蛋白的穿膜能力和生物学活性.结果 在原核表达系统中成功构建并表达纯化了TAT-N24穿膜融合多肽,其在6 mol/L尿素和DMSO中均具有较好的溶解性,纯化的融合多肽经SDS凝胶电泳分析未见明显杂蛋白混入,利用免疫细胞化学染色可见TAT-N24处理结肠HT29细胞12 h后90%以上的细胞中可检测到TAT-N24,流式细胞术检测细胞周期可见TAT-N24能够有效地诱导细胞周期阻滞,抑制结肠癌细胞生长.结论 TAT-N24具有高效的穿膜能力,并能有效抑制结肠癌细胞增殖,可望开发成为有效的肿瘤分子治疗药物.     

γ-干扰素诱导蛋白-10融合蛋白的表达纯化及其生物学活性测定

目的 表达大鼠γ-干扰素诱导蛋白-10 (IP-10) 融合蛋白,并测定其生物学活性.方法 从大鼠脾细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法得到IP-10cDNA.双酶切将其插入pET-32 (a) +载体中.重组质粒pET-32a (+) -IP10经测序证实.将pET-32a (+) -IP10转化大肠杆菌BL21 (DE3) 中进行表达,目的蛋白经镍离子亲和层析柱纯化.微室跨膜迁移实验测定其生物学活性.结果 测序表明,所构建的重组质粒pET-32a (+) -IP10序列完全正确,诱导表达的蛋白的相对分子量同预期分子量相同,微室跨膜迁移实验测定出IP-10融合蛋白对激活的T淋巴细胞具有良好的趋化活性.结论 成功在大肠杆菌中表达了IP-10融合蛋白,并具有生物学活性.     

Tat-p53融合蛋白的表达、纯化及其转导活性

目的：原核表达野生型p53与Tat PTD（protein transduction domain）的融合蛋白，检测TatPTD介导p53进入肝细胞的效率。方法：利用RT-PCR方法从A549细胞系中分离野生型p53基因，将该基因分别克隆入pTAT-HA和pET-32a原核表达载体，在大肠杆菌BL21（DE3）LysS内诱导表达并进行纯化，以纯化的p53蛋白经腹腔免疫BALB/c小鼠，制备高效价的抗血清，将Tat-p53融合蛋白加入HepG2细胞培养上清，利用间接免疫荧光法检测Tat-p53融合蛋白导入HepG2细胞的效率。结果：成功地构建了含有野生型p53基因的原核表达载体，表达纯化了Tat-p53融合蛋白及p53蛋白，制备p53特异的抗血清，证实Tat-p53可以高效的转入HepG2细胞内。结论：Tat-p53融合蛋白的表达纯化及活性分析，为应用Tat-p53融合蛋白治疗肝癌的实验研究奠定了基础。     

PEP-1-EGFP融合蛋白的表达和纯化及其转导入人脐静脉内皮细胞

目的 表达并纯化融合蛋白PEP—1-EGFP以对其穿透细胞膜的能力进行研究。方法 用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b—pep—1—EGFP，在大肠杆菌Ecoli BL21（DE3）中表达融合蛋白PEP—1—EGFP并进行Ni^2＋-树脂柱亲和层析纯化以进行融合蛋白穿透人脐静脉内皮细胞的实验。结果 经测序证实成功构建了表达型载体pET15b—pep—1—EGFP,PEP—1—EGFP融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中得到高效表达，纯化后的蛋白浓度为6．18mg／ml，蛋白产量为14．15mg／100ml菌液，SDS—PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为融合蛋白PEP—1—EGFP，细胞膜穿透实验证实PEP—1—EGFP融合蛋白能进入人脐静脉内皮细胞。结论 PEP—1—EGFP融合蛋白的表达和纯化及其穿膜能力的研究为PEP-1携带有生物活性的大分子物质进行蛋白治疗奠定了基础。     

PTD-Foxp3融合蛋白的表达、纯化及其生物学功能初步研究

目的:构建带HIV-1 TAT转录因子的穿膜序列(Protein transduction domain,PTD)的pET28a-PTD-Foxp3原核表达载体,表达纯化PTD-Foxp3融合蛋白,并研究其生物学作用.方法:利用基因重组技术构建pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中表达融合蛋白,经Ni2 分离柱纯化pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白.流式细胞术检测融合蛋白穿越细胞膜进入小鼠T淋巴细胞瘤株EL-4细胞中的能力,并通过混合淋巴细胞反应初步分析融合蛋白抑制T细胞活化增殖的生物学作用.结果:成功地构建了pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白表达载体,表达并纯化了pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白.通过流式细胞术分析证实pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白能有效地进入细胞内;同时经混合淋巴细胞反应证明该融合蛋白能明显抑制T细胞的活化增殖能力.结论:成功表达具有生物学活性的PTD-Foxp3融合蛋白,为进一步研究PTD-Foxp3融合蛋白免疫抑制功能和构建表达人PTD-Foxp3融合蛋白,最终应用于临床疾病的治疗奠定了基础.     

PTD-p53 融合蛋白的表达、纯化及其对肝癌细胞的转导活性

目的：原核表达野生型p53与PTD的融合蛋白,检测PTD介导p53进入肝癌细胞的效率。方法：利用RT-PCR方法从A549细胞系中分离野生型p53基因,将该基因分别克隆入pTATHA和pET32a原核表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）LysS内诱导表达并进行纯化。以纯化的p53蛋白经腹腔免疫BALB/c小鼠,制备高效价的抗血清。将PTD-p53融合蛋白加入HepG2细胞培养上清,利用间接免疫荧光法检测PTD-p53融合蛋白导入HepG2细胞的效率。结果：成功地构建了含有野生型p53基因的原核表达载体,表达纯化了p53融合蛋白及p53蛋白,证实PTD-p53可以高效地转入HepG2细胞。结论：PTD-p53融合蛋白的表达纯化及活性分析,为应用PTD-p53蛋白治疗肝癌的实验研究奠定了理论基础。     

BCR/ABL癌蛋白片段的表达、纯化及其抗血清的制备

目的　克隆并表达 bcr/ abl融合基因片段 ,并制备其抗血清 .方法　 PCR扩增包含蛋白融合点的 bcr/ abl癌基因片段 ,序列测定后克隆入带有 His标签的原核表达载体 p ET-16 b,转化宿主菌 BL2 1,IPTG诱导表达 ,SDS- PAGE分析表达结果 ,Ni- NTA树脂亲和纯化 ,皮下多点注射免疫小鼠 ,EL ISA确认抗血清的滴度 .结果　 PCR扩增得到大小约 5 2 3bp的目的片段 ,序列测定表明与发表序列完全一致 ;得到了一种新的癌基因 bcr/ abl片段的原核表达载体 p ET- 16 b- bcr/abl,在 BL 2 1中表达可见于 Mr 2 1× 10 3处有一蛋白新生带 ,表达的 BCR/ ABL蛋白免疫小鼠后 ,EL ESA确认抗血清的滴度 >1∶ 2 0 0 0 .结论　成功的克隆、表达了 bcr/ abl融合基因片段 ,并制备了相应的抗血清 .     

抗Her-2抗体与人β防御素Ⅱ融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定

利用小分子泛素样修饰蛋白（small ubiquitin-like modifier,SUMO）融合表达系统,在大肠杆菌Origami B（DE3）中表达人β防御素Ⅱ（human β defensin 2,HBD2）与抗人表皮生长因子受体2（Her-2）单链抗体（4D5 scFv）的融合蛋白。经20 ℃,l mmol/L IPTG诱导24 h后,获得相对分子质量约为41 kD的SUMO-HBD2-4D5融合蛋白,为可溶性表达,表达量占菌体上清总蛋白的42.2%。利用组氨酸亲和凝胶色谱（Ni-NTA sepharose）、特异性SUMO蛋白酶（SUMO protease）酶切和分子筛（Sephadex G-25）联用的方法可获得纯度大于95%的目的蛋白HBD2-4D5,其最终得率达到15 mg/L。HBD2-4D5 200μg对金黄色葡萄球菌（ATCC25923）和大肠杆菌K12D31具有较明显的杀伤作用。免疫荧光分析结果显示,HBD2-4D5蛋白能结合于Her-2高表达的人乳腺癌细胞SK-BR-3表面。本实验表达的HBD2-4D5双功能蛋白具有较好的抗菌活性和特异性结合SK-BR-3表面Her-2的能力,为日后用于靶向治疗Her-2高表达的肿瘤疾病提供研究基础。     

GST-p16融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的利用GST融合基因表达系统表达、纯化及鉴定GST-p16融合蛋白。方法以质粒pM-p16为模板,扩增出p16基因片段,将其克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-6P-1,将所构建的重组质粒pGEX-p16转化大肠杆菌B121并诱导表达,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约42kD蛋白,其分子量与GST-p16融合蛋白相符。Westernblot结果显示该蛋白能够被p16．抗体特异性识别。结论本实验在大肠杆菌表达系统中高效表达了有活性的GSTipl6融合蛋白并可用于以后的实验研究。     

一种合成多肽——PLNG自由穿膜现象初探

目的 研究人工设计合成的多肽PLNG在不同作用环境条件下的跨膜运动现象。方法 体外培养不同组织来源的鼠细胞及CHO细胞、BEL细胞,用免疫荧光观察不同浓度、不同温度、不同反应时间条件下,PLNG的穿膜能力及PLNG对不同类型的细胞（CHO细胞、BEL细胞、成年大鼠肝细胞、幼大鼠肝细胞、成年大鼠心肌细胞、幼大鼠心肌细胞、成年大鼠神经细胞、幼大鼠神经细胞）的穿膜特性。结果 PLNG在不同作用环境条件下对细胞膜都有穿透作用,且进入细胞的量近乎相同。结论 实验观察到PLNG具有广谱的穿膜能力,这种穿膜能力在一定范围内对温度、时间及PLNG浓度不敏感;而且这种穿膜能力不受组织特异性的限制。     

CTLA-4/Ig融合蛋白在COS-7中的表达、纯化及鉴定

探讨ＰＣＴＬＡ－４／Ｉｇ融合蛋白表达载体在哺乳动物细胞中的表达及表达产物的鉴定,纯化为其功能研究和临床应用奠定基础。方法将ｐＣＴＬＡ－４／Ｉｇ表达质粒转染ＣＯＳ－７细胞,双抗体夹心ＥＬＩＳＡ检测细胞培养上清中融合蛋白表达：ＰｒｏｔｅｉｎＡ亲和层析纯化,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹、＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入等进行分子量,纯度、抗原特异性及生物知性鉴定。结果在ＰＣＴＬＡ－４／Ｉｇ质粒转染后的４８ｈ的